CTCF在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響

吳 潔，李鵬昌，龐鈞譯，劉國(guó)友，邱 玲，竇亞玲，郭子建，呂 湘

( 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科； 2.病理科， 北京 100730；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005 )

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CTCF在乳腺癌中的表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞增殖的影響

吳 潔1*，李鵬昌1，龐鈞譯2，劉國(guó)友3，邱 玲1*，竇亞玲1，郭子建1，呂 湘3

( 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 1.檢驗(yàn)科； 2.病理科， 北京 100730；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100005 )

目的觀察抑癌基因CTCF在乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)水平，并初步探討其對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF7增殖的影響。方法Western blot檢測(cè)人乳腺癌細(xì)胞系MCF7、SKBR3和MDA-MB-231及正常乳腺細(xì)胞MCF-10A中CTCF 蛋白的表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)乳腺浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌(n=23)、癌旁組織(n=10)及乳腺纖維腺瘤(n=10)中CTCFmRNA和蛋白水平的表達(dá)。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中CTCF的水平。進(jìn)一步構(gòu)建包裝含CTCF的反轉(zhuǎn)錄病毒，感染MCF7細(xì)胞，篩選出穩(wěn)定表達(dá)CTCF的細(xì)胞系，MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖。結(jié)果CTCF在MCF-10A中表達(dá)最高，MCF7、SKBR3和MDA-MB-231中逐漸降低。乳腺癌組織中CTCF表達(dá)顯著低于癌旁組織及乳腺纖維腺瘤組織(P<0.01)，CTCF在乳腺癌患者血清中表達(dá)量也顯著低于健康對(duì)照(P<0.01)。CTCF過表達(dá)能抑制MCF7細(xì)胞的增殖。結(jié)論CTCF在乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌患者腫瘤組織及血清中表達(dá)降低。CTCF可抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。

CTCF；乳腺癌；增殖

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，對(duì)乳腺癌患者的早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療對(duì)降低乳腺癌的病死亡率和提高生存率具有舉足輕重的作用。

CTCF(CCCTC-binding factor)是廣泛存在于真核生物的多功能轉(zhuǎn)錄因子，最初被發(fā)現(xiàn)是因?yàn)樗梢越Y(jié)合在原癌基因c-myc啟動(dòng)子上并抑制其表達(dá)。CTCF含有11個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)，其結(jié)合序列廣泛分布于人基因組上[1]。CTCF可與多種基因和蛋白質(zhì)結(jié)合，參與基因的表達(dá)調(diào)控和多種生物學(xué)功能，包括激活或抑制啟動(dòng)子，構(gòu)成染色質(zhì)隔離子和絕緣子，細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，β珠蛋白和MHC-Ⅱ基因簇的調(diào)控，x染色體失活以及遺傳印跡等過程[2- 4]。

本研究通過觀察CTCF在乳腺癌細(xì)胞系、乳腺癌患者腫瘤組織及血清中的表達(dá)水平，并初步探討CTCF對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響，以期發(fā)現(xiàn)其可能的臨床價(jià)值和生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系與主要試劑

人乳腺癌細(xì)胞MCF7、SKBR3和MDA-MB-231及人正常乳腺細(xì)胞MCF-10A(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)。Trizol(Invitrogen公司)，限制性內(nèi)切酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(TakaRa公司)，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM高糖和RPMI 1640 (Gibcobrl公司)，胎牛血清(Hyclone公司)。FFPE RNA kit(Omega公司)，MTT(Sigma 公司)，CTCF抗體(07- 729)(Millipore公司)，免疫組化試劑盒(Vector公司)Human CTCF ELISA kit(武漢華美公司)。轉(zhuǎn)染試劑Vigofect、Western Luminescent Kit(威格拉斯生物技術(shù)公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)超純或分析純?cè)噭?。引物合成和測(cè)序(天一輝遠(yuǎn)公司)。

1.2 標(biāo)本來源

乳腺癌患者血清標(biāo)本23例，均取自北京協(xié)和醫(yī)院乳腺外科就診患者。所有病例均經(jīng)術(shù)后臨床病理診斷證實(shí)為乳腺癌。經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。組織標(biāo)本為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌23例，癌旁組織10例，良性病變?nèi)橄倮w維腺瘤組織10例。組織標(biāo)本經(jīng)甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm厚連續(xù)切片和組織化學(xué)切片。

1.3 Western blot檢測(cè)CTCF蛋白的表達(dá)

[5]操作(CTCF抗體1∶2 000稀釋)。

1.4ELISA法檢測(cè)乳腺癌患者血清標(biāo)本中CTCF含量

抽取23例乳腺癌術(shù)前患者及11例健康對(duì)照女性靜脈血，分離血清于-80 ℃低溫冰箱待測(cè)。ELISA試劑盒檢測(cè)血清樣本中的CTCF濃度。操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)乳腺癌患者組織中CTCFmRNA表達(dá)

FFPE RNA kit提取組織切片中總RNA，定量后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Gene Bank中CTCF和GAPDH的基因序列設(shè)計(jì)引物用于熒光定量PCR檢測(cè)，CTCF上游引物：5′-GTGCGATTACGCCAGTGTAGA-3′，下游引物：5′-TGTGTCCCTGCTGGCATAACT-3′；GAPDH上游引物：5′-GGTCACCAGGGCTGCTTTTA-3′，下游引物：5′-GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3′。具體操作見參考文獻(xiàn)[5]。

1.6 免疫組化檢測(cè)乳腺組織中CTCF蛋白表達(dá)

按參考文獻(xiàn)[6]操作(CTCF抗體1∶100稀釋)。

1.7 CTCF反轉(zhuǎn)錄病毒載體的構(gòu)建

以CTCF-T質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增，凝膠回收CTCF目的條帶。與反轉(zhuǎn)錄病毒載體pMSCV-neo連接，轉(zhuǎn)化，挑選單克隆測(cè)序，測(cè)序正確的大提質(zhì)粒備用。

1.8 反轉(zhuǎn)錄病毒的包裝和靶細(xì)胞的感染

將pMSCV-CTCF或空載體pMSCV，外加病毒包膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pVSVG和pMD，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。收集病毒上清，濃縮后檢測(cè)病毒滴度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。MCF7細(xì)胞中加入病毒上清(含polybrane 8 μg/mL)，10～12 h后換液。感染48 h后G418(800 μg/mL)加壓篩選，約7～10 d后形成混合細(xì)胞克隆。

1.9 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖

按參考文獻(xiàn)[5]操作。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1正常乳腺細(xì)胞和不同侵襲性乳腺癌細(xì)胞系中CTCF的蛋白表達(dá)

CTCF在MCF10A中表達(dá)最高，MCF7、SKBR3和MDA-MB-231中逐漸降低(圖1)。

2.2 CTCF蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)

CTCF在癌旁組織和乳腺纖維腺瘤細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞系，陽性染色，呈棕黃色，在乳腺癌細(xì)胞中表達(dá)明顯減弱，呈陰性或弱陽性(P<0.01)(圖2，表1)。

圖1 Western blot檢測(cè)CTCF在細(xì)胞系中的表達(dá)Fig 1 The expression of CTCF protein in cell lines by Western blot

A.peritumoral tissue; B.fibroadenoma; C,D.invasive ductal carcinoma圖2 免疫組化檢測(cè)CTCF在乳腺組織中的表達(dá)Fig 2 The expression of CTCF protein in breast tissues by IH(×400)

2.3 乳腺癌組織中CTCF mRNA及蛋白的表達(dá)

侵襲性導(dǎo)管癌組織中CTCFmRNA及蛋白表達(dá)水平顯著低于癌旁組織和乳腺纖維腺瘤組織(P<0.01)，而乳腺纖維腺瘤組織與癌旁組織無差異(表1)。

表1 各組間CTCF表達(dá)水平比較

*P<0.01 compared with fibroadenoma and peritumoral tissue.

2.4手術(shù)前乳腺癌組和健康組血清中CTCF水平的比較

CTCF在血清中含量均較低，乳腺癌組CTCF血清濃度為7.77(5.77～10.12)，顯著低于健康對(duì)照組的12.55(7.67～14.85)(P<0.05)。

2.5 穩(wěn)定表達(dá)CTCF的MCF7細(xì)胞系的建立

穩(wěn)定表達(dá)CTCF的MCF7細(xì)胞中，CTCF蛋白含量明顯高于對(duì)照細(xì)胞(圖3)。

圖3 Western blot檢測(cè)CTCF在MCF7細(xì)胞中的表達(dá)Fig 3 The expression of CTCF in MCF7 cells by Western blot

2.6 CTCF抑制MCF7細(xì)胞的增殖

與MCF7細(xì)胞相比，空載體pMSCV組不同時(shí)間點(diǎn)吸光度(A)值無顯著差異，而CTCF過表達(dá)組各時(shí)間點(diǎn)A值均明顯降低(P<0.01)(表2)。

3 討論

腫瘤的發(fā)生往往伴隨著癌基因的異常激活以及抑癌基因的沉默。16號(hào)染色體長(zhǎng)臂(16q)的雜合性缺失是乳腺癌發(fā)生最常見的體細(xì)胞遺傳事件之一，發(fā)生于約一半乳腺導(dǎo)管癌和更多的小葉癌中[7]，CTCF基因定位于16q22.1。本研究發(fā)現(xiàn)CTCF在正常乳腺細(xì)胞中表達(dá)高于乳腺癌細(xì)胞，且侵襲性越強(qiáng)的乳腺癌細(xì)胞中CTCF表達(dá)越低，提示其可能的抑癌功能。

在乳腺小葉癌組織中可檢測(cè)到CTCF的表達(dá)缺失[8]，且研究表明在腎母細(xì)胞瘤、白血病、乳腺癌等多種腫瘤中均可檢測(cè)到CTCF的錯(cuò)義突變，這些突變即便不影響CTCF的表達(dá)，也會(huì)影響CTCF蛋白的功能，說明CTCF的表達(dá)和功能與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[9- 10]。本研究發(fā)現(xiàn)侵襲性導(dǎo)管癌腫瘤組織中CTCF 的表達(dá)水平顯著低于正常乳腺組織和良性病變組織，而良性病變組織與正常乳腺組織之間則無明顯差異。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CTCF在浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌患者血清中含量亦顯著低于健康對(duì)照。提示CTCF可作為潛在的乳腺癌鑒別診斷標(biāo)志物，其實(shí)際診斷價(jià)值及與乳腺癌分期、預(yù)后的關(guān)系還需要擴(kuò)大樣本量來進(jìn)一步驗(yàn)證分析。

研究發(fā)現(xiàn)CTCF可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和集落生成[9,11]。髓系白血病細(xì)胞中過表達(dá)CTCF可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖阻滯，促進(jìn)紅系分化[12]。亦有文獻(xiàn)報(bào)道小鼠胸腺特異性敲除CTCF可導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)抑制[13]。CTCF對(duì)細(xì)胞增殖影響的差異性報(bào)道可能源于不同的細(xì)胞類型。本研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CTCF可抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7的增殖，其機(jī)制還有待深入研究，可能與CTCF調(diào)控增殖相關(guān)基因P16的染色質(zhì)開放狀態(tài)及表達(dá)相關(guān)[14]。

表2 MTT法檢測(cè)CTCF對(duì)MCF7細(xì)胞增殖速率的影響Table 2 The effect of CTCF on proliferation of MCF7 cells by MTT(±s, A value, n=3)

*P<0.05 compared with MCF7 and pMSCV group.

本研究結(jié)果表明，CTCF表達(dá)降低或缺失可能是乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中一重要的分子事件，可作為潛在的乳腺癌鑒別診斷標(biāo)志物。CTCF可以抑制乳腺癌細(xì)胞MCF7的增殖，具體的過程和機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

志謝:感謝軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物工程研究所朱旭東教授饋贈(zèng)CTCF-T質(zhì)粒，感謝中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所病理學(xué)系高云周老師在免疫組化方面的技術(shù)支持。

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The expression of CTCF in breast cancer and its impact on cell proliferation

WU Jie1*, LI Peng-chang1, PANG Jun-yi2, LIU Guo-you3, QIU Ling1*, DOU Ya-ling1, GUO Zi-jian1, Lü Xiang3

(1.Dept. of Clinical Laboratory; 2.Dept. of Pathology, PUMC Hospital, Beijing 100730; 3.Institute of Basic Medical Sciences, CAMS & PUMC, Beijing 100005, China )

ObjectiveTo observe the expression ofCTCFin breast cancer cell lines, tumor tissues and serum of breast cancer patients, and to explore the effect of CTCF on proliferation of MCF7.MethodsWestern blot was used to detect CTCF expression in human breast cancer cell lines MCF7, SKBR3, MDA-MB-231 and normal breast cells MCF-10A. Real-time quantitative PCR and immunohistochemistry were applied to detect the mRNA and protein levels ofCTCFin invasive ductal carcinoma (n=23), peritumoral tissue (n=10) and fibroadenoma (n=10). Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used to detect the concentration of CTCF protein in serum. Furthermore, retroviral vector containingCTCFfull length was constructed and retroviruses were packaged, then MCF7 cells were infected to screen clones stably expressing CTCF. MTT assay was applied to detect cell proliferation.ResultsCTCF expression in MCF-10A was the highest, and decreased gradually in MCF7, SKBR3 and MDA-MB-231. CTCF expression in breast carcinoma tissue was significantly lower than that in peritumoral

CTCF；breast cancer；proliferation

2014- 11- 19

：2014- 12- 18

國(guó)家自然科學(xué)基金(81301508)；北京協(xié)和醫(yī)院中青年基金(pumch-2013-117)

*通信作者(correspondingauthor)：wujie@pumch.cn; lingqiubj@aliyun.com

1001-6325(2015)02-0157-05

研究論文

R34

：A

tissue and benign lesions (P<0.01). CTCF protein concentration in serum of breast cancer patients was also significantly lower than that of healthy control (P<0.01). In addition, CTCF overexpression inhibited the proliferation of MCF7 cells.ConclusionsCTCF expression declined significantly in breast cancer cell lines, carcinoma tissues and serum of breast cancer patients as compared with the those in controls. CTCF may inhibit the proliferation of breast cancer cells.