miR-34a-5p抑制K562細(xì)胞紅系分化

趙華路，卜雯婧，李玉霞，翟 頔，溫 馨，余 佳

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

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miR-34a-5p抑制K562細(xì)胞紅系分化

趙華路，卜雯婧，李玉霞，翟 頔，溫 馨，余 佳*

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005)

目的探索miR-34a-5p對(duì)K562細(xì)胞紅系分化的影響。方法分別用miR-34a-5p模擬物和反義抑制寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞，用real-time PCR法檢測(cè)過(guò)表達(dá)或干擾效率，并進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)和聯(lián)苯胺染色法檢測(cè)K562細(xì)胞向紅系的分化情況；通過(guò)Western blot方法檢測(cè)miR-34a-5p的靶基因。結(jié)果miR-34a-5p在K562細(xì)胞紅系分化過(guò)程中呈現(xiàn)表達(dá)下降趨勢(shì)；在K562細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可抑制hemin誘導(dǎo)的紅系分化(P<0.05)；反之，干擾K562內(nèi)源的miR-34a-5p表達(dá)會(huì)對(duì)K562紅系分化產(chǎn)生促進(jìn)作用(P<0.01)；另一方面，miR-34a-5p通過(guò)靶向抑制c-MYB的表達(dá)抑制細(xì)胞向紅系分化。結(jié)論miR-34a-5p通過(guò)抑制c-MYB在K562細(xì)胞早期紅系分化過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用。

miR-34a-5p；K562；c-MYB；紅系分化

紅細(xì)胞生成是骨髓多能干細(xì)胞經(jīng)歷一系列細(xì)胞增殖和分化事件，最終產(chǎn)生成熟紅細(xì)胞的過(guò)程，其中涉及復(fù)雜而精密的基因表達(dá)調(diào)控。microRNA(miRNA) 是一類長(zhǎng)度約為21～23個(gè)核苷酸的重要調(diào)控性分子，據(jù)估計(jì)人類約有 30%的蛋白編碼基因受到 miRNA 的調(diào)節(jié)，而與腫瘤相關(guān)的基因突變有 50%位于編miRNA 的區(qū)域[1]。大量研究表明 miRNA 在造血細(xì)胞增殖、分化，以及白血病發(fā)生等關(guān)鍵生命活動(dòng)中起著重要調(diào)節(jié)作用。在眾多參與造血及白血病發(fā)生的 miRNAs中，miR-34a-5p的作用顯得尤為重要。首先，miR-34-5p與TP53基因及P53 蛋白間存在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在多種亞型的白血病病理過(guò)程中有非常重要的作用[2-3]。其次，miR-34a-5p的靶基因中有數(shù)個(gè)是與造血分化發(fā)育高度相關(guān)的[4]。最近的報(bào)道還指出，miR-34a-5p在B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為巨噬細(xì)胞，以及造血巨核細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中都發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[5-6]。然而，關(guān)于miR-34a-5p在造血紅系分化發(fā)育中的作用和機(jī)制還不十分清楚。本研究選擇K562細(xì)胞作為體外紅系分化模型，通過(guò)在K562細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)和抑制miR-34a-5p檢測(cè)其對(duì)hemin誘導(dǎo)的紅系分化的影響，并通過(guò)鑒定其靶基因，初步探索miR-34a-5p在造血紅系發(fā)育中的功能和作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究miRNA的生物學(xué)特性以及在造血發(fā)生中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，無(wú)支原體胎牛血清(杭州四季青生物制品公司)，RNA提取試劑盒Trizol和pcDNA3.1表達(dá)質(zhì)粒(Invitrogen公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司)，PCR試劑盒(北京博邁德公司)，實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，miRNA模擬物(mimics)，miRNA 反義抑制寡核苷酸(inhibitors)，小干擾RNA(siRNA)分子和轉(zhuǎn)染試劑Dharmacon FECT1(Dharmacon公司)，小鼠抗c-MYB單克隆抗體(Upstate公司)，小鼠抗人GAPDH單克隆抗體(北京中杉金橋公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

人慢性髓系白血病細(xì)胞系K562由本室保存，將細(xì)胞置于含10%胎牛血清、1×105IU/L青霉素及1×105IU/L鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。6孔板中每孔接種2×105個(gè) K562細(xì)胞，用不含血清和抗生素1640培養(yǎng)過(guò)夜，Dharmacon FECT1進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染組含100 pmol miRNA模擬物或抵制物或siRNA/每孔，對(duì)照組含100 pmol siRNA-control/每孔，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)6 h后，各孔添加含20%胎牛血清的培養(yǎng)液500 μL培養(yǎng)12 h，再加入誘導(dǎo)劑hemin繼續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)至72 h。

1.3CD34+造血干/祖細(xì)胞的分離和培養(yǎng)

新鮮臍帶血標(biāo)本以含2 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)的1X PBS按照1∶4體積進(jìn)行稀釋，并用Ficoll-Hypaque(d=1.077 g/mL)淋巴細(xì)胞分離液分離得到單個(gè)核細(xì)胞。單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)一步經(jīng)CD34+磁珠分選(Miltenyi Biotec公司)得到CD34+造血干/祖細(xì)胞。分離得到的CD34+細(xì)胞在含10%胎牛血清(FCS)的IMDM培養(yǎng)基中進(jìn)行紅系誘導(dǎo)培養(yǎng)(6孔培養(yǎng)板,3 mL/孔)，添加的細(xì)胞因子為100 ng/mL干細(xì)胞因子(SCF)、5 ng/mL白細(xì)胞介素3(IL-3)、3 IU/mL促紅細(xì)胞生成素(EPO)。

1.4 c-MYB-3′UTR報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建

c-MYB-3′UTR的體外擴(kuò)增：收集培養(yǎng)的K562細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA。以提取的細(xì)胞RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系為20 μL，其中RNA模板5 μg，反轉(zhuǎn)錄引物Oligo(dT)(500 g/L)1 μL，dNTP(10 mmol/L)1 μL，混合后，65 ℃變性5 min，繼續(xù)加入5×緩沖液 4 μL，DTT 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL， M-MLV 1 μL，37 ℃反應(yīng)1 h，獲得cDNA。PCR擴(kuò)增c-MYB-3′UTR包含miR-34a-5p結(jié)合位點(diǎn)的片段，反應(yīng)體積為50 μL，其中2×Mix緩沖液25 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各10 pmol，Taq酶1 μL(2.5 U)。PCR條件為94 ℃，30 s；58 ℃，30 s；72 ℃，2 min；30個(gè)循環(huán)；最后一個(gè)循環(huán)72 ℃，10 min。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，并凝膠回收純化。c-MYB-3′UTR野生型報(bào)告基因質(zhì)粒Reporter-c-MYB-WT的構(gòu)建：純化的c-MYB-3′UTR 擴(kuò)增片斷和質(zhì)粒pmiR-Reporter用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ酶切。1%瓊脂糖凝膠電泳分離，膠回收純化，經(jīng)T4DNA連接酶作用后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞DH5α 涂布于含卡納霉素的LB平板37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取陽(yáng)性克隆擴(kuò)增培養(yǎng)后，用試劑盒提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切和DNA序列鑒定。c-MYB-3′UTR報(bào)告基因突變型質(zhì)粒Reporter-c-MYB-MUT的構(gòu)建使用QuikChangeTM基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?Stratagene公司)。

1.5 Western blot檢測(cè)c-MYB的表達(dá)

細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗2次，加入RIPA 細(xì)胞裂解液， 冰浴30 min，4 ℃ 10 000 r/min離心10 mins，收集上清，BCA試劑盒定量分裝后-70 ℃保存。取25 g細(xì)胞總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉封閉，1∶250稀釋的抗c-MYB一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，37 ℃溫育2 h，洗膜后加入ECL試劑，在x線膠片上曝光、顯影和定影?？贵w洗脫液洗脫后，進(jìn)行第2次雜交，使用抗GAPDH抗體，操作同上。

1.6 實(shí)時(shí)定量real-time PCR

使用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定RNA純度和濃度。mRNA反轉(zhuǎn)錄使用Oligo(dT18)為引物合成第一鏈cDNA；miR-34a-5p反轉(zhuǎn)錄使用已近特異性莖環(huán)引物合成第一鏈cDNA：miR-34a-5p 反轉(zhuǎn)引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGG GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAACC-3′，U6 snRNA反轉(zhuǎn)錄引物：5′-AAAATATGGAACGCTTC ACGAATTTG-3′， PCR擴(kuò)增引物如下：c-MYB(237 bp)，上游引物：5′-GAAGGTCGAACAGGAAGGTTATCT-3′，下游引物：5′-GTAACGCTACAGGGTATGGAACA-3′；γ-globin(278 bp)，上游引物：5′-GCAGCTTGTCAC AGTGCAGTTC-3′下游引物：5′-CATGATGGCAGAGG CAGAGGT-3′；GAPDH(414 bp)上游引物：5′-CC AAGGAGTAAGAAACCCTGGA-3′，下游引物：5′-CG AGTTGGGATAGGGCCTCT-3′；miR-34a-5p，上游引物：5′-GCGCTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6 snRNA， 上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，下游引物：5′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3′；反應(yīng)條件為：94 ℃變性20 s，94 ℃，30 s，60 ℃，45 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本均作復(fù)管PCR反應(yīng)。為了證實(shí)反應(yīng)產(chǎn)物的特異性，進(jìn)行了熔解曲線分析：反應(yīng)條件：60 ℃，TOUCHDOWN-PCR，每循環(huán)溫度上升0.2 ℃，180個(gè)循環(huán)，證實(shí)產(chǎn)物的特異性良好。實(shí)時(shí)定量PCR反映在Bio-Rad IQ5 PCR儀上進(jìn)行，并進(jìn)行結(jié)果分析。

1.7 聯(lián)苯胺染色

染色液的配置(現(xiàn)配現(xiàn)用)：向50 μL聯(lián)苯胺中加入1 μL H2O2過(guò)氧化氫混勻即為染色液。從培養(yǎng)的細(xì)胞中取出少量，離心收集，PBS洗1遍后，重懸在100 μL PBS中。取81 μL上述細(xì)胞懸液加入9 μL染色液混勻后，室溫放置3～5 min。取部分細(xì)胞涂片觀察或計(jì)數(shù)，一般計(jì)200個(gè)細(xì)胞，算出其中的陽(yáng)性細(xì)胞百分比。

1.8流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記CD235a的表達(dá)

收集細(xì)胞，預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞兩次，重懸于80 μL PBS中，加入一定比例稀釋好的抗體CD235a(1∶50)，4 ℃孵育30 min。PBS洗細(xì)胞2次后，細(xì)胞重懸于500 μL PBS或4%多聚甲醛，于BD公司的C6 Flow Cytometer 流式細(xì)胞儀上檢測(cè)即可。

2 結(jié)果

2.1miR-34a-5p在K562細(xì)胞紅系分化過(guò)程中的表達(dá)檢測(cè)

在誘導(dǎo)分化早期，miR-34a-5p呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，隨著分化的進(jìn)行，miR-34a-5p的表達(dá)持續(xù)減少(圖1A)。miR-34a-5p在CD34+細(xì)胞紅系分化過(guò)程中呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖1B)。

A.relative expression of miR-34a-5p during K562 erythroid differentiation; B.relative expression of miR-34a-5p during CD34+ erythroid differentiation;*P<0.05; **P<0.01 compared with 0 hour or Day 0圖1 Real-time PCR檢測(cè)miR-34a-5p在K562細(xì)胞和CD34+造血干/組細(xì)胞紅系分化過(guò)程中的變化Fig 1 Expression level of miR-34a-5p during erythroid differentiation of K562 cells and CD34+ hemato-poietic progenitor cells detected by Real-time PCR

2.2過(guò)表達(dá)miR-34a-5p抑制K562細(xì)胞紅系分化標(biāo)記基因的表達(dá)

轉(zhuǎn)染34a模擬物的K562細(xì)胞中，miR-34a-5p的表達(dá)水平明顯升高(圖2A)。與此相對(duì)應(yīng)，紅細(xì)胞表面標(biāo)記CD235a的水平顯著降低(圖2B)。同時(shí)，過(guò)表達(dá)miR-34a-5p的K562細(xì)胞與對(duì)照相比，γ-globin的表達(dá)水平顯著下降(圖2C)；聯(lián)苯胺染色統(tǒng)計(jì)結(jié)果也顯示過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可顯著降低陽(yáng)性K562細(xì)胞的比例(圖2D)。

2.3 干擾miR-34a-5p促進(jìn)K562細(xì)胞向紅系分化

轉(zhuǎn)染34a抑制物的K562細(xì)胞中內(nèi)源性miR-34a-5p被明顯的抑制(圖3A)，紅細(xì)胞表面標(biāo)記CD235a的水平顯著升高(圖3B)，γ-globin的表達(dá)水平顯著增加(圖3C)；聯(lián)苯胺染色陽(yáng)性細(xì)胞比例也顯著升高(圖3D)。

2.4miR-34a-5p通過(guò)抑制c-MYB的表達(dá)抑制K562細(xì)胞向紅系分化

靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果顯示c-MYB-3′ UTR區(qū)域含有miR-34a-5p的結(jié)合位點(diǎn)(圖4A)，過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可以顯著抑制攜帶野生型c-MYB-3′UTR的報(bào)告基因活性；然而，對(duì)突變型攜帶c-MYB-3′UTR的報(bào)告基因活性沒(méi)有影響(圖4B)。進(jìn)一步檢測(cè)顯示，過(guò)表達(dá)miR-34a-5p可以降低細(xì)胞內(nèi)源c-MYB的水平；而抑制miR-34a-5p可以升高細(xì)胞內(nèi)源c-MYB的水平 (圖4C)。

進(jìn)而，在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染了34a抑制物后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，第2組與第1組相比，34a抑制物可以升高內(nèi)源性c-MYB的水平，紅細(xì)胞表面標(biāo)記CD235a的水平也顯著升高。在此基礎(chǔ)上，第3組與第2組相比，在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-c-MYB后，使得內(nèi)源性c-MYB的水平降低，與此相對(duì)應(yīng)地，紅細(xì)胞表面標(biāo)記CD235a的水平也進(jìn)而減弱 (圖5)。因此，miR-34a-5p通過(guò)靶向抑制c-MYB的表達(dá)調(diào)節(jié)K562紅系分化的進(jìn)程。

A.relative expression of miR-34a-5p in 34a mimics-transfected K562 cells; B.FACS analysis of 34a mimics-transfected K562 cells; C.relative expression of γ-globin in 34a mimics-transfected K562 cells; D.the percentage of DAB positive cells in 34a mimics-transfected K562 cells; *P<0.05 compared with those of control group; **P<0.01 compared with those of control group

A.relative expression of miR-34a-5p in 34a inhibitors-transfected K562 cells; B.FACS analysis of 34a inhibitors-transfected K562 cells; C.relative expression of γ-globin in 34a inhibitors-transfected K562 cells; D.the percentage of DAB positive cells in 34a inhibitors-transfected K562 cells; *P<0.05 compared with those of control group; **P<0.01 compared with those of control group

3 討論

miR-34a-5p定位于人類染色體的1p36，是一個(gè)與細(xì)胞增殖、分化和癌變高度相關(guān)的microRNA。已有研究表明，miR-34a-5p在包括神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝癌、消化道癌和乳腺癌等的多種癌癥發(fā)生過(guò)程中都發(fā)揮重要調(diào)控作用：miR-34a-5p所在的1p36常常在癌癥患者中出現(xiàn)缺失[7-8]；此外，表觀遺傳學(xué)研究顯示，miR-34a-5p啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島存在40% ～100%不等的高度甲基化[9]。

雖然關(guān)于miR-34a-5p的抑癌基因作用在包括白血病在內(nèi)的多種惡性腫瘤中都得到證實(shí)，但關(guān)于該miRNA在正常造血分化中的功能卻尚未報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a-5p在K562細(xì)胞和CD34+細(xì)胞紅系分化過(guò)程都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。在K562細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-34a-5p后，表現(xiàn)為抑制其向紅系的分化成熟；而在K562細(xì)胞中抑制內(nèi)源性miR-34a-5p得到相反的結(jié)果，即促進(jìn)紅系分化的進(jìn)行。

c-MYB是鳥(niǎo)類成髓細(xì)胞增生癥病毒(AMV)和鳥(niǎo)類白血病病毒 E26 轉(zhuǎn)化基因v-MYB的細(xì)胞內(nèi)同源物，其編碼的蛋白屬核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。c-MYB是造血系統(tǒng)的重要調(diào)控因子，參與造血細(xì)胞周期調(diào)控并調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖和分化。尤其是近年來(lái)通過(guò)對(duì)不同細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因模型鼠的研究發(fā)現(xiàn)，c-MYB對(duì)紅系-巨核系祖細(xì)胞的定向分化起重要的決定作用，該基因的缺失導(dǎo)致紅系定向分化嚴(yán)重受損，而對(duì)巨核系影響較小[10-12]。已有研究證實(shí)，在hemin誘導(dǎo)的K562細(xì)胞紅系分化過(guò)程中c-MYB的正常表達(dá)對(duì)血紅蛋白的有效合成是必需的[13]。

A.a computer prediction of the conserved and mutated binding sites within the 3′ UTR of human c-MYB mRNAs for miR-34a-5p; B.relative luciferase activity of the indicated reporter constructs; C.immunoblot of endogenous levels of c-MYB in K562 cells transfected with 34a mimics or 34a inhibitors; *P<0.01 compared with those of control group

A.immunoblot of c-MYB in K562 cells transfected with 34a inhibitors or inhibitors control for 24 hours, these cells were subsequently treated for another 24 h with si-c-MYB or si-control and cultured for 48 hours; B.FACS analysis of K562 cells treated as described in A; 1.inhibitors control+si-control; 2.34a inhibitors+si-control; 3.34a inhibitors+si-c-MYB; 4.inhibitors control+ si-c-MYB

在K562細(xì)胞中，通過(guò)雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)和Western blot確定了c-MYB為miR-34a-5p的直接靶基因；并通過(guò)功能拯救(“Rescue”)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-34a-5p可以通過(guò)抑制c-MYB的表達(dá)調(diào)節(jié)紅細(xì)胞的分化成熟。該研究為進(jìn)一步闡明miRNA在造血紅系分化中的調(diào)控機(jī)制提供新的線索，并為相關(guān)疾病的分子靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供新的思路。

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螢光納米鉆石成功用于干細(xì)胞追蹤

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年8月13日?qǐng)?bào)道，中國(guó)臺(tái)灣中央研究院研究團(tuán)隊(duì)研發(fā)“螢光納米鉆石”，有如干細(xì)胞GPS，可清楚顯示干細(xì)胞位置。臺(tái)灣中央研究院原子與分子科學(xué)研究所研究員張煥正認(rèn)為，結(jié)合螢光納米鉆石與干細(xì)胞，就能觀察干細(xì)胞修復(fù)方式與路徑，未來(lái)希望能應(yīng)用在疾病或癌癥干細(xì)胞治療領(lǐng)域。

研究團(tuán)隊(duì)從新生小鼠肺部組織分離出高純度干細(xì)胞，讓螢光納米鉆石與肺部干細(xì)胞結(jié)合發(fā)出紅光，再利用生命周期螢光顯微影像技術(shù)，追蹤移植后干細(xì)胞在組織分布情況。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，把帶有螢光納米鉆石的肺部干細(xì)胞移植到肺部受損小鼠，干細(xì)胞不僅回到受傷的肺部區(qū)域進(jìn)行修補(bǔ)并增生新的肺部組織，也能夠通過(guò)影像系統(tǒng)追蹤體內(nèi)微量的肺部干細(xì)胞。

干細(xì)胞具有維持組織生理恒定及修復(fù)組織內(nèi)細(xì)胞損傷的功能，張煥正指出，干細(xì)胞移植后可能被排斥，也可能成功修復(fù)受損組織，因此，如何確切掌握干細(xì)胞移植進(jìn)入生物體后的分布動(dòng)向，就成為干細(xì)胞治療應(yīng)用成功與否的關(guān)鍵。

這項(xiàng)研究成果刊登于《自然納米科技》(Nature Nanotechnology)期刊。

英國(guó)研發(fā)終身免疫流感疫苗

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBC NEWS)2013年10月22日?qǐng)?bào)道，英國(guó)流感研究權(quán)威、倫敦大學(xué)的奧斯福教授，研發(fā)出全球第一款萬(wàn)用流感疫苗，未來(lái)可能只打一次疫苗，就能終身預(yù)防各種流感，日前獲得歐盟數(shù)百萬(wàn)歐元的研究經(jīng)費(fèi)，疫苗預(yù)計(jì)最快在5年后，也就是2018年投入使用。

傳統(tǒng)的流感疫苗，只含有病毒外層的H型及N型抗原，但這兩類抗原容易變異，衍伸出H5N1、H7N9不同流感，也因此必須年年打不同疫苗來(lái)對(duì)抗。新款萬(wàn)用疫苗則直搗病毒核心，M型及NP型抗原，注射后誘發(fā)免疫反應(yīng)，產(chǎn)生抵抗力，如果是病毒入侵，免疫系統(tǒng)就能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，預(yù)防全部的A型流感。這項(xiàng)研究已經(jīng)成功通過(guò)100多人的人體試驗(yàn)。

miR-34a-5p inhibits the erythroid differentiation of K562 cells

ZHAO Hua-lu, BU Wen-jing, LI Yu-xia, ZHAI Di, WEN Xin, YU Jia*

(State Key Laboratory of Medical Molecular Biology, Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China)

ObjectiveTo study the effects of microRNA-34a-5p on erythroid differentiation of K562 cells.MethodsK562 cells were transfected with the microRNA-34a-5p mimics and antisense inhibitors specifically targeting microRNA-34a-5p, respectively. The effects of over-expression or knocking-down of microRNA-34a-5p were examined by Quantitative RT-PCR. Flow cytometry was performed to detect specific surface marker of erythroid cells. The benzidine staining assay was used to access the differentiation of K562 cells. Western blot was performed to detect miRNA targets.ResultsmicroRNA-34a-5p was down-regulated at the early stage of K562 erythroid differentiation. Over-expression of microRNA-34a-5p in K562 cells attenuates erythroid differentiation, in contrast, inhibition of microRNA-34a-5p accelerates erythroid pheotypes in K562 cells. c-MYB was found to be the direct target of microRNA-34a-5p in erythroid cells.ConclusionsmicroRNA-34a-5p regulates early erythroid differentiation of K562 cells via repressing c-MYB.

miR-34a-5p；K562；c-MYB；erythroid differentiation

2014- 06- 16

：2014- 10- 14

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201103)

*通信作者(correspondingauthor)：j-yu@ibms.pumc.edu.cn

1001-6325(2015)02-0167-07

研究論文

Q 254

：A