注射用復(fù)合維生素中草酸的HPLC法測定

李志偉，夏瑾，何慶國，趙麗榮，李瀟

（1.河北科技大學(xué) 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北愛爾海泰制藥有限公司，河北 石家莊 051000；3.石家莊市食品藥品監(jiān)督管理局，河北 石家莊 051000）

草酸，又名乙二酸，是人類代謝的終產(chǎn)物，不再分解.人體內(nèi)的草酸主要有2個(gè)來源：1）腸道吸收食物中的草酸；2）體內(nèi)代謝生成.尿草酸排泄量的60%以上為內(nèi)生性草酸.草酸的體內(nèi)生成主要基于2種形式：1）維生素C可不需酶的作用直接轉(zhuǎn)變成草酸，約占排出草酸的40%；2）由乙醛酸代謝產(chǎn)生，占40%～50%.由于維生素C可轉(zhuǎn)化為草酸，因此，認(rèn)為維生素C是草酸鈣結(jié)石的可能危險(xiǎn)因子.而高草酸血癥涉及骨、視網(wǎng)膜、動(dòng)脈血管中層、周圍神經(jīng)、皮膚和心臟.體內(nèi)草酸過多會影響心肌或傳導(dǎo)系統(tǒng)，并能誘發(fā)心力衰竭和致命性心律失常［1－2］.因此在注射用復(fù)方維生素中控制草酸很有必要.中國藥典［3］中采用滴定的方法檢測維生素C中的草酸，文獻(xiàn)［4－6］報(bào)道的草酸測定方法大多采用反相高效液相色譜法，以C18柱進(jìn)行分析，而注射用復(fù)合維生素中組分多，干擾對草酸的測定.本文建立了一種新的高效液相色譜法，用于注射用復(fù)合維生素中草酸殘留量的測定，該方法靈敏、準(zhǔn)確.

1 儀器與試劑

儀器：Agilent LC1260型液相色譜，配有G1311C1260型泵，G1314B1260型檢測器，柱溫箱，G1329F1260型自動(dòng)進(jìn)樣器.色譜柱為Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型）.

樣品：自制批號：20101001，20101002，20101003；草酸對照品：中國藥品生物制品檢定所，批號：101097－201101.

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

1）供試品試液的制備

取本品一瓶（約相當(dāng)于維生素C 200mg），置100mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液.

2）對照品試液的制備

取草酸對照品適量，精密稱定，加水溶解并定量稀釋制成每1mL中約含草酸10μg的溶液，作為對照品溶液.另分別取維生素C，維生素B1，維生素B2，甘氨酸，分別按照處方量配置各組分的溶液、空白溶劑.

2.2 色譜條件

色譜柱Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7 mm×150 mm 的強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型）.柱溫60 ℃；檢測波長210nm，流速0.6mL／min；進(jìn)樣量20μL.在此色譜條件下，各溶劑的保留時(shí)間見表1.各組分不干擾草酸的檢出，并且分離度均大于1.5，色譜圖見圖1.

圖1 各組分的液相色譜Fig.1 Chromatography of every compounds

表1 注射用復(fù)合維生素各組分出峰時(shí)間Tab.1 Retention time of Vitamin complex injection

2.3 線性實(shí)驗(yàn)

取草酸對照品，用水稀釋配置1.0mg／mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，逐步稀釋配置質(zhì)量濃度為50，40，30，20，10，5，1μg／mL的溶液，進(jìn)行分析，測定其線性關(guān)系，結(jié)果見表2，圖2.

表2 草酸的線性關(guān)系Tab.2 Liner relationship of oxalic acid

圖2 草酸的線性關(guān)系Fig.2 Linearity curve of oxalic acid

結(jié)果表明，草酸在1.0～50μg／mL的溶液中呈線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 8.逐步稀釋草酸溶液，進(jìn)樣量20μL，進(jìn)行檢測限和定量限測定，結(jié)果顯示在S／N＝3時(shí)的草酸檢測限為0.015μg／mL，在S／N＝10時(shí)的草酸定量限為0.065μg／mL.

2.4 精密度實(shí)驗(yàn)

配置6份10μg／mL的草酸溶液，分別進(jìn)行液相色譜分析，結(jié)果見表3.由表3可見此法精密度良好.

表3 草酸的精密度結(jié)果Tab.3 Precision result of oxalic acid

2.5 回收率實(shí)驗(yàn)

分別配制低（8.0μg／mL）、中10（μg／mL）、高（12μg／mL）3種不同質(zhì)量濃度的對照品溶液，以“2.1”項(xiàng)下的對照品溶液作為對照.精密稱取供試品適量，分別加入上述不同濃度的對照溶液適量溶解，進(jìn)行液相色譜分析，計(jì)算回收率.結(jié)果顯示，平均回收率為98.82%.

2.6 樣品測定

取長期留樣的樣品20101001，20101002，20101003按照上述方法進(jìn)行了草酸的測定.

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本品3 批樣品中草酸均低于定量限峰面積，小于積分值，因此認(rèn)為是未檢出，均不過0.2%，符合規(guī)定.

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

由于草酸屬于離子型化合物，因此選擇離子交換型的色譜柱易于其保留并與其他組分分離，分別考察了Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7 mm×150 mm 的強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型）、陰離子交換樹脂、SCX 等不同類型的色譜柱，結(jié)果表明，只有在Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型）色譜柱能夠?qū)崿F(xiàn)各個(gè)組分的分離，并且分離度均大于1.5.

3.2 流動(dòng)相的選擇

考察了不同濃度硫酸、磷酸等流動(dòng)相對分離度的影響，結(jié)果表明，在0.01mol／L的硫酸溶液中分離效果最好，并且各個(gè)組分均不干擾草酸的測定.

3.3 檢測波長的選擇

以0.01mol／L的硫酸為對照溶液，配置20μg／mL的溶液，進(jìn)行紫外分光光度計(jì)掃描結(jié)果見圖3.

圖3 草酸的吸收波長Fig.3 Absorption wavelength of oxalic acid

考慮到草酸為限度檢查，液相色譜檢測器的使用情況等，為了提高其檢測靈敏度，故選擇檢測波長為210nm.

3.4 柱溫的選擇

考慮到色譜柱ROA－Organic acid強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型）的最佳使用溫度，選擇了45，50，55，60 ℃等溫度下的分離情況，結(jié)果表明溫度升高，加快組分的洗脫，在不影響分離檢測的情況下，選擇60 ℃作為分析條件.

因此，最終確定的色譜條件：Phenomenex Rezex ROA－Organic acid 3.7mm×150mm 的強(qiáng)陽離子交換柱（H＋型），0.01mol／L硫酸溶液為流動(dòng)相，檢測波長為210nm，柱溫為60 ℃.

4 結(jié)論

建立了一種H＋陽離子交換的離子色譜分析方法，用于復(fù)合維生素中草酸的檢測，該方法有效地避免了維生素組分對草酸檢測的干擾，方法的專屬性好，靈敏度高，能有效地對實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，有望將該方法列入此類藥品中草酸檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法.

致謝：感謝河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院大學(xué)生自主實(shí)驗(yàn)室對本課題的支持.

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