油茶籽粕發(fā)酵菌株的篩選鑒定及發(fā)酵產物特性分析

朱曉麗 趙錦繡 李富松 張星 柯玉鑫 申燁華 張子夜 王軍強

摘要 油茶行業(yè)的迅速發(fā)展導致油茶籽粕廢棄物的大量產生，其落后的處理方式造成了嚴重的資源浪費，制約了我國油茶行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。油茶籽粕中富含有機質，利用微生物發(fā)酵法降解其中的纖維素、木質素及茶皂素等生物大分子來制備有機肥是實現油茶籽粕合理資源化利用的有效途徑。通過篩選獲得3株針對油茶籽粕中纖維素和木質素的高效降解菌，包括1株真菌X1-1，屬于Pleurostomarichardsiae，以及2株細菌M4-2和M5-2，分別為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii）和類芽孢桿菌（Paenibacillussp）屬，可有效降低發(fā)酵產物中茶皂素的含量，實現油茶籽粕的無害化處理。實驗結果顯示，經菌株X1-1、M4-2和M5-2發(fā)酵處理28 d后，油茶籽粕中纖維素含量的降解率分別為29.74％、19.65％和13.19％，木質素含量的降解率分別為12.84％、17.85％和26.39％，茶皂素含量的降解率分別為34.06％、45.05％和46.15％;且發(fā)酵后的油茶籽粕腐熟度、有機質含量和養(yǎng)分含量等指標均符合有機肥標準。研究結果拓展了油茶籽粕的資源化利用途徑，同時為木質素和纖維素的高效降解提供了良好的菌種資源。

關鍵詞 油茶籽粕;纖維素;木質素;茶皂素;降解菌;有機肥

Screening and characterization of fermentation strains of camellia

sinensis seed meal and fermentation products

Abstract The rapid development of camellia oleifera industry has led to a large number of camellia oleifera seed residue， which caused serious waste of resources， restricting the sustainable development of Chinas camellia oleifera industry.Considering the high contents of organic matter， using camellia oleifera seed residue to prepare organic fertilizer is an effective way for resource utilization. In the process of composting， cellulose， lignin and tea saponin and other biological macromolecules should be effectively biodegraded by microorganisms. In this paper， three highly efficient degrading strains targeting cellulose and lignin in camellia oleifera seed residue were obtained by screening and domestication， including 1 strain of fungus X1-1（Pleurostomarichardsiae）， and 2 strains of bacteria M4-2 （Pseudomonas monteilii） and M5-2 （Paenibacillus sp.）.The three strains can also effectively reduce the content of tea saponin in fermentation products， to realize the harmless treatment of camellia oleifera seed residue.The experimental results showed that after 28 days of fermentation with strain X1-1， M4-2 and M5-2， the degradation rates of cellulose content in camellia oleifera seed residue were 29.74％， 19.65％ and 13.19％， the degradation rates of lignin content were 12.84％， 17.85％ and 26.39％， and the degradation rates of tea saponin content were 34.06％， 45.05％ and 46.15％， respectively.Moreover， the maturity， organic matter content， andnutrient content in fermentation product of camellia oleifera seed residue all met the organic fertilizer standards.The results of this study expand the resource utilization path of camellia oleifera seed residue， and provide good strain resources for the efficient degradation of lignin and cellulose.

Keywords camellia oleifera seed residue; cellulose; lignin; tea saponins; fermentation strains; organic fertilizer

作為我國特有的食用木本油料作物，油茶在湖南、江西等地廣泛分布，種植面積高達400多萬畝，年產油茶籽超過100多萬噸［1-2］。自2016年油茶正式被列為我國大宗油料作物以來，其產量及產值逐年穩(wěn)步增長［2］，與此同時，油茶行業(yè)的快速發(fā)展也產生了大量的油茶籽粕廢棄物，并造成了嚴重的資源浪費。據估算，我國每年的油茶籽粕廢棄物產量超過70萬噸，而其高值化利用技術的發(fā)展則嚴重滯后，極大地制約了油茶行業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展［3-4］。

油茶籽粕廢棄物中富含豐富的營養(yǎng)物質，包括蛋白質、糖類和多酚等［5］，可廣泛應用于醫(yī)藥、食品和飼料等領域［6］。然而，從我國目前的油茶籽粕廢棄總量和發(fā)展趨勢考慮，現有的廢棄物利用方式均難以滿足油茶行業(yè)的快速發(fā)展。相較之下，以油茶籽粕為底物進行發(fā)酵處理制備有機肥，是實現油茶籽粕大規(guī)模資源化利用的有效處理方式［7］。油茶籽粕中富含大分子物質木質素和纖維素，木質素是以苯基丙烷為結構單元的一種高分子聚合物［8］，纖維素是以β-D-葡萄糖為結構單元，通過β-1， 4-糖苷鍵連接的一種線性高分子多糖化合物［9］。這些大分子物質不能被作物直接吸收，在自然界中降解緩慢［10］，因此在使用油茶籽粕制備有機肥的過程中，需要通過微生物降解將其轉化為能夠被作物吸收利用的小分子營養(yǎng)物質。研究發(fā)現，白腐菌、褐腐菌、軟腐菌、木霉屬、青霉屬、曲霉屬等真菌均對木質素和纖維素表現出較強的降解性能，其中，部分菌株對木質素、纖維素的降解率可達20％以上［11-14］。有研究顯示，通過添加地衣芽孢桿菌、釀酒酵母及植物乳桿菌對油茶籽粕進行發(fā)酵，大部分粗纖維中的高分子芳香化合物分解為低分子物質，有效破壞了木質纖維素分子結構，將部分糖類物質轉化為菌體蛋白，從而使得粗纖維含量降低，粗蛋白的含量升高［15-17］，因此制備的有機肥的肥力也明顯提升。除木質素、纖維素外，油茶籽粕中還含有較多的茶皂素，作為一種糖甙化合物，茶皂素對多種微生物的生長具有顯著抑制作用［18-19］，因此不僅會阻礙油茶籽粕固態(tài)發(fā)酵的進程，在進入土壤后也會對土壤益生菌產生不利影響［20］。此外，茶皂素隨有機肥施入土壤后，還會對作物種子發(fā)芽產生抑制作用，同時減緩土壤有機質的分解，阻礙土壤營養(yǎng)物質循環(huán)過程，降低土壤肥力［21］。然而，現有關于油茶籽粕發(fā)酵的研究中大多關注木質素、纖維素的降解以及養(yǎng)分物質的變化，而忽略了油茶籽粕中茶皂素的降解，難以獲得腐熟程度理想的有機肥產物。

由此可知，以油茶籽粕發(fā)酵生產有機肥，需要綜合考慮木質素、纖維素和茶皂素的降解，以實現對油茶籽粕的脫毒處理。因此，本研究通過篩選獲得可高效降解油茶籽粕中纖維素、木質素及茶皂素的功能菌株，評價了功能菌株對纖維素、木質素和茶皂素的降解效果，將其用于油茶籽粕發(fā)酵制備有機肥，獲得了腐熟度、有機質含量、養(yǎng)分和重金屬含量等指標均符合標準的有機肥，為油茶籽粕廢棄物的大規(guī)模資源化利用提供了良好的思路和可行的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料及試劑

本實驗所用油茶籽粕原料購自湖南大三湘茶油資源有限公司。葡萄糖、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氯化鈉、磷酸氫二鉀、羧甲基纖維素鈉硫酸銨和七水合硫酸鎂均為分析純。酵母浸粉和蛋白胨均為BR生物試劑。

馬鈴薯液體（PDA）培養(yǎng)基：將200 g馬鈴薯切成小塊煮沸20 min，用8層紗布過篩，冷卻后加入20.00 g葡萄糖，加蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌處理。

木質素初篩液體培養(yǎng)基：堿性木質素2.00 g、硫酸銨 1.00 g、七水合硫酸鎂 0.50 g、磷酸二氫鉀 1.00 g、磷酸氫二鈉 0.20 g溶于蒸餾水，pH調至7.00，蒸餾水定容至1 000 mL，滅菌處理。

苯胺藍顯色培養(yǎng)基：酵母浸粉5.00 g、氯化鈉 10.00 g、蛋白胨10.00 g、瓊脂20.00 g、苯胺藍0.25 g、蒸餾水1 000 mL，pH調至7.00～7.20［22］，滅菌處理。

剛果紅纖維素培養(yǎng)基：剛果紅0.20 g、 微晶纖維素1.88 g、 七水合硫酸鎂0.25 g、 磷酸氫二鉀0.50 g、 瓊脂20.00 g、 去離子水1 000 mL， 滅菌處理。

羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體培養(yǎng)基：硫酸銨1.00 g、氯化鈣0.02 g、七水合硫酸鎂0.20 g、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na） 10.00 g、六水合氯化鐵0.05 g、磷酸氫二鉀1.00 g、茶皂素5.00 g、瓊脂20.00 g、去離子水1 000 mL［23-24］，滅菌處理。

LB培養(yǎng)基：氯化鈉10.00 g、蛋白胨10.00 g、酵母提取物5.00 g、蒸餾水1 000 mL，滅菌處理。

固體培養(yǎng)基：在其對應的液體培養(yǎng)基中加入20 g瓊脂，滅菌處理。

1.1.2 試劑配制

中性洗滌劑：稱取乙二胺四乙酸（EDTA）18.6 g 和四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）6.8 g，加一定量的去離子水適當加熱，再加乙二醇乙醚10 mL后加30 g十二烷基硫酸鈉（SDS）;用天平量取 4.65 g磷酸氫二鈉放入到另一個三角瓶中，加適量去離子水后溶解，可適當加熱，待溶液溫度降至室溫后，將配好的2種溶液放入1 000 mL容量瓶中用去離子水定容到刻度線。此溶液pH值應在6.9～7.1。

酸性洗滌劑：移液槍抽取 27.87 mL 98％的濃硫酸用玻璃棒引流緩慢滴加500 mL 去離子水中，待溫度穩(wěn)定后，向體系內加入20 g十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）拌混勻， 待液體呈現透明并帶有少量氣泡證明溶解完全， 將溶液定容到1 000 mL即可，備用。

72％的硫酸：量取質量分數為 98.3％的濃硫酸 398 mL， 用玻璃棒引流至去離子水中， 定容至1 000 mL即可。

8％（w／v）香草醛無水乙醇溶液：準確稱取8.0 g香草醛，用無水乙醇溶解，置于100 mL容量瓶中定容。為使測定的數據具有良好的重現性和穩(wěn)定性，每次進行樣品分析時，都需新配制香草醛無水乙醇溶液。同時，反應過程中，需振搖容量瓶3次，使反應均勻。

77％（v／v）硫酸：取硫酸（98％w／w） 77 mL加到23 mL去離子水中。

1.2 油茶籽粕理化性質測定

油茶籽粕樣品的水分、灰分、總酸、粗纖維、粗脂肪和茶皂素的含量測定分別參照《食品安全國家標準食品中水分的測定》（GB 5009.3—2016）［25］、《食品安全國家標準食品中灰分的測定》（GB 5009.4—2016）［26］、《食品中總酸的測定》（GB／T 12456—2008）［27］、《植物類食品中粗纖維的測定》（GB／T 5009.10—2003）［28］、《食品安全國家標準食品中脂肪的測定》（GB 5009.6—2016）［29］和《油茶籽粕中茶皂素的提取工藝研究》［30］的規(guī)定方法。

1.3 菌株的篩選

1.3.1 纖維素降解菌株的篩選

取油茶籽粕樣品10.00 g，加入少許無菌水，發(fā)酵7 d后轉入100 mL的PDA液體培養(yǎng)基，在28 ℃、120 r／min條件下培養(yǎng)，待長出大量菌體后，一部分轉入纖維素初篩液體培養(yǎng)基用于纖維素降解菌的篩選，另一部分轉入木質素初篩液體培養(yǎng)基用于木質素降解菌的篩選。轉入羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）液體初篩培養(yǎng)基中的菌體在搖床繼續(xù)培養(yǎng)2 d后，將菌液進行10倍梯度的稀釋，得到稀釋度為

10-1～10-6的培養(yǎng)液。隨后，取不同濃度的菌液各100 μL，通過平板涂布法接種到剛果紅纖維素固體培養(yǎng)基上，并在28 ℃、120 r／min條件下培養(yǎng)3～5 d。觀察菌落生長情況，當出現有透明圈的菌落即初步認為菌株具備纖維素降解能力，選取其中透明圈直徑較大的菌落進行多次劃線并分離純化。將初篩得到的單菌落挑取在CMC-Na液體培養(yǎng)基中，孵育2 d后進行稀釋，并采用稀釋涂布法進一步在羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）固體培養(yǎng)基上純化纖維素降解菌，挑選出長勢良好的菌株。將復篩選出的菌株接種至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，成為菌種活化液，將活化液與50％的甘油混合，凍存至-80 ℃冰箱中待用。

1.3.2 木質素降解菌株的篩選

轉入木質素液體初篩培養(yǎng)基的菌體，在搖床中保持28 ℃、120 r／min條件下培養(yǎng)2 d。之后，同樣進行10倍梯度稀釋處理，得到10-1～10-6稀釋度的培養(yǎng)液。隨后將不同濃度梯度的菌液各取100 μL用平板涂布法接種到木質素初篩固體培養(yǎng)基上，并在28 ℃、120 r／min條件下培養(yǎng)3～5 d。選擇木質素初篩固體培養(yǎng)基上長出的單獨菌落，挑到木質素液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d之后，取菌液稀釋至10-5后在苯胺藍顯色培養(yǎng)基上進行不同濃度梯度的菌液涂布，篩選出變色圈較大或者使培養(yǎng)基完全變色的菌株。將篩選出的菌株挑到LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)1 d，成為菌種活化液，將活化液與50％的甘油保存，凍存至-80 ℃冰箱。

1.4 菌株鑒定

1.4.1 顯微形態(tài)特征

霉菌采用水浸片法觀察細胞形態(tài)，細菌采用革蘭氏染色法染色后鏡檢。

1.4.2 ITS、16S rDNA 序列鑒定

篩選出的菌株送至上海凌恩生物科技有限公司進行ITS、16S rDNA測序。具體過程為：以提取的菌株總DNA為模板進行ITS、16S rDNA基因PCR擴增、測序，X1-1、M4-2和M5-2分別獲得556bp、1422bp和1446bp的PCR擴增片段，GenBank數據庫登錄號分別為OL677875、OL855974和OL872184。將測序得到的菌株ITS、16S rDNA與Genbank數據庫進行Blast比對，采用MEGA軟件對比對結果進行分析，將目標菌株鑒定到屬，并繪制系統(tǒng)發(fā)育樹分析菌株種屬特性。

1.5 降解實驗

1.5.1 純木質素降解實驗

分別配制濃度為0.00、0.10、0.20、0.30、0.40和0.50 g／L的堿性木質素水溶液，測定其OD280值以制作木質素標準吸收曲線，所得回歸方程為Y=4.234 9X-0.01，R2=0.999 5。

將菌液（OD=1）按30％（v／m）的接種量接入100 mL木質素液體培養(yǎng)基中， 并在28 ℃、120 r／min條件下振蕩培養(yǎng)。使用5.00 mL無菌EP管每隔7 d取1次樣品。取樣時搖勻培養(yǎng)基，每次吸取4.00 mL液體，于8 000 r／min條件下離心10 min，所得上清液用0.45 μm的水系濾膜過濾，測定其OD280濃度為0.40 g／L的值，所得結果代入回歸方程計算堿性木質素降解率，

式中： C1表示初始培養(yǎng)基中堿性木質素濃度，? g／L;C2表示待測樣品中堿性木質素濃度， g／L。

1.5.2 油茶籽粕中木質素、纖維素的含量測定

參照范式粗纖維分析法［31］測定油茶籽粕發(fā)酵過程中的纖維素和木質素含量。具體方法為：將發(fā)酵后的油茶籽粕于105 ℃烘干，取烘干樣1 g于直筒燒杯，加入100 mL中性洗滌后，剩余的殘渣烘干，其成分是半纖維素、纖維素、木質素和硅酸鹽;再經過100 mL酸性洗滌劑洗滌后，剩余殘渣烘干，其成分為為纖維素、木質素和硅酸鹽，質量差為半纖維素質量;隨后用72％硫酸洗滌，剩余物質烘干，其成分是木質素和硅酸鹽，質量差為纖維素質量，再經馬弗爐550 ℃燒制4 h，剩余的灰分即為硅酸鹽質量，其質量差為木質素質量。

1.5.3 油茶籽粕中茶皂素的測定

采用香草醛-濃硫酸顯色法測定茶皂素的含量變化［30］，其原理為：茶皂素中含有皂苷， 皂苷是一類含有糖苷鍵的四環(huán)或五環(huán)三萜的化合物， 其C3、C12上的羥基可與香草醛上的醛基發(fā)生反應形成縮醛， 成為新的共軛體系而顯色［32］。具體方法為：①茶皂素提取，稱取105 ℃烘干的油茶粕5.00 g，與70％（v／v）乙醇按1∶7比例混合，于60 ℃水浴鍋加熱2 h，將濾液用70％（v／v）乙醇定容至50.00 mL；②茶皂素的測定，移取上述樣液0.10 mL、蒸餾水0.40 mL及8％（v／m）香草醛無水乙醇溶液0.50 mL于10 mL試管中，將試管移至冰水浴中，加入77％ （v／v）硫酸溶液4.00 mL，搖勻，再將試管放在恒溫60 ℃的水浴鍋中加熱15 min，進行顯色反應，取出試管放置到室溫，用70％乙醇定容至10 mL，搖勻，以70％乙醇為空白，在波長為550 nm時測定，外標法定量［30］。

1.5.4 油茶籽粕的降解實驗

將油茶籽粕原料置于烘箱中保持105 ℃條件烘干至恒重，粉碎后稱取10.00 g放入錐形瓶中，加入10.00 mL的無菌蒸餾水，使其含水率為50％，并在121 ℃下滅菌20 min以去除樣品中原有微生物的干擾。待冷卻后，在無菌環(huán)境下加入30％篩選出來的菌種活化液，置于25 ℃、120 r／min條件下以半固態(tài)進行好氧發(fā)酵。發(fā)酵實驗共持續(xù)28 d，在7、14、28 d取樣，分別依據1.5.2節(jié)和1.5.3節(jié)中的步驟測定發(fā)酵后的油茶籽粕中纖維素、木質素及茶皂素含量，并計算3種物質的降解率。

1.5.5 生物炭的制備

將小麥秸稈用去離子水進行清洗，經烘干、粉碎后過0.150 mm篩，密封保存?zhèn)溆谩⑻幚磉^的小麥秸稈置于馬弗爐中700 ℃下缺氧炭化2 h，冷卻后留備用［33］。

1.6 發(fā)酵產物指標測定

1.6.1 腐熟度測定

稱取發(fā)酵28 d后的油茶籽粕試樣（鮮樣）10.00 g于250 mL錐形瓶中， 按照固液比1∶10加入相應質量的水，密封后垂直固定于搖床中，以25 ℃，120 r／min震蕩浸提1 h，之后靜置0.5 h，取上清液過濾搖勻后備用。

在培養(yǎng)皿中放置定性濾紙，之后均勻放入50粒大小一致、顆粒飽滿的小白菜種子，加入上述浸提液10.00 mL，蓋上保鮮膜并戳孔保持透氣，在培養(yǎng)箱中25 ℃條件下避光培養(yǎng)48 h，統(tǒng)計發(fā)芽種子的粒數，并用游標卡尺逐一測量主根長，以水培發(fā)芽結果作為對照。通過公式（2）計算種子發(fā)芽指數（GI）［34］。

式中：A1為油茶籽粕有機肥料浸提液培養(yǎng)下的種子中發(fā)芽粒數百分比， ％;A2為油茶籽粕機肥料浸提液培養(yǎng)的種子平均根長， mm;B1為水培種子中發(fā)芽粒數百分比， ％;B2為水培種子的平均根長， mm。

取3次測定結果的算術平均值為最終測定結果，平行實驗結果的絕對誤差值保持在5％以內。其中，發(fā)芽指數大于50％視為基本腐熟，發(fā)芽指數大于85％視為完全腐熟。

1.6.2 產物pH及養(yǎng)分含量測定

稱取5.00 g的油茶籽粕風干樣（過0.250 mm篩）于燒杯中，加入50.00 mL不含CO2的水（經煮沸10 min驅除CO2），使用磁力攪拌器攪動3 min后靜置30 min，用pH計測定產物的pH值。

將發(fā)酵28 d后的油茶籽粕樣品烘干、粉碎并過0.150 mm篩，稱取1.00 mg左右的樣品用錫紙包覆后，使用EA3000元素分析儀測定其有機碳和養(yǎng)分氮含量［35］。

SOM=SOC×1.724? （3）

式中：SOM為有機質含量， g／kg;SOC為有機碳含量， g／kg;1.724為有機質和有機碳換算系數。

2 結果與分析

2.1 基本理化性質

油茶籽粕的基本理化性質如表1所示。可以看出，粗纖維（主要成分是木質素和纖維素）和茶皂素含量較高，占總質量比例超過50％，如果不對其進行有效處理，難以得到效果較好的有機肥。

2.2 菌株篩選

微生物降解纖維素的效果可以根據其在富含纖維素的培養(yǎng)基上產生透明圈的大小來判斷［36］。 實驗結果表明， 菌株在2種培養(yǎng)基上呈現出明顯的透明圈〔見圖1（a）、（b）〕， 表明篩選的菌株具有較強的纖維素分解能力。 同一個平板經過多次分離、 純化后， 得到1株纖維素降解菌， 編號為X1-1。

苯胺藍固體培養(yǎng)基的褪色程度可以反應木質素降解菌的降解能力［37］。實驗結果顯示，部分菌株使苯胺藍培養(yǎng)基完全褪色〔見圖1（c）、（d）〕，說明該類菌株對木質素降解能力較強。同一個平板經過多次分離、純化后，初步得到3株木質素降解菌，分別編號為M4-2、M4-3和M5-2。杜海萍等研究表明［38］，單是苯胺藍培養(yǎng)基的褪色情況僅能定性判斷菌種是否產生過氧化氫酶，因此需要進一步分析菌株對于純木質素的降解率。圖2顯示了菌株在7 d和14 d時對堿性純木質素的降解率?？梢钥闯?，菌株對堿性木質素的降解率隨發(fā)酵時間的增加而提高，且篩選的4種菌株中，M4-2和M5-2對堿性木質素的降解效果最好。

2.3 菌株降解性能

2.3.1 降解菌株的優(yōu)選

通過篩選的4株降解菌株對油茶籽粕進行發(fā)酵，測定發(fā)酵產物中木質素、纖維素及茶皂素的降解率，以篩選出對油茶籽粕發(fā)酵效果最佳的菌株。4株降解菌株對油茶籽粕進行7 d發(fā)酵處理后，其對纖維素、木質素和茶皂素的降解率結果如圖3所示。其中，菌株X1-1對纖維素和茶皂素的降解率最高，分別達到36.24％和14.28％;而菌株M5-2對木質素的降解率最高的，為20.55％;相較其他3株菌而言，菌株M4-2對3種物質的降解能力均不是最高，但綜合效果較好。

因此，綜合考慮4種菌株在純木質素和油茶籽粕中的降解結果，確定選取菌株X1-1、M4-2和M5-2為目標進行進一步的菌種鑒定和后續(xù)發(fā)酵模擬試驗。

2.3.2 菌株發(fā)酵對油茶籽粕中纖維素、木質素和茶皂素的降解效果

菌株X1-1、 M4-2和M5-2對油茶籽粕中纖維素、 木質素和茶皂素在不同發(fā)酵時間下的降解率如圖4所示。 由圖4（a）可知， 在菌株X1-1、 M4-2和M5-2的作用下， 木質素降解率與發(fā)酵時間呈正相關， 并且M5-2對木質素的降解率顯著高于X1-1和M4-2， 在第28 d時最高降解率達到26.39％。 由圖4（b）可知， 菌株M5-2對纖維素的降解率隨著發(fā)酵時間的增加呈現升高趨勢， 而菌株X1-1和M4-2對纖維素的降解率則呈現先降低后增加的趨勢。 推測此現象的主要原因為范式粗纖維分析法所測纖維素初始含量并不包括被木質素包埋的形式所禁錮的部分［31］， 導致纖維素降解率計算公式中分母取值偏小， 菌株在降解木質素過程中會釋放部分額外的纖維素［39］， 致使計算降解率數值降低。 伴隨發(fā)酵過程的進行， 釋放出的纖維素會進一步被菌株降解，使得計算降解率升高。 相較之下， 菌株M5-2對木質素降解能力較強， 在短期內即可釋放被包埋的纖維素。 因此， 在整個發(fā)酵期內對纖維素的計算降解率較低， 但始終保持增長趨勢。這與張仲卿等人研究發(fā)現混合真菌對玉米秸稈發(fā)酵產物中木質素和纖維素的降解率為36.80％和28.87％的結果相似［40］。 圖4（c）顯示 3種菌株對茶皂素也表現出了顯著的降解性能， 而且降解率隨著發(fā)酵時間延長而迅速增加， 在28 d后， X1-1、 M4-2和M5-2對油茶籽粕中的茶皂素降解率分別達到34.06％、 45.05％和46.15％。 此結果高于黃浦等人采用桔青霉（Penicillium citrinum）對茶皂素的降解率（36.71％）［41］。

綜合木質素、纖維素和茶皂素的降解率隨發(fā)酵時間的變化情況來看，第28 d的降解效果較好，說明適當延長發(fā)酵時間有助于3種物質特別是茶皂素的充分降解。

2.4 菌株鑒定

根據油茶籽粕發(fā)酵試驗，綜合其降解效果，確定菌株X1-1、M4-2和M5-2為最優(yōu)目的菌株，對其進行形態(tài)觀察以及DNA測序和同源性分析。如圖5（a）和（d）、（b）和（e）、（c）和（f）分別為純化后菌株X1-1、M4-2和M5-2的菌落形態(tài)及顯微形態(tài)鏡檢圖。菌株X1-1的菌落生長迅速，呈粉狀至絨毛狀或簇狀，灰褐色，反面灰褐色至寡黑色，其為真菌，菌絲生長迅速，呈細長狀，無隔中空且無分枝，孢子是由菌絲逐漸斷裂形成的節(jié)孢子，孢子呈橢圓形。菌株M4-2菌落呈淺黃色不透明狀，具有光滑的表面和規(guī)則的邊緣，鏡檢圖表明其呈短桿狀，革蘭氏染色為紅色，革蘭氏陰性菌。菌株M5-2形成菌落呈透明狀圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊，鏡檢圖表明其呈長桿狀，革蘭氏染色為紅色，革蘭氏陰性菌。

將X1-1的ITS和M4-2、M5-2的16S rDNA測序結果在NCBI中進行BLAST比對，構建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖6）。結果表明，X1-1、M4-2和M5-2分別與Pleurostomarichardsiae、Pseudomonas monteilii和Paenibacillussp位于同一個系統(tǒng)發(fā)育分支中，與模式菌株Pleurostomarichardsiae、Pseudomonas monteilii和Paenibacillussp菌株的序列相似性達99％，結合形態(tài)學特征、生理生化特性和系統(tǒng)發(fā)育的分析結果，將X1-1菌株鑒定為Pleurostomarichardsiae，M4-2菌株鑒定為蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii），M5-2菌株鑒定為類芽孢桿菌（Paenibacillus sp.）。

2.5 油茶籽粕發(fā)酵產物性質測定

圖7為菌株處理的油茶籽粕發(fā)酵不同時間后發(fā)酵產物的種子發(fā)芽指數。按照農業(yè)行業(yè)標準《有機肥料》（NY／T 525—2021）要求，種子發(fā)芽指數（GI）需要達到70％以上。由圖7可以看出，種子發(fā)芽指數隨著發(fā)酵時間的延長而增加，只有在發(fā)酵時長達到28 d時油茶籽粕發(fā)酵產物的腐熟度才能達標。經X1-1、M4-2和M5-2發(fā)酵28 d后的浸提液培養(yǎng)的種子發(fā)芽指數分別為70.65％、72.18％和104.41％，全部符合有機肥的國家標準，且M5-2腐熟度最高，說明M5-2這株菌在發(fā)酵中更具有優(yōu)勢。

按照農業(yè)行業(yè)標準《有機肥料》（NY／T 525—2021）的要求，有機肥的pH值需要在5.5～8.5。測定發(fā)現，經過X1-1、M5-2和M4-2發(fā)酵后的油茶籽粕pH分別為5.52、5.0、4.74，發(fā)酵產物呈酸性的原因可能是微生物在發(fā)酵過程中產生了有機酸類物質，而真菌比細菌發(fā)酵產物pH偏高的原因可能是真菌在發(fā)酵的過程中會生成生物堿中和了一部分酸。生物炭具有微孔結構、較大的比表面積及富含碳等特點，可以有效改善土壤的酸堿度，提高土壤的保水性和通透性，給微生物制造一個良好的棲息空間和生存環(huán)境［42］。其pH為10.07，比表面積為71.209 m2／g，灰分含量為26.53％，產率為13.21％。因此將有機肥與生物炭按照1∶1的質量比向X1-1、M5-2和M4-2混合，得到混合有機肥的pH分別為7.08、6.34和6.16，全部符合有機肥的國家標準。由圖8可以看出，由X1-1、M4-2和M5-2發(fā)酵28 d后的油茶籽粕制備的混合有機肥中有機質含量分別為89.15％、90.89％和82.51％，全部符合有機肥的國家標準（大于30％）?？傪B(yǎng)分（N+P+K）的含量分別為9.89％、8.73％、13.01％，同樣均符合國家標準（大于4.0％）。

3 結論

本文篩選了能同時降解木質素、纖維素及茶皂素的功能菌株，并將其用于油茶籽粕發(fā)酵，成功制備了有機肥，主要結論如下。

1）從油茶籽粕中篩選純化出3株木質素降解菌（M4-2、M4-3、M5-2）和1株纖維素降解菌（X1-1）。通過測定4種菌株對油茶籽粕中纖維素、木質素和茶皂素的降解率，綜合分析得出，X1-1、M4-2和M5-2對油茶籽粕發(fā)酵28 d的效果較好。其中，X1-1對纖維素、木質素、茶皂素的降解率分別為29.74％、12.84％、34.06％； M4-2對纖維素、木質素、茶皂素的降解率分別為19.65％、17.85％、45.05％；M5-2對纖維素、木質素、茶皂素的降解率分別為13.19％、26.39％、46.15％。進而對X1-1、M4-2和M5-2進行菌種鑒定，分別是Pleurostomarichardsiae、蒙氏假單胞菌 （Pseudomonas monteilii）和類芽孢桿菌（Paenibacillus sp）。

2）油茶籽粕經過X1-1、M4-2和M5-2發(fā)酵28 d后，發(fā)酵產物提取液的種子發(fā)芽指數分別為70.65％、72.18％和104.41％，表明其腐熟度均達標，且M5-2的腐熟度最佳。經生物炭調節(jié)后的pH分別為7.08、6.34和6.16，有機質含量分別為89.15％、90.89％和82.51％，總養(yǎng)分含量為9.89％、8.73％、13.01％，均符合國家標準。

綜上所述，本研究篩選出的3株菌株對木質素、纖維素及茶皂素均有較好的降解效果，添加功能菌株對油茶籽粕進行發(fā)酵制備有機肥，具有成本低、腐熟度高、養(yǎng)分充足、安全無害等優(yōu)點，為油茶籽粕的大規(guī)模資源化利用提供了有效途徑，具有良好的應用前景。

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