miR- 141通過靶向下調(diào)EphA2表達(dá)而抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖

韓 哲，李 磊，周曉清

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 口腔科，天津 300210；2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院 口腔科，山東 濟(jì)寧 272000)

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miR- 141通過靶向下調(diào)EphA2表達(dá)而抑制人口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系的增殖

韓 哲1*，李 磊2，周曉清2

(1天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院 口腔科，天津 300210；2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院 口腔科，山東 濟(jì)寧 272000)

目的探討miR- 141對口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)CAL27細(xì)胞增殖活性的影響及其與EphA2的靶向關(guān)系。方法構(gòu)建pre-miR- 141、EphA2野生型(EphA2-WT)和突變型(EphA2-MT)真核表達(dá)載體，采用實時定量PCR(qRT-PCR)檢測pre-miR- 141的轉(zhuǎn)染效率。用MTT檢測細(xì)胞增殖活性，用雙熒光素酶報告基因檢測、qRT-PCR和Western blot驗證miR- 141與EphA2的靶向關(guān)系。結(jié)果pcDNATM6.2-GW-pre-miR- 141、pmirGLO-EphA2-WT和pmirGLO-EphA2-MT表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染pre-miR- 141的CAL27細(xì)胞miR- 141的表達(dá)顯著升高(P<0.001)。miR- 141過表達(dá)能夠明顯抑制CAL27細(xì)胞的增殖(P<0.05)，共轉(zhuǎn)染pre-miR- 141和EphA2-WT的CAL 27細(xì)胞其熒光活性顯著下降(P<0.001)，轉(zhuǎn)染pre-miR- 141的CAL27細(xì)胞其EphA2的表達(dá)要顯著低于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P<0.001)，miR- 141的過表達(dá)能夠顯著抑制EphA2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)論miR- 141的過表達(dá)可能通過靶向下調(diào)EphA2的表達(dá)從而抑制OSCC的增殖。

口腔鱗狀細(xì)胞癌；miR- 141；EphA2；增殖

口腔鱗狀細(xì)胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是第六大最常見的癌癥之一[1]，雖然目前手術(shù)及放化療技術(shù)不斷改善，但由于OSCC的部位特殊，涉及美觀和重要的生理功能，治療效果并非十分理想。因此，研究OSCC發(fā)生的分子機制，利用靶向治療技術(shù)治療OSCC成為學(xué)者們研究的熱點。miRNAs作為一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，具有抑制靶mRNA轉(zhuǎn)錄、翻譯、并促進(jìn)其降解的功能，從而參與多種基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。目前已經(jīng)有多數(shù)研究證實了miRNAs的異常表達(dá)對于多數(shù)人類腫瘤的發(fā)生具有重要的調(diào)控作用[2]。miR- 141屬于miR- 200家庭，在OSCC中的調(diào)控機制研究較少。本研究驗證了miR- 141對OSCC細(xì)胞增殖能力的影響及其對EphA2的靶向調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料

人類口腔鱗狀細(xì)胞癌CAL27細(xì)胞系、pmirGLO、pcDNATM6.2-GW真核載體和E.coli DH5α(天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院中心實驗室)，DMEM/F12(Hyclone公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，限制性內(nèi)切酶HindⅢ、SacⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA連接酶和SYBR(Premix Ex TaqTMⅡ)(均Takara公司)，質(zhì)粒抽提及凝膠回收試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript? RT)(Fermentas公司)，LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑和Trizol(Invitrogen公司)，DMSO、MTT試劑(Sigma 公司)，雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Promega公司)，10×annealing緩沖液和蛋白裂解液(RIPA)(碧云天生物技術(shù)公司)，兔抗人EphA2(BS4833)(Bioworld公司)，小鼠抗人β-actin抗體(武漢三鷹生物有限公司)，PVDF膜(Millipore公司)，蛋白發(fā)光液(碧云天生物有限公司)，SDS-PAGE凝膠實驗室自行配制。

1.2 方法

1.2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建：利用miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)檢索出hsa-miR- 141的前體頸環(huán)序列pre-miR- 141(5′-CGGCCGGCCCUG GGUCCAUCUUCCAGUACAGUGUUGGAUGGUCUAA UUGUGAAGCUCCUAACACUGUCUGGUAAAGAUGG CUCCCGGGUGGGUUC-3′)，在其兩端添加HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點。同時在TargetScan(http://www.targetscan.org/)網(wǎng)站根據(jù)堿基互補配對原則篩選成熟miR- 141的候選靶基因EphA2(5′-AAGU UUCUAUUCUGUCAGUGUUA-3′)，并在其兩端設(shè)計SacⅠ和XhoⅠ酶切位點，同時對miR- 141與EphA2互補的種子區(qū)進(jìn)行完全突變。采用T4 DNA連接酶將pre-miR- 141、EphA2野生型(EphA2-WT)和EphA2突變型(EphA2-MT)分別與pcDNATM6.2-GW和pmirGLO連接，采用E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)增后提取質(zhì)粒送上海生物工程股份有限公司測序鑒定。

1.2.2 實時定量PCR(qRT-PCR)：檢測miR- 141在CAL27細(xì)胞中的表達(dá)及其對EphA2的mRNA表達(dá)水平的調(diào)控。CAL27細(xì)胞接種于DMEM/F12培養(yǎng)基(10%胎牛血清)的6孔板中，接種密度(2～6)×105/孔，將培養(yǎng)皿置于37 ℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分組為：1)空白對照未經(jīng)處理的CAL27細(xì)胞，2)CAL27細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染pcDNATM6.2-GW空載體(miR- Ctrl)，3)轉(zhuǎn)染pre-miR- 141重組質(zhì)粒的CAL27細(xì)胞，按照LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。miR- 141的反轉(zhuǎn)錄引物為5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAA TTGCACTGGATACGACCCATCTT-3′，上游引物序列為：5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′，下游引物序列為：5′-TGCTTAACACTGTCTGGTA-3′，U6作為內(nèi)參。EphA2的上游引物序列為：5′-GGGACCTGATGCAG AACATC-3′，下游引物序列為：5′-AGTTGGTGCGGA GCCAGT-3′，β-actin作為內(nèi)參。

取RNA為500 ng，使用Fermentas公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行熒光定量擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt計算miR- 141和EphA2的表達(dá)量。

1.2.3 MTT檢測miR- 141對CAL27細(xì)胞增殖的影響：將CAL27細(xì)胞種于96孔板中，4×103/孔，分為轉(zhuǎn)染miR- Ctrl和pre-miR- 141載體兩組，每組設(shè)3個復(fù)孔， 4～6 h更換培養(yǎng)基，37 ℃孵育24、48和72 h后加入20 μL MTT孵育4 h，棄掉上清，加入150 μL DMSO上機檢測A值。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因檢測miR- 141對EphA2的靶向調(diào)控作用:將CAL27細(xì)胞接種于96孔板中，4×103/孔，實驗分為：1)miR- Ctrl+EphA2-WT，2)pre-miR- 141+EphA2-WT，3)miR- Ctrl+EphA2-MT，4)pre-miR- 141+ EphA2-MT，其中每組設(shè)3個復(fù)孔。細(xì)胞接種4～6 h后更換培養(yǎng)基，24 h后，根據(jù)Promega公司雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書上機檢測各組熒光活性。

1.2.5 Western blot檢測miR- 141對EphA2蛋白水平的影響：收集6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染miR- Ctrl和pre-miR- 141重組質(zhì)粒的CAL27細(xì)胞，根據(jù)RIPA裂解液說明書提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，配置8%的SDS-PAGE分離膠，采用電泳、濕轉(zhuǎn)法將其轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入EphA2(1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，用蛋白發(fā)光液觀察蛋白表達(dá)量，β-actin作為內(nèi)源性參照。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 成功構(gòu)建miR- 141與EphA2真核表達(dá)載體

NCBI BLAST對比顯示無堿基突變和丟失，pcDNATM6.2-GW-pre-miR- 141重組載體構(gòu)建成功(圖1A)；另外，轉(zhuǎn)染pre-miR- 141 的CAL27細(xì)胞中miR- 141的表達(dá)顯著高于未處理組(P<0.001)(圖1B)。此外，通過對比pmirGLO-EphA2-WT和pmirGLO-EphA2-MT重組載體顯示構(gòu)建成功(圖1C，D)。

2.2 miR- 141能夠抑制CAL27細(xì)胞的增殖活性

轉(zhuǎn)染pre-miR- 141后，CAL27細(xì)胞的增殖活性顯著低于轉(zhuǎn)染空載體miR- Ctrl組(圖2)。

2.3 miR- 141能夠靶向下調(diào)EphA2的表達(dá)

利用Targetscan軟件預(yù)測出miR- 141與EphA2之間存在的良好的堿基互補配對關(guān)系，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建野生型和突變型的EphA2真核表達(dá)載體(圖3A)。雙熒光素酶報告基因檢測顯示共轉(zhuǎn)染pre-miR- 141+EphA2-WT的CAL27細(xì)胞熒光活性顯著下降(P<0.001)(圖3B)。同時，轉(zhuǎn)染pre-miR- 141的CAL27細(xì)胞其EphA2的mRNA和蛋白水平的表達(dá)較轉(zhuǎn)染空載體組顯著下調(diào)(P<0.001)(圖3C，D)。

A.the recombinant plasmid of pre-miR- 141; B.the expression of miR- 141 in CAL 27 cells transfected with pre-miR- 141 compared with control; C.the recombinant plasmids of EphA2-WT; D.the recombinant plasmids of EphA2-MT; *P<0.01 compared with control

*P<0.05, **P<0.01 compared with control圖2 miR- 141對CAL27細(xì)胞增殖活性的影響Fig 2 The effect of miR- 141 on proliferation in CAL 27 cells

3 討論

miRNAs在OSCC的發(fā)生過程中可能通過調(diào)控不同的靶基因發(fā)揮抑癌或致癌作用，諸如miR- 181a可以通過下調(diào)K-ras基因?qū)SCC細(xì)胞起到顯著地抑制效果[3]。miR- 126的表達(dá)與OSCC的進(jìn)展，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，血管密度或預(yù)后差等方面存在顯著相關(guān)性，在OSCC中，低表達(dá)miR- 126可以通過靶向調(diào)控VEGF-A誘導(dǎo)血管生成和淋巴管生成[4]。

miR- 141在骨肉瘤中呈低表達(dá)，miR- 141可能通過靶向調(diào)控ZEB1和ZEB2抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)凋亡[5]。在鼻咽癌中，miR- 141可以降低PTEN和Akt的表達(dá)，通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B/P27，抑制PTEN通路影響細(xì)胞的增殖、分化和凋亡，從而激活A(yù)kt信號通路促進(jìn)鼻咽癌的發(fā)生[6]。本研究顯示miR- 141的過表達(dá)對OSCC CAL27細(xì)胞的增殖具有抑制效應(yīng)，同時利用生物信息學(xué)提示miR- 141與EphA2之間可能存在靶向調(diào)控機制。

EphA2屬于Eph家族成員之一，在腫瘤的發(fā)生、血管生成和調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附方面具有重要的作用[7]。EphA2的表達(dá)與食管癌腫瘤分化程度、區(qū)域淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的數(shù)量密切相關(guān)，并與臨床生存率呈負(fù)相關(guān)[8]。在卵巢癌中，EphA2表達(dá)水平越高腫瘤的侵襲性越強、腫瘤微血管密度越高、惡變程度越強、預(yù)后越差[9]。此外，過表達(dá)的EphA2可以通過上調(diào)Wnt/β-catenin信號通路中的TCF4、Cyclin-D1和c-Myc調(diào)控胃癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲以及腫瘤的形態(tài)[10]。本研究利用雙熒光素酶報告基因檢測發(fā)現(xiàn)miR- 141可顯著抑制EphA2-WT的熒光活性。同時，miR- 141能夠顯著抑制EphA2的mRNA和蛋白水平表達(dá)，提示miR- 141與EphA2之間可能存在靶向關(guān)系。

總之，本研究通過pre-miR- 141重組載體構(gòu)建及功能學(xué)實驗證實了miR- 141的過表達(dá)能夠抑制CAL27細(xì)胞的增殖能力，并且進(jìn)一步證實了miR- 141與EphA2之間良好的靶向關(guān)系，揭示miR- 141可能通過靶向調(diào)控EphA2參與調(diào)控OSCC細(xì)胞的增殖活性。

A.the potential miR- 141 targeting site in EphA2 3′-UTR and the mutated sequences; B.luciferase activity was detected in cells were co-transfected with pre-miR- 141 with EphA2-WT or EphA2-MT; C.expression of EphA2 mRNA in CAL 27 cells transfected with pre-miR- 141 or miR- Ctrl; D.EphA2 protein level in CAL 27 cells transfected with pre-miR- 141 or miR- Ctrl; *P<0.01 compared with control

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新聞點擊

走路上班者糖尿病風(fēng)險降低

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2013-08-14)報道，英國人上班的方式有很多種，各地的方式也有一些差異，在倫敦，乘坐運輸工具的人超過1/2，但在北愛爾蘭只有5%。

美國《預(yù)防醫(yī)學(xué)》(American Journal of Preventive Medicine)期刊中的研究發(fā)現(xiàn)，相較于開車上班的人來說，走路上班的人罹患糖尿病風(fēng)險降低40%、高血壓風(fēng)險降低17%。

研究人員分析了2萬名英國人上、下班交通方式的數(shù)據(jù)后發(fā)現(xiàn)，走路、騎自行車或是乘坐運輸工具的人，肥胖風(fēng)險會比開車或坐出租車的人小。騎自行車的人罹患糖尿病風(fēng)險比坐車的人減少1/2。

高血壓、糖尿病、肥胖都是心血管疾病的重要風(fēng)險因子，每天多花點時間運動對健康是有益的。

miR- 141 suppresses cell proliferation by target down-regulating EphA2 in human oral squamous cell carcinoma

HAN Zhe1*, LI Lei2, ZHOU Xiao-qing2

(1.Dept. of Stomatology, the Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300210; 2.Dept. of Stomatology, Jining No.1 People’s Hospital, Jining 272000, China)

ObjectiveTo assess the effect of miR- 141 on proliferation of human oral squamous cell carcinoma and target relationship between miR- 141 and EphA2.MethodspcDNATM6.2-GW-pre-miR- 141 was constructed and identified by qRT-PCR. EphA2-WT and EphA2-MT sequences were respectively cloned into pmirGLO plasmid. The potential proliferation function of miR- 141 on CAL27 cells was analyzed by MTT. The target relationship between miR- 141 and EphA2 was identified by Dual-Luciferase Assay System, qRT-PCR and Western blot.ResultsWe constructed successfully the recombinant plasmids, including pcDNATM6.2-GW-pre-miR- 141, pmirGLO-EphA2-WT and pmirGLO-EphA2-MT, and the transfection efficiency of pre-miR- 141 was increased in CAL27 cells compared to control group(P<0.001). miR- 141 could suppress the proliferation of CAL27 cells(P<0.05).Furthermore, a significant reduction of luciferase activities of CAL27 cells co-transfected with pre-miR- 141 and EphA2-WT(P<0.001). The mRNA(P<0.001) and protein expression levels of EphA2 were decreased in

oral squamous cell carcinoma, miR- 141, EphA2, proliferation

2014- 06- 05

：2014- 09- 26

*通信作者(correspondingauthor)：zxq_wyr@163.com

1001-6325(2015)02-0213-05

研究論文

R 739.81

：A

CAL27 cells transfected with pre-miR- 141.ConclusionsOverexpression of miR- 141 may suppress cell proliferation by targeting at EphA2 in CAL27 cells.