RACK1過表達(dá)和低表達(dá)HUVEC細(xì)胞系的建立和鑒定

張 麗，賈雄飛，牛 華，馮 悅，宋玉竹，張望龍，李勝營，吳明江，毛小琴*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子病毒實驗室，云南 昆明 650500； 2.解放軍昆明總醫(yī)院 檢驗科，云南 昆明 650032；3.昆明理工大學(xué) 附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院 檢驗科， 云南 昆明 650032；4.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 自然資源藥物化學(xué)重點實驗室， 云南 昆明 650091)

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技術(shù)與方法

RACK1過表達(dá)和低表達(dá)HUVEC細(xì)胞系的建立和鑒定

張 麗1#，賈雄飛2#，牛 華3，馮 悅1，宋玉竹1，張望龍1，李勝營1，吳明江4，毛小琴3*

(1.昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子病毒實驗室，云南 昆明 650500； 2.解放軍昆明總醫(yī)院 檢驗科，云南 昆明 650032；3.昆明理工大學(xué) 附屬醫(yī)院 云南省第一人民醫(yī)院 檢驗科， 云南 昆明 650032；4.云南大學(xué) 化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 自然資源藥物化學(xué)重點實驗室， 云南 昆明 650091)

目的建立有活性的蛋白激酶C受體1(RACK1)過表達(dá)和低表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系(HUVEC)，為進(jìn)一步從分子水平研究RACK1在心律失常中的作用機(jī)制提供有效手段。方法擴(kuò)增RACK1基因的全長cDNA序列，并插入pIRES2-EGFP獲得過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RACK1；同時，設(shè)計合成3對短發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)DNA序列和一對陰性對照序列，亞克隆至pGenesil- 1得到相應(yīng)的干擾載體；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組體及相應(yīng)的空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HUVEC細(xì)胞，經(jīng)G418篩選抗性細(xì)胞克隆，qRT-PCR及Western blot鑒定RACK1 mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果RACK1真核表達(dá)載體和RNA干擾載體構(gòu)建成功。重組體經(jīng)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染HUVEC 48 h后，經(jīng)G418篩選3周得到細(xì)胞抗性克隆，qRT-PCR及Western blot結(jié)果證實了過表達(dá)載體和干擾載體能有效的增強(qiáng)和沉默HUVEC細(xì)胞中RACK1的表達(dá)。結(jié)論成功建立了RACK1過表達(dá)和低表達(dá)HUVEC細(xì)胞系。

RACK1；過表達(dá)；RNA干擾；HUVEC細(xì)胞系

有活性的蛋白激酶C受體1(receptor of activated C kinase 1，RACK1)屬于Trp-Asp 40(WD-40)重復(fù)蛋白家族，其蛋白序列與G蛋白β亞基具有高度同源性[1]。人的RACK1蛋白是由鳥嘌呤核苷酸結(jié)合蛋白βⅡ[guanine nucleotide binding protein(G-protein)，beta polypeptide 2-like 1，GNB2L1]編碼的。GNB2L1位于5號染色體(5q35.3)，由8個外顯子和7個內(nèi)含子組成[2]，其CDS全長954 bp，編碼317個氨基酸的蛋白，相對分子質(zhì)量為36 ku。 研究表明RACK1可以與多種信號分子結(jié)合，在多條信號傳導(dǎo)通路中發(fā)揮著重要的作用，進(jìn)而參與了多種生理和病理過程。本實驗在前期研究中發(fā)現(xiàn)RACK1蛋白分別在R-普萘洛爾和S-普萘洛爾處理的藥效學(xué)細(xì)胞模型上存在明顯的表達(dá)差異[3]，推測其可能與普萘洛爾抗心律失常的藥效學(xué)相關(guān)。故本實驗建立RACK1過表達(dá)和低表達(dá)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)系，為進(jìn)一步研究RACK1在心律失常中的作用及機(jī)制提供重要依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

質(zhì)粒pIRES2-EGFP、E.coliJM109和人肝癌細(xì)胞系Huh-7.5.1(昆明理工大學(xué)分子病毒實驗室夏雪山課題組惠贈)；pGenesil- 1(廣州弗爾博生物科技有限公司)；HUVEC細(xì)胞系(ATCC公司)；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA Ligase和熒光定量PCR試劑盒(Takara公司)；LipofectamineTM2000和Trizol(Invitrogen公司)；G418(Amresco公司)；鼠抗RACK1單抗(Santa公司)；兔抗β-actin多抗(Abcam公司)。

1.2RACK1基因表達(dá)框的獲得及真核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取人肝癌細(xì)胞系Huh-7.5.1中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后使用外圍引物WF1：5′-AGTGCCA TCCTCGTCGCTGC-3′和WR1：5′-TTTGTAAAGCTCT GCCATAAACTTCTAG-3′擴(kuò)增；瓊脂糖凝膠電泳確定擴(kuò)增產(chǎn)物(1 015 bp)正確后再用內(nèi)圍引物NF1：5′-G GAAGATCTATGACTGAGCAGATGACCCTTCGTG-3′(下劃線為BglⅡ酶切位點)和NR1：5′-ACGCGTCG ACTCAGCGTGTGCCAATGGTCAC-3′(下劃線為SalⅠ酶切位點)繼續(xù)擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物(973 bp)經(jīng)BglⅡ和SalⅠ雙酶切后與同樣雙酶切后的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliJM109，挑取單克隆進(jìn)行菌液PCR鑒定和測序分析。并命名為pIRES2-EGFP-RACK1。

1.3 RACK1干擾載體的構(gòu)建

針對人RACK1的mRNA序列，按照siRNA設(shè)計原則，選取CDS140-158、CDS525-543和CDS786-804作為靶位點。同時設(shè)計無義HK陰性對照，設(shè)計并合成相應(yīng)的shRNA(表1)。退火后與BamHⅠ和HindⅢ酶切后的pGenesil- 1載體連接，并轉(zhuǎn)入JM109菌，Kana抗性篩選單克隆，提取質(zhì)粒，10 μL用SalⅠ酶切電泳鑒定，20 μL送上海生工生物工程有限公司測序。鑒定正確的干擾質(zhì)粒分別命名為pGenesil- 1-RACK1- 1、pGenesil- 1-RACK1- 2、pGenesil- 1-RACK1- 3和pGenesil- 1-HK。

1.4RACK1過表達(dá)和低表達(dá)及相應(yīng)空白對照HUVEC細(xì)胞系的建立

用脂質(zhì)體分別將干擾載體pGenesil- 1-RACK1- 1、pGenesil- 1-RACK1- 2、pGenesil- 1-RACK1- 3、pGenesil- 1-HK和空載體pGenesil- 1，過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RACK1和空載體pIRES2-EGFP轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞。48 h后，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)，并消化鋪板。加入含0.7 g/L G418的完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，每隔2天換液1次。篩選至第20天時，對照細(xì)胞全部死亡。此時用0.2 g/L G418維持選擇壓力培養(yǎng)5 d，建成穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

表1 RACK1 shRNA及對照基因序列Table 1 Sequences of RACK1 shRNA and control gene

1.5 RACK1過表達(dá)和低表達(dá)穩(wěn)定細(xì)胞系的鑒定

1.5.1 qRT-PCR鑒定：Trizol裂解各細(xì)胞系，提取總RNA，取1 μg總RNA用于qRT-PCR鑒定。引物序列見表2。

表2 實時定量PCR中所用的引物Table 2 Primers used for Real-time PCR

1.5.2 Western blot鑒定：制備蛋白樣品，BCA法定量。行10% SDS-PAGE分離蛋白，半干轉(zhuǎn)膜，封閉后分別加入一抗和二抗，洗滌后，與ECL試劑反應(yīng)、處理、曝光，對蛋白條帶進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RACK1的構(gòu)建和鑒定

PCR擴(kuò)增的外圍產(chǎn)物(1 015 bp)和內(nèi)圍產(chǎn)物(973 bp)與預(yù)期長度一致(圖1)；過表達(dá)載體pIRES2-EGFP-RACK1的菌液PCR擴(kuò)增片段與預(yù)測長度(973 bp)一致(圖2)。陽性克隆測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

M.2 000 bp DNA marker; 1.PCR product of outer primers (1 015 bp); 2.PCR product of inner primers (973 bp)圖1 RACK1基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 1 The amplification products of RACK1 gene

M.2 000 bp DNA marker; 1.the PCR product of pIRES2-EGFP-RACK1(973 bp)圖2 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-RACK1的菌液PCR鑒定Fig 2 Identification of PCR product of recombinant pIRES2-EGFP-RACK1in bacterial liquid

2.2 小干擾RNA表達(dá)載體的鑒定

SalⅠ酶切產(chǎn)物如圖3，pGenesil- 1-RACK1- 1、pGenesil- 1-RACK1- 2、pGenesil- 1-RACK1- 3和pGenesil- 1-HK均得到一條約400 bp的染色帶，符合設(shè)計要求。陽性克隆測序結(jié)果與預(yù)期序列一致。

M.5 000 bp DNA Marker; 1.pGenesil- 1-RACK1- 1; 2.pGenesil- 1-RACK1- 2; 3.pGenesil- 1-RACK1- 3; 4.pGenesil- 1-HK圖3 干擾載體的Sal Ⅰ酶切鑒定Fig 3 Identification of the interference vectors digested by Sal Ⅰ

2.3重組質(zhì)粒及對照質(zhì)粒對HUVEC轉(zhuǎn)染效率的初步檢測

7種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC細(xì)胞48 h，觀察各組均有綠色熒光表達(dá)，轉(zhuǎn)染效率約為70%(圖4)。

2.4 轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定細(xì)胞系的建立

2.4.1 RACK1過表達(dá)HUVEC細(xì)胞系的篩選：經(jīng)G418篩選25 d后，得到穩(wěn)定細(xì)胞系HUVEC/pIRES2-EGFP-RACK1和HUVEC/pIRES2-EGFP(圖5)。

2.4.2 RACK1低表達(dá)組HUVEC細(xì)胞系的篩選：同樣，干擾載體轉(zhuǎn)染的HUVEC細(xì)胞系在G418的篩選下得到穩(wěn)定細(xì)胞系HUVEC/pGenesil- 1-RACK1- 1、HUVEC/pGenesil- 1-RACK1- 2、 HUVEC/pGenesil- 1-RACK1-3、 HUVEC/pGenesil-1-HK和 HUVEC/pGenesil- 1(圖6)。

A.HUVEC cells transfected with pIRES2-EGFP-RACK1 and pIRES2-EGFP; B.HUVEC cells transfected with pGenesil- 1-RACK1- 1, pGenesil- 1-RACK1- 2, pGenesil- 1-RACK1- 3, pGenesil- 1-HK and pGenesil- 1

圖5 HUVEC過表達(dá)HUVEC細(xì)胞系Fig 5 HUVEC cell strains with over-expression of RACK1(×100)

2.5 穩(wěn)定細(xì)胞系RACK1表達(dá)量的鑒定2.5.1 過表達(dá)細(xì)胞系HUVEC/pIRES2-EGFP-RACK1中蛋白(圖7A)和mRNA(圖7B)的表達(dá)較對照組HUVEC和HUVEC/pIRES2-EGFP明顯上升。

2.5.2 低表達(dá)組細(xì)胞系中RACK1蛋白(圖8A)與mRNA(圖8B)的表達(dá)較對照組HUVEC、HUVEC/pGenesil- 1-HK和HUVEC/pGenesil- 1明顯降低。其中HUVEC/pGenesil- 1-RACK1- 1下降最為明顯，將為后續(xù)實驗所選。

3 討論

RACK1是一種胞質(zhì)支架蛋白，能與有活性的蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)相互作用，并結(jié)合于PKC上，參與PKC的轉(zhuǎn)位和活化[4]。除了與PKC相互作用外，RACK1還與其他多種蛋白或信號分子相互作用，包括磷酸二酯酶PDE4D5、INSM1(insulinoma associated-1)[5]、局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)和AGAP2(ArfGAP with GTPase domain, ankyrin repeat and PH domain 2)[6]等。RACK1還是Src酪氨酸激酶的一種重要底物，向下傳遞生長因子受體酪氨酸激酶的信號，參與Src功能的調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)[7]。此外，RACK1還調(diào)節(jié)Ca2+的釋放[8- 9]，而細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度對心肌興奮性、血管伸縮狀態(tài)至關(guān)重要。本研究旨在建立HUVEC細(xì)胞系，為研究心律失常中Ca2+與RACK1表達(dá)量的關(guān)系奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

構(gòu)建過表達(dá)載體時，本研究從人RACK1 mRNA序列(NM_006098.4)中選取CDS區(qū)作為目的片段，并在兩端各加上限制性酶切位點便于與帶有綠色熒光蛋白和G418抗性基因的pIRES2-EGFP連接。pIRES2-EGFP為雙順反子載體，故其翻譯時與EGFP同時進(jìn)行， 在同一條mRNA鏈上以2個閱讀框進(jìn)行翻譯，所表達(dá)的蛋白質(zhì)為非融合蛋白，避免了與外源性標(biāo)記蛋白融合而影響RACK1的生物學(xué)活性。構(gòu)建干擾載體時，本研究選擇了多個干擾靶點，這樣有利于找到干擾效果更好的靶點。

圖6 RACK1低表達(dá)HUVEC細(xì)胞系Fig 6 HUVEC cell strains with low expression of RACK1(×100)

A.identification of RACK1 protein expression by Western blot; B.identification of RACK1 mRNA expression by qRT-PCR; *P<0.05 compared with HUVEC or HUVEC/pIRES2-EGFP

A.Identification of RACK1 protein expression by Western blot; B.Identification of RACK1 mRNA expression; *P<0.05 compared with HUVEC, HUVEC/pGenesil- 1 and HUVEC/pGenesil- 1-HK

本實驗成功構(gòu)建了RACK1過表達(dá)載體和干擾載體，并篩選出穩(wěn)定的RACK1過表達(dá)和低表達(dá)HUVEC細(xì)胞系，為后續(xù)從正反兩個方面研究RACK1在心律失常中的功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

[1] Adams DR, Ron D, Kiely PA. RACK1, A multifaceted scaffolding protein: Structure and function[J]. Cell Commun Signal, 2011, 9: 1- 24.

[2] Del Vecchio I, Zuccotti A, Pisano F,etal. Functional mapping of the promoter region of the GNB2L1 human gene coding for RACK1 scaffold protein[J]. Gene, 2009, 430: 17- 29.

[3] 毛小琴, 邱 峰, 邱宗蔭, 等. 普萘洛爾對映異構(gòu)體誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞的蛋白表達(dá)譜差異[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報, 2008, 24: 165- 171.

[4] Corsini E, Pinto A, Galbiati V,etal. Corticosteroids modulate the expression of the PKC-anchoring protein RACK- 1 and cytokine release in THP- 1 cells[J]. Pharmacol Res, 2014, 81: 10- 16.

[5] Zhang T, Chen C, Breslin MB,etal. Extra-nuclear activity of INSM1 transcription factor enhances insulin receptor signaling pathway and Nkx6.1 expression through RACK1 interaction[J]. Cell signal, 2014, 26: 740- 747.

[6] Dwane S, Durack E, O′Connor R,etal. RACK1 promotes neurite outgrowth by scaffolding AGAP2 to FAK[J]. Cell signal, 2014, 26: 9- 18.

[7] Mamidipudi V, Cartwright CA. A novel pro-apoptotic function of RACK1: suppression of Src activity in the intrinsic and Akt pathways[J]. Oncogene, 2009, 28: 4421- 4433.

[8] Zeng F, Zou Z, Niu L,etal. AhV_aPA-induced vasoconstriction involves the IP3Rs-mediated Ca2+releasing[J]. Toxicon, 2013, 70: 107- 113.

[9] Shemarova IV, Nesterov VP. Evolution of mechanisms of Ca2+-signalization. Role of Ca2+in regulation of specialized cell functions[J]. J Evol Biochem and Physiol, 2013, 49: 10- 24.

Establishment and identification of HUVEC cell strains with over-expression and low expression of RACK1

ZHANG Li1#, JIA Xiong-fei2#, NIU Hua3, FENG Yue1, SONG Yu-zhu1, ZHANG Wang-long1, LI Sheng-ying1, WU Ming-jiang4, MAO Xiao-qin3*

(1.Laboratory of Molecular Virology, College of Life Science and Technology, Kunming University of Science and Technology, Kunming 650500; 2.Dept. of Clinical Laboratory, Kunming General Hospital of Chinese PLA, Kunming 650032; 3.Dept. of Clinical Laboratory, the Affiliated Hospital of Kunming University of Science and Technology/the First People’s Hospital of Yunnan Province, Kunming 650032; 4.Key Laboratory of Medicinal Chemistry for Natural Resource, College of Chemical Science and Technology, Yunnan University, Kunming 650091, China)

ObjectiveTo establish several human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) strains with over-expression or low expression of receptor for activated C kinase 1 (RACK1), which will provide an effective tool for future studying the function of RACK1 in arrhythmia.MethodsThe full-length cDNA sequence ofRACK1 gene was amplified and inserted into pIRES2-EGFP. At the same time, designed and synthesised complementary DNA sequences of 3 pairs of short hairpin structure and a pair of negative control sequence, then subcloned into the plasmid pGenesil- 1. The HUVEC cells were transfected with these plasmids and screened by using G418. And the

RACK1；over-expression；RNA interference；HUVEC strain

2014- 03- 31

：2014- 09- 28

國家自然科學(xué)基金(81260248)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃(2011FB216，2011FB217)

*通信作者(correspondingauthor)：maoxq_123@163.com

#對本文有相同貢獻(xiàn)

1001-6325(2015)02-0218-06

Q 291

：A

expression of RACK1 mRNA and protein in the cells were assayed by qRT-PCR and Western blot, respectively.ResultsRACK1 eukaryotic expression vector and siRNA expression vectors of RACK1 were constructed successfully. After a 48 h transfection of HUVEC cells with the recombinant vectors and G418 selection, the positive cell clones were obtained. qRT-PCR and Western blot showed that over-expression vector and interference vectors could effectively enhanced and knocked-down RACK1 expression in HUVEC strains.ConclusionsHUVEC cell strains with over-expression and low expression of RACK1 have been successfully established.