高濃度尿素誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞系產(chǎn)生炎性因子

王 琦，王弘凱，劉麗君，何 菲，汪克建，李晉芳，冉建華*

(重慶醫(yī)科大學：1基礎醫(yī)學院 解剖學教研室；2神經(jīng)科學研究中心；3附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 重慶400016)

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高濃度尿素誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞系產(chǎn)生炎性因子

王 琦1,2，王弘凱1,2，劉麗君1,2，何 菲1,2，汪克建1，李晉芳3，冉建華1,2*

(重慶醫(yī)科大學：1基礎醫(yī)學院 解剖學教研室；2神經(jīng)科學研究中心；3附屬第二醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科 重慶400016)

目的研究高濃度尿素誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞系(HBMECs)產(chǎn)生炎性因子及其機制。方法以相同滲透壓的甘露醇為對照，高濃度尿素(25 mmol/L)干預 HBMECs 3、6、12和24 h后，免疫熒光法觀察細胞內(nèi)腫瘤壞死因子α(TNF-α)和誘導型一氧化氮合酶(iNOS)的表達。蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測TNF-α、iNOS、環(huán)氧合酶- 2(cycloxygenase- 2，COX- 2)、核因子κB(NF-κB) /P65和p-P65的表達水平。一氧化氮(NO)試劑盒檢測細胞NO含量。結(jié)果高濃度尿素增強細胞內(nèi)TNF-α和iNOS表達。細胞 TNF-α、COX- 2 和p-P65蛋白水平在3和6 h明顯高于對照組(P<0.01)；iNOS蛋白水平持續(xù)增高(P<0.01)。NO含量在3 h明顯增多(P<0.05)。結(jié)論高濃度尿素誘導人腦微血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生炎性因子。

尿素；人腦微血管內(nèi)皮細胞；腫瘤壞死因子α；一氧化氮；核因子-κB

尿毒癥性腦病是尿毒癥最常見的并發(fā)癥之一，表現(xiàn)以抑郁為主的神經(jīng)精神癥狀，其病理機制復雜，可能與血液內(nèi)尿素及胍類等毒性物質(zhì)蓄積和體內(nèi)外活性氧(reactive oxygen species，ROS)增加導致的血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)結(jié)構(gòu)及功能損傷有關，但尚缺乏分子機制的研究[1]。高濃度尿素是重要的致病因素，其可誘導動物體內(nèi)外ROS大量產(chǎn)生，導致慢性腎衰竭、氧化應激、胰島素抵抗和動脈粥樣硬化等多種病理改變[2- 3]。本研究組曾報道，尿素通道蛋白敲除小鼠海馬中高濃度尿素與其抑郁樣行為密切相關，并伴隨著ROS水平增加[4]，提示高濃度尿素刺激產(chǎn)生的ROS可能在尿毒癥性腦病發(fā)病過程中具有重要作用。氧化應激和神經(jīng)炎性反應所引起的神經(jīng)血管功能失調(diào)及BBB高通透性是抑郁發(fā)病的病理基礎[5]。本實驗擬研究高濃度尿素對腦血管內(nèi)皮細胞炎性因子的表達及相關機制，為揭示尿毒癥性腦病的病理機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人腦微血管內(nèi)皮細胞系(human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)(ScienCell公司)。主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基和胰蛋白酶(Gibco公司)；胎牛血清(Hyclone公司)；二甲基亞砜、甘露醇和尿素(Sigma公司)；BCA 蛋白濃度測定試劑盒(Thermo公司)；PVDF 膜(Milipore公司)；COX- 2、iNOS、NF-κB/p65、p-P65 抗體(CST公司)；第8因子抗體(FVIII)、TNF-α抗體、β-actin 抗體(Santa公司)；CCK- 8 檢測試劑盒(Dojindo公司)；NO測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 細胞系的培養(yǎng)： HBMECs 置于含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的 RPMI 1640細胞培養(yǎng)基中，在37 ℃和5% CO2恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。細胞正常狀態(tài)下每2天換液1次，待細胞增殖至70%～80%匯合后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 實驗分組： 高濃度尿素(25 mmol/L)刺激組、甘露醇相同滲透壓對照組，每組又分為不同時間(3、6、12和24 h)干預組(n=3)。

1.2.3 細胞免疫熒光技術(shù)檢測 FVIII/TNF-α/iNOS： 細胞完成相應處理后，用4%多聚甲醛室溫固定，0.3% T riton X- 100打孔,然后10%山羊血清室溫封閉30 min。再加相應稀釋濃度的一抗(對照組用 PBS 代替)，4 ℃ 孵育過夜。次日 PBS 洗滌3× 10 min,按稀釋濃度1∶200滴加相應的熒光二抗，注意避光。Hochest 染核后 PBS 充分洗滌，用防猝滅封片劑封片，在熒光顯微鏡下拍照。

1.2.4 細胞活力檢測： 取增殖狀態(tài)良好的人腦微血管內(nèi)皮細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，細胞計數(shù)獲得約為4×104個/mL 細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入含10%胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)液0.1 mL，置于37 ℃，5% CO2細胞恒溫箱中孵育24 h。然后棄掉舊的培養(yǎng)液，按實驗分組加入不同濃度(0、1.56、6.25、25、100和400 mmol/L)的尿素,每種濃度設置3個復孔，并設空白對照，放入培養(yǎng)箱中孵育24 h。然后向每孔中加入10 μL CCK- 8溶液(注意避免生成氣泡)，在培養(yǎng)箱中孵育1 h 后，用酶標儀測定在450 nm處測每孔的吸光度值。

1.2.5 Western blot對TNF-α、COX- 2、iNOS、NF-κB/P65和p-P65蛋白的檢測： HBMECs 經(jīng)不同時間點高濃度尿素和甘露醇刺激后，提取細胞總蛋白。按 Western blot 相應步驟檢測細胞中TNF-α、COX- 2、iNOS、NF-κB/P65和p-P65 蛋白的變化。

1.2.6 NO含量測定： 取不同時間尿素和甘露醇刺激的各組細胞培養(yǎng)液，按NO檢測盒說明書操作，采用酶標儀檢測550 nm處每孔的吸光度值，根據(jù)公式計算NO含量。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 人腦微血管內(nèi)皮細胞的鑒定

腦血管內(nèi)皮細胞活性好，細胞呈梭形或多角形，胞核清晰，胞質(zhì)豐富。實驗組胞質(zhì)中FVIII呈紅色熒光的陽性表達，PBS對照組無熒光呈陰性表達(圖1,2)。

圖1 倒置顯微鏡下正常的人腦微血管內(nèi)皮細胞Fig 1 Normal human brain microvascular endothelial cells in inverted microscope(×100)

2.2 不同濃度尿素對細胞活力的影響

400 mmol/L尿素可明顯抑制人腦微血管內(nèi)皮細胞增殖(P<0.05)，對細胞有毒性作用(圖3)。

2.3高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中TNF-α和iNOS表達的影響

25 mmol/L尿素刺激3 h后，實驗組細胞中TNF-α及iNOS的綠色熒光陽性表達明顯強于對照組(圖4)。

2.4高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中炎性因子TNF-α、COX-2及iNOS的影響

與對照組相比，25 mmol/L尿素刺激3及6 h組細胞中TNF-α和COX- 2 蛋白表達水平明顯增加(P<0.01)；高濃度尿素刺激組細胞中iNOS的表達水平在各個時間點(3、6、12和24 h)較對照組均增高(P<0.01)(圖5，表1)。

2.5高濃度尿素對人腦微血管內(nèi)皮細胞中NF-κB/P65通路的影響

25 mmol/L尿素刺激組細胞中p-P65蛋白表達水平在3及6 h較對照組明顯增加(P<0.001)(圖6)。

2.6 高濃度尿素不同時間刺激對細胞NO影響

25 mmol/L尿素刺激3 h細胞NO產(chǎn)量較對照組明顯增多(P<0.05)(圖7)。

3 討論

腦血管內(nèi)皮細胞是BBB的重要組成部分，參與維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，內(nèi)皮細胞的炎性反應是多種神經(jīng)精神疾病的關鍵病理環(huán)節(jié)[6]。研究高濃度尿素是否誘導內(nèi)皮細胞的炎性反應可為探討尿毒癥性腦病的病理機制提供基礎。

在抑郁癥等多種神經(jīng)精神疾病中，前炎性因子TNF-α通過誘導細胞骨架重排和黏附因子產(chǎn)生等破壞內(nèi)皮的屏障功能[7]。激活的小膠質(zhì)細胞可促進COX- 2的高表達，進而誘導iNOS表達而增加iNO的合成，iNO與O2-結(jié)合形成ONOO-可損傷血管內(nèi)皮細胞并破壞BBB的完整性[7- 8]。TNF-α可誘導iNOS的表達上調(diào)或活性增加，導致iNO產(chǎn)量增加而加重內(nèi)皮的損傷[9]。本研究采用25 mmol/L尿素(人體正常尿素濃度約為5 mmol/L，尿毒癥患者體內(nèi)尿素濃度20～80 mmol/L[2])刺激人腦微血管內(nèi)皮細胞發(fā)現(xiàn)，細胞中炎性因子TNF-α、COX- 2和iNOS蛋白表達上調(diào)，提示炎性反應的發(fā)生；TNF-α和COX- 2在3、6 h均較對照組明顯升高，而12和24 h無明顯差異，這可能與后期抗炎分子的抑制作用有關；細胞中iNOS蛋白表達水平受TNF-α及COX- 2的調(diào)節(jié)而持續(xù)升高。P65是NF-κB家族中具有轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的重要成員之一，脂多糖等外源性刺激信號可通過磷酸化P65調(diào)控TNF-α及iNOS的表達[10]。腦血管內(nèi)皮細胞中p-P65表達水平上調(diào)，提示NF-κB信號通路參與了尿素刺激內(nèi)皮細胞分泌炎性因子的過程。

Immunofluorescence showed FVIII (red, Cy3-labeled) localized in HBMECs, with cell nuclei stained (blue, Hochest stain)

HBMECs viability detected by CCK- 8; *P<0.05 compared with 0圖3 不同濃度的尿素對人腦微血管內(nèi)皮細胞活力的影響Fig 3 Effects of different concentrations of urea on HBMECs viability(n=3)

Immunofluorescence showed TNF-α and iNOS(green, FITC-labeled) localized in HBMECs, with cell nuclei stained (blue, Hochest stain)圖4 高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中TNF-α、iNOS表達的影響Fig 4 Effects of 25 mmol/L concentrations of urea on TNF-α(left) and iNOS(right) expression in HBMECs(scale bar, 100 μm)

Western blot analysis for TNF-α, COX- 2 and iNOS protein expression was performed圖5 高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中TNF-α、COX- 2 及iNOS蛋白表達的影響Fig 5 Effects of 25 mmol/L concentrations of urea on TNF-α, COX- 2 and iNOS protein expression in HBMECs

Western blot analysis for P65 and p-P65 protein expression was performed; A.graph showed the representative films; Bar graph B.showed the density ratio between P65 and p-P65; *P<0.001 compared with control group (mannitol)圖6 高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中P65、p-P65 蛋白表達的影響Fig 6 Effects of 25 mmol/L concentrations of urea on P65 and p-P65 protein expression in HBMECs(n=3)

表1 不同時間高濃度尿素刺激人腦微血管內(nèi)皮細胞對炎性因子蛋白表達的影響

*P<0.01,**P<0.001 compared with control group.

NO concentration in supernatant of HBMECs culture was determined by a commercial NO assay kit; *P<0.05 compared with control group圖7 高濃度尿素刺激對人腦微血管內(nèi)皮細胞中NO含量的影響Fig 7 Effects of 25 mmol/L concentrations of urea on NO content in HBMECs(n=3)

iNOS的誘導性表達可加重多種病理因素引發(fā)的神經(jīng)功能損傷[8]。本研究中高濃度尿素刺激組細胞總NO水平在3h升高可能與iNOS的高表達相關，而3 h后NO水平的變化可能與eNOS表達下調(diào)導致eNO水平降低有關(結(jié)果未顯示)。研究發(fā)現(xiàn)，ROS能誘導eNOS解偶聯(lián)，降低eNO的合成，并與內(nèi)皮細胞功能紊亂、血管氧化應激和炎性反應有關[11]。因此，尿素刺激可能通過誘導iNOS的大量產(chǎn)生和eNOS的解偶聯(lián)，導致iNO增加和eNO減少來共同加重血管內(nèi)皮細胞結(jié)構(gòu)和功能的損害。

綜上所述，高濃度尿素經(jīng)NF-κB信號通路引起腦血管內(nèi)皮細胞中炎性因子TNF-α、COX- 2和iNOS表達水平上調(diào)；iNOS的誘導性表達增加腦血管內(nèi)皮細胞中iNO的含量，通過損傷BBB而引發(fā)后續(xù)病理過程。而尿素對星形膠質(zhì)細胞等其他血-腦脊液屏障結(jié)構(gòu)的影響還有待進一步研究。

[1] Liu M, Liang Y, Chigurupati S,etal. Acute kidney injury leads to inflammation and functional changes in the brain [J]. J Am Soc Nephrol, 2008，19: 1360- 1370.

[2] Zhang Z, Dmitrieva NI, Park JH,etal. High urea and NaCl carbonylate proteins in renal cells in culture andinvivoand high urea causes 8-oxoguanine lesions in their DNA [J]. PNAS，2004, 101: 9491- 9496.

[3] Supachai T, Joan DF, Jinxi L,etal. High NaCl-and urea-induced posttranslational modifications that increase glycerophosphocholine by inhibiting GDPD5 phosphodiesterase [J]. PNAS，2013, 110:7482- 7487.

[4] Li X, Ran JH, Zhou H,etal. Mice lacking urea transporter UT-B display depression-like behavior[J]. J Mol Neurosci，2012, 46:362- 72.

[5] Souhel N, Daniel MP, Orrin D,etal. Neurovascular unit dysfunction with blood-brain barrier hyperpermeability contributes to major depressive disorder: a review of clinical and experimental evidence [J]. J Neuroinflammation, 2013, 10:142- 143.

[6] Doughs BC, Heanor S, Pollak,etal. Endothellan cells in physiology and in the pathophysiology of vascular disorders [J]. Blood, 1998, 91:3527- 3561.

[7] Pun PB, Lu J. Moochhala S: Involvement of ROS in BBB dysfunction [J]. Free Radic Res, 2009, 43:348- 364.

[8] Stuehr DJ, Santolini J, Wang ZQ,etal. Update on mechanism and catalytic regulation in the NO synthases [J]. J Biol Chem, 2004, 279:36167- 36170.

[9] Chuang YC. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in seizureinduced neuronal cell death [J]. Acta Neurol Taiwan, 2010, 19:3- 15.

[10] Matsuda N,Hattori Y. Systemic inflammatory response syndrome(SIRS)：molecular pathophysiology and gene therapy[J]. J Pharmacol Sci, 2006, 10l:189- 198.

[11] Danielle LM, Karen LA. Endothelial dysfunction in hypertension: The role of arginase [J]. Bioscience, 2011, S3: 946- 960.

High concentrations of urea induce human brain microvascular endothelial cell line to produce inflammatory cytokines

WANG Qi1,2, WANG Hong-kai1,2, LIU Li-jun1，2, HE Fei1,2, WANG Ke-jian1, LI Jin-fang3, RAN Jian-hua1,2*

(1.Dept. of Anatomy, College of Medicine; 2.Neuroscience Research Center; 3.Dept. of Neurology, the Second Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016,China)

ObjectiveTo explore high concentrations of urea-induced human brain microvascular endothelial cell line(HBMECs) to produce inflammatory cytokines and possible mechanism.MethodsHBMECs were incubated in high concentrations of urea or mannitol(as osmotic control) for 3，6，12 and 24 hours. Expression of TNF-α and iNOS was observed by immunofluorescence. Western blot analysis was employed to assess the protein expressions of TNF-α, iNOS, COX- 2, NF-κB/P65 and p-P65. NO concentration was determined by a commercial NO assay kit.ResultsImmunofluorescence showed high positive immunostaining of TNF-α and iNOS after incubation in high concentration of urea stimulued as compared with control group.The protein expressions of TNF-α, COX- 2 and p-P65 were significantly increased at 3 and 6 hours after high urea treatment (P<0.01), and iNOS was continued to increase from 3 to 24 hours (P<0.01).Moreover, NO content was increased at 3 hours after high urea treatment (P<0.05).ConclusionsHigh concentration of urea can induce HBMECs to produce inflammatory cytokines.

urea; human brain microvascular endothelial cells; TNF-α；NO；NF-κB

2014- 09- 01

：2014- 10- 23

國家自然科學基金(30500171)；重慶市教委項目(KJ120330，KJ120314)；重慶市衛(wèi)生局項目(2012- 1- 038)；重慶市渝中區(qū)科委項目(20120202)；重慶市科委項目(stc2011 JJA10030)；重慶醫(yī)科大學大學生科學研究與創(chuàng)新實驗項目(201403)；國家(市)級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目(201410631003)

*通信作者(correspondingauthor)：1315038024@qq.com

1001-6325(2015)02-0152-05

研究論文

R 364.5

：A