延齡草正丁醇萃取物對大鼠非酒精性脂肪性肝病的改善作用及對抗氧化酶活性和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

陳顯兵，譚志鑫，覃芙蓉，朱曉靜，李金濤，何巧媛

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000；2.湖北民族學院醫(yī)學院，湖北恩施445000）

延齡草正丁醇萃取物對大鼠非酒精性脂肪性肝病的改善作用及對抗氧化酶活性和肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的影響

陳顯兵1，2，譚志鑫2，覃芙蓉2，朱曉靜2，李金濤2，何巧媛2

（1.生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北恩施445000；2.湖北民族學院醫(yī)學院，湖北恩施445000）

目的探討延齡草（TTM）正丁醇萃取物對非酒精性脂肪肝的治療作用，并探討其可能的作用機制。方法50只Wistar大鼠分成5組，正常對照組、高脂模型組、模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組。高脂模型組喂高脂飼料；給藥組喂高脂飼料4周后ig給予TTM正丁醇萃取物，每天1次，共6周。取大鼠肝組織HE常規(guī)染色及蘇丹Ⅲ染色觀察肝組織病理變化和肝脂肪變性程度。用全自動生化分析儀測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平及肝勻漿中谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）含量的變化。免疫組織化學法和RT-PCR測定肝組織葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）蛋白和mRNA表達。結(jié)果模型組肝脂肪變性程度、血清GPT和GOT活性、TC和TG水平及肝組織MDA含量均高于正常對照組（P＜0.05），肝組織GSH-Px含量明顯低于正常對照組（P＜0.05）。TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組肝組織脂肪變性程度、血清GPT和GOT活性和MDA含量均低于模型組（P＜0.05），各劑量組間無明顯差異。與正常對照組相比，模型組肝組織GRP78 mRNA和蛋白表達增加（P＜0.01）。與模型組相比，TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組肝組織GRP78 mRNA和蛋白表達明顯降低（P＜0.05），不同劑量組間無明顯差異。結(jié)論TTM正丁醇萃取物能有效減輕非酒精性脂肪肝大鼠肝損傷和脂肪變性程度，該作用可能與其提高非酒精性脂肪肝的抗氧化酶活性及降低肝組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用有關。

延齡草；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；脂肪肝，非酒精性；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激

DOl:10.3867/j.issn.1000-3002.2015.04.008

隨著經(jīng)濟的發(fā)展和生活水平的提高，非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）的發(fā)病率均達到相當高的水平，逐漸成為繼病毒性肝炎之外的第一大病因。NAFLD發(fā)病機制尚不十分清楚，但已有研究表明，線粒體呼吸活動增加，生成大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），增強肝組織氧化應激反應會嚴重危害肝功能［1］。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一種分子伴侶蛋白，在氧化應激時大量表達以維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定，被看作是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的標志性蛋白［2］。研究表明，ERS信號通路及其效應與NAFLD關系密切［3］。

目前，尚無治療藥物可根治NAFLD。因此，研發(fā)安全有效干預NAFLD的藥物具有重大意義。延齡草（Trillium tschonoskiiMaxim.，TTM）又名頭頂一顆珠，系百合科延齡草屬植物延齡草的干燥根莖（俗稱地珠）。作為土家族地區(qū)的珍稀植物，被土家族人奉為“神藥”。研究表明，TTM主要含甾體皂苷、黃酮苷及倍半萜苷等有效成分［4］，延齡草苷具有抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、提高免疫力、改善心功能和降壓以及抗衰老等作用［5-6］。本研究擬通過制備大鼠脂肪肝模型，觀察TTM正丁醇萃取物對NAFLD的影響，并探討其可能的作用機制，為TTM應用于NAFLD的預防及輔助治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、主要試劑和儀器

TTM于2013年9月采自巴東及神農(nóng)架林區(qū)，經(jīng)湖北民族學院醫(yī)學院中藥實驗室鑒定為延齡草（百合科延齡草屬）。藥材經(jīng)60℃恒溫烘箱干燥后粉碎，用75%乙醇浸泡24 h后回流提取，將提取液濾過并減壓濃縮、干燥，得TTM總提取物。然后加適量去離子水至總提取物全部溶解，水飽和的正丁醇萃取，減壓濃縮干燥，得TTM正丁醇萃取物。延齡草苷對照品（≥98%），北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術研究院，延齡草苷對照品制作標準曲線，紫外光分光光度計波長550 nm測定TTM總皂苷含量為14.72 mg·g-1正丁醇萃取物。

谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione eroxidase，GSH-Px）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；總膽固醇（total cholesterol，TC）和甘油三酯（triglycerides，TG）檢測試劑，美國Beckman公司；兔抗大鼠GRP78抗體，武漢博士德生物工程有限公司；GRP78和GAPDH引物由上海生物工程公司合成，GRP78引物：5′-TCTGGTTGGCGGATCTACTC-3′（上游），5′-TC-TTTTTGTCAGGGGTCGTTC-3′（下游）；GAPDH：5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′（上游），5′-AGGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′（下游），擴增產(chǎn)物長度分別為345和723 bp；Trizol提取試劑盒和RT-PCR試劑盒，上海生物工程公司。Mastercycler pro PCR擴增儀，德國Eppendorf公司；Leica 1850冰凍切片機，Leica 2245石蠟切片機，德國Leika公司；HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)，武漢千屏有限技術公司。

1.2 實驗動物、分組及處理

健康12周齡Wistar大鼠50只，由湖北省實驗動物中心提供，動物許可證號：SCK（鄂）2008-0014，雌雄不限，體質(zhì)量150～180 g，常規(guī)喂養(yǎng)1周后分為正常對照組（普通飼料喂養(yǎng)）、高脂模型組（在普通飼料中添加膽固醇2%、豬油10%和雞蛋5%）、模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1（高脂飼料喂養(yǎng)4周后開始ig給藥，每天1次，持續(xù)6周）。正常對照和模型組給予相同體積蒸餾水。按上述要求，每組10只分籠飼養(yǎng)，自由飲水。喂養(yǎng)10周后，禁食12 h，心臟取血，4℃，1200×g離心15 min制備血清。處死大鼠，迅速取出肝組織，在左肝葉同一部位，分成3份，一份用4℃生理鹽水沖洗，濾紙吸干后，以4%多聚甲醛溶液固定，用于HE染色觀察肝組織結(jié)構(gòu)；一份立即制作冰凍切片，進行蘇丹Ⅲ染色，用于觀察脂肪變性程度；剩余組織-80℃保存，用于抗氧化酶活性和GRP78 mRNA等檢測。

1.3 一般情況的觀察

實驗前后觀察各組大鼠體質(zhì)量、毛發(fā)及死亡情況。

1.4 肝外觀、組織病理變化和脂肪變性的觀察

觀察各組大鼠肝外觀形態(tài)、體積、顏色及質(zhì)地的變化，并將上述肝組織常規(guī)HE染色和蘇丹Ⅲ染色。①4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色觀察炎細胞浸潤及纖維化程度。②蘇丹Ⅲ染色觀察肝脂肪變性。分級標準參考中華肝臟病學會脂肪肝和酒精性肝病學組《非酒精性脂肪肝診斷標準》［7］：肝小葉內(nèi)脂肪變性的肝細胞占小葉1/3～1/2為輕度脂肪肝，用“+”表示；占小葉1/2～2/3為中度脂肪肝，用“++”表示；占小葉2/3以上或肝細胞彌漫脂肪變性者為重度脂肪肝，用“+++”表示。每張病理切片隨機取5個高倍視野，進行計算。

1.5 肝功能和血脂檢測

運用全自動生化分析儀檢測大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（glutamic-pyruvic transaminase，GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶〔glutamic-oxal（o）acetic transaminase，GOT〕活性，以及TC和TG的水平。

1.6 肝組織GSH-Px和MDA含量測定

取-80℃凍存肝組織約1g，在冰浴中用EDTAPBS緩沖液（pH 7.4）制成10%的勻漿，447.2×g離心，取上清測GSH-Px和MDA含量。測定方法均按試劑盒說明書操作，GSH-Px和MDA測定分別采用二硫代二硝基苯甲酸法和硫代巴比妥酸法。

1.7 免疫組織化學染色檢測肝細胞GRP78蛋白表達

采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化法（SP）法，DAB顯色，一抗GRP78的工作濃度為1∶100，操作流程按試劑說明書進行。分別在光鏡下觀察10個以上高倍視野對每張切片染色進行初步判定，每張切片隨機攝取3個高倍（×400）視野，輸入計算機，應用HPIAS-1000病理圖文分析系統(tǒng)進行處理，計算染色陽性面積積分光密度。

1.8 RT-PCR檢測肝組織中GRP78 mRNA表達

用Trizol試劑盒提取總mRNA。采用Trizol一步法提取總RNA，按照RNA純化試劑盒說明書進行純化。紫外分光光度計檢測RNA，配置200 g·L-1的RNA樣品稀釋液50 mL。取5 mL RNA稀釋液按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，稀釋后備用。反應條件：94℃預變性2 min，94℃變性30 s，退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；取擴增產(chǎn)物4 μL上樣于1.5%瓊脂糖凝膠（含EB 0.5 g·L-1），100 V電泳30 min，將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)攝像，計算GRP78與GAPDH基因擴增條帶積分吸光度的比值表示GRP78 mRNA表達的相對水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠整體情況的影響

各組大鼠均無死亡，進食飲水均可，毛發(fā)光潔。實驗前后各組大鼠體質(zhì)量變化無統(tǒng)計學意義（數(shù)據(jù)略）。

2.2 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠肝外觀、肝組織病理變化和脂肪變性的影響

正常對照組大鼠肝呈暗紅色，質(zhì)地柔軟，包膜光滑；模型組大鼠肝體積增大，邊緣略飽滿，呈淡黃色；各給藥組較模型組有所改善。

HE染色結(jié)果（圖1）表明，正常對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整、清晰（圖1A）；模型組肝組織脂肪變性的肝細胞占肝小葉2/3以上，為重度脂肪變，肝細胞體積增大，排列紊亂，細胞內(nèi)充滿以小空泡為主的混合性空泡，部分伴肝細胞水樣變（圖1B）；模型+TTM正丁醇萃取物組較模型組病變有明顯減輕。

蘇丹Ⅲ染色結(jié)果（圖2，表1）表明，正常對照組肝細胞漿內(nèi)無脂肪變性（圖2A）；模型組見彌漫性紅色脂滴，肝細胞脂肪變性加重（圖2B）（P＜0.01）；模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組肝內(nèi)脂滴數(shù)量減少，脂肪變性較模型組減輕（圖2C～E）（P＜0.05，P＜0.01），但組間無顯著差異。

2.3 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠肝功能和血脂的影響

由表2可見，與正常對照組比較，模型組大鼠血清GPT和GOT明顯升高，說明模型組大鼠肝受到損傷；模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組與模型組比較GOT明顯下降（P＜0.01），GPT變化不明顯。與正常對照組比較模型組血清TC和TG明顯升高（P＜0.01），模型+TTM正丁醇萃取物100 mg·kg-1組與模型組比較TG降低（P＜0.05），TC無明顯變化。

Fig.1 Effect of n-butylethyl extract from Trillium tschonoskii Maxim（TTM）on liver pathological changes in model rats with non-alcoholic fatty liver disease（NAFLD）（HE staining×400）.The rats were fed with high-fat forage and 4 weeks later simultaneously ig administered with n-butylethyl extract from TTM 100 mg.kg-1，once a day，for 6 weeks.A：normal control group；B：model group；C：model+n-butylethyl extract from TTM 100 mg·kg-1group.The arrows show necrosis or edema of hepatocytes.

Fig.2 Effect of n-butylethyl extract from TTM on liver fatty degeneration of model rats with NAFLD（SudanⅢstaining×400）.See Fig.1 for the rat treatment.A：normal control group；B：model group；C，D and E：model+n-butylethyl extract from TTM 50，100 and 200 mg·kg-1group，respectively.The arrows show fatty drops of liver tissue.

Tab.1 Effect of n-butylethyl extract of TTM on liver fatty degeneration of model rats with NAFLD

Tab.2 Effect of n-butylethyl extract from TTMon liver function and blood lipid of NAFLD rats

2.4 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠肝組織GSH-Px和MDA變化的影響

由表3所見，與正常對照組相比，模型組肝組織中MDA含量顯著升高，GSH-Px含量降低（P＜0.01）；與模型對照組相比，模型+TTM正丁醇萃取物100和200 mg·kg-1組MDA含量降低，GSH-Px含量升高（P＜0.05，P＜0.01），但組間無顯著性差異。

2.5 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠肝細胞GRP78蛋白表達的影響

GRP78表達定位于肝細胞胞漿，呈棕黃色顆粒狀或團塊狀。正常對照組肝細胞內(nèi)GRP78蛋白表達不明顯，模型組肝細胞內(nèi)GRP78表達明顯增強（P＜0.01），尤以中央靜脈周圍脂肪變性嚴重的肝細胞更突出；模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組肝細胞內(nèi)GRP78表達較模型組減弱（P＜0.05），不同劑量給藥組間無顯著性差異（圖3）。

Tab.3 Effect of n-butylethylextract from TTM on glutathione peroxidase（GSH-Px）and malondialdehyde（MDA）of model rats with NAFLD

Fig.3 Effect of n-butylethyl extract from TTM on glucose regulated protein 78（GRP78）expreesion in liver tissue of rats with NAFLD（IHC staining×400）.See Fig.1 for the rat treatment.A：normal control group；B：model group；C-E：model+n-butylethyl extract from TTM 50，100 and 200 mg·kg-1group，respectively.B was the semiquantitative result of A-E.n=10.＊P＜0.05，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

2.6 TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠肝組織GRP78 mRNA表達的影響

RT-PCR實驗結(jié)果（圖4）表明，與正常對照組比較，模型組肝組織內(nèi)GRP78 mRNA表達明顯增強（P＜0.01）；模型+TTM正丁醇萃取物50，100和200 mg·kg-1組肝組織GRP78 mRNA表達較模型組減弱（P＜0.05），不同劑量給藥組間無顯著性差異。

Fig.4 Effect of n-butylethyl extract from TTM on expression of GRP78 mRNA in liver tissue of rats with NAFLD by RT-PCR.See Fig.1 for the rat treatment.1：normal control group；2：model control group；3-5：model+nbutylethyl extract from TTM 50，100 and 200 mg·kg-1，respectively. B was the semiquantative result of A.，compared with normal control group；#P＜0.05，compared with model group.

3 .討論

NAFLD是一種無過量飲酒史，以肝細胞脂肪變性和脂質(zhì)貯積為特征的臨床病理綜合征。目前，在歐美發(fā)達國家NAFLD已被公認為是最普遍的肝臟疾病。美國的流行病學調(diào)查結(jié)果表明其發(fā)病率接近20%［8］，遠遠超過丙型肝炎或酒精性肝病的發(fā)病率。隨著社會經(jīng)濟的發(fā)展，人民生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的變化，非酒精性脂肪肝病在我國發(fā)病率也在逐年升高［9］。

自從NAFLD被發(fā)現(xiàn)至今，人們對其發(fā)病機制尚未完全明了，現(xiàn)今雖然有很多關于NAFLD發(fā)病機制的理論，但都還停留在假說階段。Day等[10］提出的“二次打擊”學說在目前學術界得到較為普遍的認可。由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能異常導致的ERS對脂質(zhì)代謝有重要調(diào)控功能，而脂類中的膽固醇、飽和脂肪酸攝入過多可能是誘導ERS致NAFLD的重要原因。另研究表明，NAFLD的發(fā)病機制與脂質(zhì)過氧化和氧化應激密切相關［11］，而這也是引起ERS的重要因素。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血脂（TC和TG）及血清GPT和GOT均較正常對照組升高，血清及肝勻漿內(nèi)GSH-Px含量均低于正常對照組，MDA含量顯著高于正常對照組，表明肝內(nèi)抗氧化反應酶活性降低，同時脂質(zhì)過氧化反應增強，提示氧化應激和脂質(zhì)過氧化反應可能參與NAFLD的發(fā)生。

近年來，對ERS信號通路及效應在代謝綜合征中的研究十分廣泛［12-13］，而細胞內(nèi)氧化應激可破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和誘導ERS，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是脂肪酸代謝的第一場所，同時發(fā)現(xiàn)脂肪酸在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)代謝會生成一定量的ROS，而ROS又是ERS的重要誘發(fā)因素，ROS和ERS聯(lián)合介導細胞的凋亡過程［14-15］。氧化應激能啟動鈣從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池的釋放，導致線粒體內(nèi)鈣積聚，這進一步增加了ROS的生成，放大氧化應激及鈣負載，引起惡性循環(huán)。GRP78是ERS的標志性蛋白，其表達增加能維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的穩(wěn)定［16］，引導蛋白質(zhì)正確折疊，改善細胞生理狀態(tài)，起到暫時保護細胞、延緩炎細胞浸潤等作用［17］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高脂飲食引起的NAFLD大鼠肝組織GRP78表達增加，提示高脂飲食誘導了肝ERS。TTM正丁醇萃取物干預后，可降低肝細胞GRP78蛋白和肝組織GRP78 mRNA表達，減輕由氧化應激引起的ERS，對脂肪肝有一定的治療作用。但究竟是ERS異常進而引起NAFLD的發(fā)生發(fā)展，還是脂質(zhì)代謝障礙引起ROS生成增多加劇脂肪變性，從而導致肝細胞凋亡促使NAFLD的發(fā)生，尚待深入研究。

綜上所述，TTM正丁醇萃取物對NAFLD大鼠脂肪肝有一定的改善作用，其作用機制可能與提高機體抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化反應、降低肝組織GRP78蛋白表達，以及減輕肝細胞ERS有關。

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Efficacy of N-butylethyl extract from Trillium tschonoskii Maxim for non-alcoholic fatty liver disease of rats and its effect on activity of antioxidant enzymes and endoplasmic reticulum stress in liver tissue

CHEN Xian-bing1，2，TAN Zhi-xin2，QIN Fu-rong2，ZHU Xiao-jing2，LI Jin-tao2，HE Qiao-yuan2
（1.Key Laboratory of Biologic Resource Protection and Utilization of Hubei Province，Enshi 445000，China；2.College of Medicine，Hubei Institute for Nationalities，Enshi 445000，China）

OBJECTlVETo investigate the efficacy of n-butylethyl extract fromTrillium tschonoskiiMaxim.（TTM）for non-alcoholic fatty liver disease and its possible mechanism.METHODSFifty Wistar rats were randomly divided into 5 groups：normal control group，model group fed with high-fat diet，experimental groups fed with high-fat forage and 4 weeks later ig coadministered with n-butylethyl extract from TTM 50，100 and 200 mg·kg-1，respectively，once a day，for 6 weeks.The pathological changes and pimelosis level of liver tissue were investigated by HE staining and SudanⅢstaining，respectively.The activity of serum glutamic-pyruvic transaminase（GPT）and glutamic-oxal（o）acetic transaminase（GOT），the level of blood total cholesterol（TC）and triglycerides（TG），the content of glutathione peroxidase（GSHPx）and malonyldialdehyde（MDA）in liver tissues were analyzed respectively by auto-biochemical instrument.The mRNA and protein expression of hepatic glucose regulated protein 78（GRP78）in liver tissue was detected by immunohistochemical assay and RT-PCR.RESULTSThe degree of fatty degeneration，activity of serumGPT and GOT，level of blood TCand TG，and content of MDAin liver tissue in model group were obviously higher than in normal control group（P＜0.05），while the level of GSH-Px in model group was lower than that of normal control group（P＜0.05）.Compared with model group，the fatty degenertion degree，level of GPT，GOT，TC，TG and MDA became significantly lower and the expression decreased in n-butylethyl extract from TTM 50，100 and 200 mg·kg-1groups（P＜0.05），but there was no significant difference in the degree of change between the groups of different doses.Moreover, the expression of GRP78 mRNA and protein in liver tissue in model group was higher than that in normal control group（P＜0.01）.CONCLUSlONn-Butylethyl extract from TTM can effectively prevent liver cell injury and reduce fatty degeneration of the liver in NAFLD rats.This effect may be related to the increase of antioxidant enzyme activity and reduction of endoplasmic reticulum stress in liver tissue.

Trillium tschonoskiiMaxim.；glucose regulated protein 78；fatty liver，non-alcoholic；endoplasmic reticulum stress

The project supported by Key Laboratory of Biologic Resource Protection and Utilization of Hubei Province（PKLHB1308）；and Hubei Provincial Bureau of Education（D20131904）

CHEN Xian-bing,E-mail:chenxianbing7612＠163.com，Tel：（0718）8437479

R285.5

A

1000-3002（2015）04-0578-07

2015-01-15接受日期：2015-07-21）

（本文編輯：齊春會）

生物資源保護與利用湖北省重點實驗室項目（PKLHB1308）；湖北省教育廳科學技術重點項目（D20131904）

陳顯兵（1976-），男，碩士，副教授，主要從事中藥藥理學研究。

陳顯兵，E-mail：chenxianbing7612＠163.com，Tel:（0718）8437479