家蠅精氨酸激酶基因克隆及其在害蟲(chóng)防治上的應(yīng)用

于雪，曹新茹，高一夫，唐婷，柳峰松

（河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002）

精氨酸激酶（arginine kinase，ATP：N－phosphotransferase EC2.7.3.3）廣泛存在于無(wú)脊椎動(dòng)物如昆蟲(chóng)、甲殼動(dòng)物和軟體動(dòng)物體內(nèi)，是無(wú)脊椎動(dòng)物能量代謝最重要的酶類(lèi)之一.當(dāng)動(dòng)物體內(nèi)的ATP充足時(shí)，可以將能量?jī)?chǔ)存在磷酸精氨酸的高能磷酸鍵中；當(dāng)動(dòng)物消耗大量的ATP時(shí)，精氨酸激酶催化磷酸精氨酸分解生成ATP.精氨酸激酶在無(wú)脊椎動(dòng)物生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，是無(wú)脊椎動(dòng)物特有的磷酸原激酶，該酶及其能量代謝途徑與哺乳動(dòng)物不同，因此，精氨酸激酶可以作為防控害蟲(chóng)的一個(gè)有效而安全的靶點(diǎn).

RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指外源或內(nèi)源雙鏈RNA（double strand RNA，dsRNA）介導(dǎo)的特異性降解靶向mRNA，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（post－transcriptional gene silencing，PTGS）［1］.RNA干擾具有抑制轉(zhuǎn)座子活動(dòng)、抗病毒入侵、調(diào)控基因表達(dá)等作用，是重要的監(jiān)控機(jī)制.Guo等［2］利用反義RNA手段探索線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）par1基因的功能時(shí)發(fā)現(xiàn)了RNAi現(xiàn)象.Fire等［3］詳盡地解釋了這種現(xiàn)象是由于制備反義RNA 時(shí)混入了微量的dsRNA 引起的，認(rèn)為dsRNA 是引發(fā)RNA 沉默的關(guān)鍵因子，并把這種現(xiàn)象稱(chēng)為RNAi.目前，RNAi技術(shù)已經(jīng)在多種昆蟲(chóng)上得到應(yīng)用，dsRNA 進(jìn)入昆蟲(chóng)體內(nèi)的方法主要有投喂、浸泡、注射、轉(zhuǎn)基因和病毒介導(dǎo)等，這些方法各有特點(diǎn)，投喂法最具前景［4－8］.

家蠅（Musca domestica）俗稱(chēng)蒼蠅，其繁殖能力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，世界各地廣泛分布，與人類(lèi)的關(guān)系密切.家蠅攜帶多種病原菌，并能將病原菌傳給人類(lèi)或牲畜，危害性較大［9］.本研究以家蠅精氨酸激酶基因?yàn)榘悬c(diǎn)，通過(guò)投喂長(zhǎng)dsRNA 來(lái)抑制家蠅體內(nèi)精氨酸激酶的表達(dá)水平，大大影響了家蠅的存活率，以此揭示精氨酸激酶在家蠅體內(nèi)的生物學(xué)功能，并為害蟲(chóng)防治提供了一種新思路.

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)與試劑

1.1.1 供試?yán)ハx(chóng)

家蠅（Musca domestica）由本實(shí)驗(yàn)室保種和飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為25 ℃，幼蟲(chóng)餌料成分：麩皮55g，滅活酵母粉3g和150mL水.成蠅飼養(yǎng)成分：水、紅糖和奶粉.

1.1.2 菌株及質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α菌株、HT115菌株以及L4440質(zhì)粒.

1.2 主要試劑和試劑盒

RNAiso Plus，pMD18－T Vector，限制性內(nèi)切酶，T4DNA 連接酶購(gòu)自大連寶生物公司，M－MLV 反轉(zhuǎn)錄酶，SYBR Green，Taq DNA 聚合酶均為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，引物合成自蘇州金唯智生物技術(shù)有限公司.其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純.

1.3 總RNA 的提取及cDNA的合成

依照寶生物RNAiso Plus使用說(shuō)明書(shū)，按步驟提取家蠅3齡幼蟲(chóng)總RNA.核酸定量?jī)x測(cè)定總RNA 純度和濃度，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)完整性后，定總量為2μg的總RNA 為RT－PCR 模板，用通用引物Oligo（dT）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA.

1.4 家蠅MdAK 基因的克隆

從本實(shí)驗(yàn)室測(cè)得的家蠅轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索到一段長(zhǎng)3 140bp的EST 序列（CL 939.Contig 1），通過(guò)Blastn程序在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)該序列進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)與昆蟲(chóng)精氨酸激酶基因相似性較高.根據(jù)此EST 序列用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)正反向引物MdAK－F和MdAK－R（表1），以家蠅cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸3min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10min.PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離、切膠回收后，連接pMD18－T 載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，經(jīng)菌落PCR 篩選陽(yáng)性克隆后測(cè)序.

表1 PCR 引物Tab.1 Primers for PCR

1.5 MdAK 基因序列的生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Bioedit軟件搜索MdAKcDNA 序列開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），并將核酸序列翻譯成氨基酸序列.在ExPASy：ProtParam 程序中（http：／／au.expasy.org／tools／protparam.html）分析MdAK的分子質(zhì)量和等電點(diǎn).利用Blastp程序在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源序列查找，對(duì)獲得的昆蟲(chóng)精氨酸激酶的氨基酸序列利用Clustal軟件進(jìn)行多重序列比對(duì).

1.6 L4440載體的構(gòu)建和dsRNA的誘導(dǎo)

根據(jù)家蠅MdAK 的cDNA 序列，利用軟件Primer設(shè)計(jì)出上下游引物RNAi－F和RNAi－R，引物5'末端分別加入BamHI和XhoI限制性酶切位點(diǎn)，將擴(kuò)增片段與L4440載體經(jīng)過(guò)雙酶切回收后，連接獲得重組質(zhì)粒L4440－MdAK，將其轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)菌落PCR 篩選陽(yáng)性克隆菌，提取小量質(zhì)粒，重復(fù)雙酶切，檢驗(yàn)后測(cè)序驗(yàn)證.將構(gòu)建好的干擾載體轉(zhuǎn)化至HT115宿主，通過(guò)菌落PCR 篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接種100mL含有氨芐青霉素（終質(zhì)量濃度60μg／mL）和四環(huán)素（終質(zhì)量濃度50μg／mL）的LB（Lysogeny Broth）新鮮液體培養(yǎng)基，37 ℃搖床200r／min培養(yǎng)至OD600＝0.6～0.8時(shí)加入2mol／L IPTG（isopropyl－β－D－thiogalactoside）至終濃度為0.4mmol／L，37 ℃，200r／min誘導(dǎo)3h.同時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)含空載L4440質(zhì)粒的菌作為空白對(duì)照.提取菌體RNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察dsRNA 的表達(dá)情況.

1.7 RNAi實(shí)驗(yàn)

分別將經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)的含有L4440－MdAK 重組質(zhì)粒和L4440 空載質(zhì)粒的HT115 菌液稀釋至OD600＝0.1，用以配置家蠅幼蟲(chóng)餌料，80mL菌懸液加入60g麩皮，均勻攪拌，分別裝在玻璃瓶中.向每個(gè)玻璃瓶中投放200只剛剛孵化的家蠅1齡幼蟲(chóng)，25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng).之后每天觀察幼蟲(chóng)數(shù)量變化并統(tǒng)計(jì)存活率，最后觀察幼蟲(chóng)化蛹和羽化情況.每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.

1.8 MdAK 基因敲低效果分析

投喂表達(dá)MdAK dsRNA 的菌液后，于6，24，36h后各取6只家蠅幼蟲(chóng)，提取總RNA 并反轉(zhuǎn)錄，以βactin基因作為內(nèi)參，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)MdAK mRNA 表達(dá)量變化.設(shè)計(jì)目的基因定量引物MdAK－RT－F／R；內(nèi)參基因定量引物β－actin－F／R.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 程序：95 ℃2 min；95 ℃20s，60 ℃30s，30個(gè)循環(huán).實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果用相對(duì)定量2－ΔΔCt法進(jìn)行分析，用t檢驗(yàn)來(lái)比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異，P＞0.05則為無(wú)顯著差異，0.01＜P＜0.05為顯著差異，P＜0.01為極顯著差異.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 MdAK 序列分析

通過(guò)RT－PCR 克隆得到一段全長(zhǎng)為2 007bp的MdAKcDNA 序列，包含1 071bp的開(kāi)放閱讀框，可編碼356個(gè)氨基酸殘基（圖1）.利用ExPASy：ProtParam 程序分析，MdAK 蛋白理論分子質(zhì)量為40.0ku，理論等電點(diǎn)為5.91.利用Blastp程序在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行同源搜索，發(fā)現(xiàn)家蠅精氨酸激酶與黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）的精氨酸激酶氨基酸序列相似性較高（identity＝91%），于是將此基因命名為MdAK（Musca domesticaarginine kinase）.精氨酸激酶氨基酸序列多重比對(duì)結(jié)果表明：不同物種的精氨酸激酶氨基酸中第271～277位的序列CPTNLGT，62 位天冬氨酸（Asp）和193 位精氨酸（Arg）保守性較高（圖2）.CPTNLGT 是精氨酸激酶的活性中心序列，271位的半胱氨酸（Cys）是活性中心必需氨基酸.

2.2 RNAi處理后精氨酸激酶基因的表達(dá)變化

將PCR 擴(kuò)增得到的MdAK 基因片段克隆到L4440載體，由于克隆位點(diǎn)兩側(cè)各含有1個(gè)T7啟動(dòng)子，經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后，插入片段被雙向轉(zhuǎn)錄并在大腸桿菌HT115中形成dsRNA.提取細(xì)菌總RNA 進(jìn)行電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)L4440－MdAK 轉(zhuǎn)化菌株較L4440 轉(zhuǎn)化菌株明顯多出1 條亮帶（圖3），證明MdAK 雙鏈RNA 誘導(dǎo)成功.

利用投喂法對(duì)家蠅1齡幼蟲(chóng)MdAK 基因進(jìn)行了RNAi實(shí)驗(yàn)，將能表達(dá)MdAKdsRNA 的工程菌和空載對(duì)照菌分別添加到幼蟲(chóng)餌料中進(jìn)行投喂.為了檢測(cè)MdAK 基因的敲低效果，對(duì)進(jìn)行RNAi處理6，24，36h后的家蠅幼蟲(chóng)體內(nèi)MdAK 基因進(jìn)行定量研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RNAi處理組MdAK 基因表達(dá)被有效抑制，且在處理后36h的敲低程度達(dá)到80%以上（圖4）.

圖2 昆蟲(chóng)精氨酸激酶同源序列比對(duì)分析Fig.2 Multiple alignment of arginine kinases from insects

2.3 RNAi處理后家蠅存活率統(tǒng)計(jì)

RNAi處理家蠅幼蟲(chóng)1，2，3，4，5，6d后，統(tǒng)計(jì)家蠅的數(shù)量（圖5）.結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組家蠅幼蟲(chóng)在RNAi處理后第4天起開(kāi)始大幅死亡，第6天家蠅的死亡率達(dá)到80%以上，而對(duì)照組的死亡率較低，不到10%.同時(shí)發(fā)現(xiàn)RNAi處理后實(shí)驗(yàn)組家蠅化蛹率和羽化率也低于對(duì)照組，即使幼蟲(chóng)存活至羽化為成蠅，生長(zhǎng)速度也要比對(duì)照組慢很多，個(gè)體明顯要小于對(duì)照組，幼蟲(chóng)尾部常常發(fā)黑，活動(dòng)能力很差.

圖3 HT115總RNA電泳結(jié)果Fig.3 Total RNA electrophoretogram of HT115

圖4 RNAi干擾對(duì)精氨酸激酶基因mRNA表達(dá)的影響Fig.4 Relative expression level of MdAK mRNA at different time points after RNAi treatment

圖5 RNAi處理后家蠅幼蟲(chóng)的數(shù)量變化Fig.5 Changes in mortality rate of housefly after RNAi treatment

3 討論

精氨酸激酶是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)主要的磷酸原激酶，其在無(wú)脊椎動(dòng)物能量代謝上的重要作用已得到廣泛證實(shí).本研究利用RT－PCR 技術(shù)獲得了長(zhǎng)度為2 007bp的家蠅精氨酸激酶cDNA，編碼356個(gè)氨基酸.不同昆蟲(chóng)的精氨酸激酶的氨基酸序列雖有不同，但有較高的同源性，相似性都在70%以上，這表明精氨酸激酶在進(jìn)化上高度保守，同時(shí)也提示其功能的重要性.

精氨酸激酶是無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)不可缺少的、調(diào)節(jié)能量代謝的酶，且精氨酸激酶僅存在于無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)，哺乳動(dòng)物體內(nèi)肌酸激酶參與的代謝途徑與無(wú)脊椎動(dòng)物體內(nèi)精氨酸激酶參與的途徑不同.所以，精氨酸激酶可作為害蟲(chóng)防治的潛在靶點(diǎn).家蠅分布廣，繁殖能力強(qiáng)，免疫力強(qiáng)，生長(zhǎng)周期短，適于實(shí)驗(yàn)室研究.本研究，以家蠅作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)投喂表達(dá)dsRNA 的工程菌來(lái)敲低家蠅體內(nèi)精氨酸激酶基因的表達(dá)水平.大腸桿菌HT115為RNaseⅢ缺失突變菌株，有助于dsRNA 的穩(wěn)定表達(dá).基因定量結(jié)果顯示，投喂表達(dá)MdAK dsRNA 的大腸桿菌后，精氨酸激酶mRNA 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，同時(shí)發(fā)現(xiàn)家蠅的生長(zhǎng)發(fā)育受到了很大的影響，且幼蟲(chóng)存活率顯著降低.

dsRNA 分子較單鏈RNA 分子相對(duì)穩(wěn)定，噴灑到植物葉片上的dsRNA 能存留幾天［10－11］.這樣使得RNAi技術(shù)具有潛力成為害蟲(chóng)防治的有力工具.本研究證實(shí)dsRNA 可有效干擾家蠅體內(nèi)精氨酸激酶基因的表達(dá)，并能有效殺死家蠅，且該方法僅對(duì)節(jié)肢動(dòng)物等含有精氨酸激酶的生物有作用，不會(huì)影響其他生物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育，具有較高的安全性.化學(xué)農(nóng)藥的使用給環(huán)境和人類(lèi)健康帶來(lái)了不可估量的影響，尋求新的害蟲(chóng)防治手段具有重要的意義.隨著昆蟲(chóng)系統(tǒng)生物學(xué)和基因工程等學(xué)科的快速發(fā)展，針對(duì)害蟲(chóng)的特有基因設(shè)計(jì)特異性藥物已經(jīng)成為了害蟲(chóng)生物防治的重要研究方向，具有廣闊的應(yīng)用前景.

［1］ 王子見(jiàn) 吳秀萍 鄧洪寬，等.RNA 干擾技術(shù)在動(dòng)物寄生線蟲(chóng)研究中的局限性［J］.中國(guó)寄生蟲(chóng)學(xué)與寄生蟲(chóng)病雜志，2008，26（6）：476－479.WANG Zijian，WU Xiuping，DENG Hongkuan，et al.Limitations of the application of RNA interference in the study of animal parasitic nematodes［J］.Chinese Journal of Parasitology and Parasitic Diseases，2008，26（6）：476－479.

［2］ GUO Su，KEMPHUES K J.Par－1，agene required for establishing polarity in C.elegans embryos，encodes a putative Ser／Thr kinase that is asymmetrically distributed［J］.Cell，1995，81（4）：611－620.

［3］ FIRE A，XU Siqun，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double－stranded RNA in Caenorhabditis elegans［J］.Nature，1998，391（6669）：806－811.

［4］ BAUM J A，BOGAERT T，CLINTON W，et al.Control of coleopteran insect pests through RNA interference［J］.Nat Biotechnol，2007，25（11）：1322－1326.

［5］ DZITOYEVA S，DIMITRIJEVIC N，MANEV H.Intra－abdominal injection of double－stranded RNA into anesthetized adult Drosophila triggers RNA interference in the central nervous system［J］.Mol Psychiatry，2001，6（6）：665－670.

［6］ EATON B A，F(xiàn)ETTER R D，DAVIS G W.Dynactin is necessary for synapse stabilization［J］.Neuron，2002，34（5）：729－741.

［7］ TURNER C T，DAVY M W，MACDIARMID R M，et al.RNA interference in the light brown apple moth，Epiphyas postvittana（Walker）induced by double－stranded RNA feeding［J］.Insect Mol Biol，2006，15（3）：383－391.

［8］ UHLIROVA M，F(xiàn)OY B D，BEATY B J，et al.Use of Sindbis virus－mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad－Complex in insect metamorphosis［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100（26）：15607－15612.

［9］ SCOTT J G，LIU N，KRISTENSEN M，et al.A case for sequencing the genome of Musca domestica（Diptera：Muscidae）［J］.J Med Entomol，2009，46（2）：175－182.

［10］ TENLLADO F，BARAJAS D，VARGAS M，et al.Transient expression of homologous hairpin RNA causes interference with plant virus infection and is overcome by a virus encoded suppressor of gene silencing［J］.Mol Plant Microbe Interact，2003，16（2）：149－158.

［11］ TENLLADO F，MARTINEZ－GARCIA B，VARGAS M，et al.Crude extracts of bacterially expressed dsRNA can be used to protect plants against virus infections［J］.BMC Biotechnol，2003，3：3.