異丙腎上腺素對大鼠心臟功能的動態(tài)影響

左 琳,宋 峰,趙 銳,李端端,石山慧,賀忠梅,劉慧榮

異丙腎上腺素對大鼠心臟功能的動態(tài)影響

左 琳1,2,宋 峰1,趙 銳3,李端端1,2,石山慧1,2,賀忠梅1,2,劉慧榮4

目的觀察異丙腎上腺素(ISO)對在體大鼠心臟功能、心室肌細胞功能以及胞內(nèi)相關(guān)下游蛋白表達的動態(tài)影響。方法采用血流動力學方法及乳鼠心肌細胞培養(yǎng),觀察ISO對在體及離體大鼠心肌收縮能力的影響;通過Fura-2熒光探針法觀察ISO對成鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣水平的影響;Western blot檢測ISO下游胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達水平的變化。結(jié)果(5～500)nmo l/L ISO對成鼠在體心功能有一個劑量依賴性增強效應(yīng),100 nmo l/L為其最佳實驗濃度:0.1μm o I/LISO作用大鼠心室肌細胞(1 000～1 200)s,胞內(nèi)游離鈣水平達高峰。0.1μmo I/LISO作用于乳鼠心肌細胞30min可使其跳動頻率達高峰,維持至60min后開始下降,與胞內(nèi)鈣變化規(guī)律一致。心室肌細胞內(nèi)鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ(Calm odulin kinaseⅡ,CaMKⅡ)水平在ISO干預后3 h達高峰;G蛋白偶聯(lián)受體激酶2 (GRK2)和β-arrestin也在ISO作用后48 h達高峰。結(jié)論 ISO可通過興奮胞內(nèi)Ca2+_CaMKⅡ信號通路參與心肌細胞功能活動的動態(tài)調(diào)節(jié);同時,ISO長期作用可升高胞內(nèi)GRK2-β-arrestin水平,參與受體的脫敏調(diào)節(jié)。

異丙腎上腺素;細胞內(nèi)游離鈣;心臟功能;鈣調(diào)蛋白激酶Ⅱ;G蛋白偶聯(lián)受體激酶2;β-arrestin

在心肌重構(gòu)以及心衰的發(fā)生、發(fā)展過程中。體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)的長期持續(xù)升高是導致以上病理改變的主要原因[1]。長期持續(xù)存在的兒茶酚胺類物質(zhì)可通過興奮β1-腎上腺素受體(β1-AR),導致細胞內(nèi)過去第二信使環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平的升高[2],激活蛋白激酶A(Pro tein Kinesse A,PKA)及下游信號通路引起心臟重塑、心功能降低,以致心力衰竭等嚴重后果[3]。

異丙腎上腺素(ISO)作為兒茶酚胺類物質(zhì)的一種,可以同時作用于β1-AR和β2-AR[2],其中對于心臟的作用以興奮β1-AR為主。醫(yī)學基礎(chǔ)研究中,ISO常被用于心律失常[4]及心肌重構(gòu)[5]動物模型的制備,它同時也是實驗最常用的β-AR激動劑。體內(nèi)兒茶酚胺類物質(zhì)長期作用會導致其靶受體的脫敏[6]。具有類激動劑樣作用的β1-腎上腺素受體自身抗體(β1-AAbs)和ISO的作用類似[7],二者都可以激動β1-AR。本研究以ISO為切入點,觀察ISO對大鼠心功能的動態(tài)影響,以及其下游信號通路的變化情況,以期為ISO的基礎(chǔ)實驗應(yīng)用提供資料。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性成年W istar大鼠及乳鼠,由山西醫(yī)科大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 血流動力學測定[8]健康成年雄性SD大鼠20只,隨機分為ISO處理組和PBS組。2%三溴乙醇(阿佛丁)腹腔麻醉后,沿頸部前正中線做一縱向切口,將帶有探頭的導管(TX)通過右頸總動脈進入左心室腔,通過左側(cè)頸外靜脈給入不同濃度的ISO,記錄大鼠心功能的各項參數(shù):心率、室內(nèi)壓上升和下降的最大速率(±dp/dtmax)。

1.2.2 乳鼠心肌細胞培養(yǎng) 出生(2～3)d的SD大鼠,采用組織塊酶解法分離單個心肌細胞[9]。用F10完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清,1%青鏈霉素)重懸細胞,按照1×106的密度接種于6孔板上,第二天施加處理因素,收集細胞用于Western blot實驗。

1.2.3 胞內(nèi)游離鈣測定 采用Langendorff離體心臟灌流法分離單個心室肌細胞[10]。將分離獲得的單個心室肌細胞與鈣離子熒光指示劑Fura 2-AM(5 μm o l/L)避光孵育30min(37℃),PBS洗滌后,采用O lym pus FV1000采集ISO給藥前后胞內(nèi)游離鈣水平的動態(tài)變化,用蔡司LSM 5軟件分析胞內(nèi)游離鈣熒光強度的平均值(F值)。

1.2.4 Western b lo t[11]培養(yǎng)的乳鼠心肌細胞加入ISO(終濃度0.1μmo l/L),分別作用0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h后收集細胞標本,用4%～ 20%的梯度膠進行電泳;TBS-T洗膜后加顯影劑(超敏發(fā)光液,App lygentechno logies Inc,北京),用KODAK X-OMAT blue Autoradiography進行顯影。

2 結(jié) 果

2.1 ISO可劑量依賴性引起大鼠在體心功能的增強隨著ISO劑量的增加,心功能逐漸增強。100 nmol/L ISO可使+dp/dtmax增加到(10 183±564.4)mmHg/s,顯著高于PBS組(6 279±625.3 mmHg/s,P<0.05);同時,可使-dp/dtmax增加到(-8 163±475.2)mmHg/s,顯著高于PBS組(-4 818±448.2 mmHg/s,P<0.05)。同時,ISO對心率也產(chǎn)生一個劑量依賴性的增強作用。在100 nmo l/L時,ISO可顯著增加大鼠的心率(621± 7.8次/min,vs 507±11.7次/min PBS,P<0.05)。在ISO濃度達到100 nm ol/L以上時,其對心功能的增強作用逐漸減緩。詳見圖1。

2.2 ISO可誘發(fā)成鼠心肌細胞內(nèi)游離鈣水平先升高后降低 0.1μm o l/L ISO可對單個心室肌細胞0內(nèi)游離鈣水平產(chǎn)生一過性增強效應(yīng)。加入ISO后400 s可出現(xiàn)游離鈣水平的升高(612±34 vs PBS組509±13, P<0.05);1 000 s達到高峰(1 104±34 vs PBS組525±19,P<0.05),并維持約200 s;此后,游離鈣水平開始快速下降;在ISO作用1 400 s時基本接近基線水平(719±19 vs PBS組530±14,P<0.05)。詳見圖2。

2.3 ISO可導致乳鼠心肌細胞跳動頻率先增快后減慢的動態(tài)性改變 通過乳鼠心肌細胞跳動頻率(圖3A)的觀察來進一步驗證ISO的作用特點是否具有脫敏性。用ISO組與PBS組心率的比值來表示。0.1 μm o l/L ISO作用于跳動的乳鼠心肌細胞后,可時間依賴性增強心肌細胞的跳動頻率,該效應(yīng)在ISO作用后的30 min達高峰(2.46±0.10,P<0.05,vs PBS組,圖3B),并維持至60 min(2.46±0.07,P<0.05,vs PBS組);此后,ISO對心肌細胞跳動頻率的影響逐漸減弱,在作用后72 h基本恢復至基礎(chǔ)水平。詳見圖3。

圖1 ISO對成鼠心功能影響的血流動力學影響

圖2 ISO對成鼠心肌細胞胞內(nèi)游離鈣水平的影響

圖3 ISO對乳鼠心肌細胞跳動頻率的影響

2.4 ISO可導致乳鼠心肌細胞中CaMKⅡ、GRK2及β-arrestin蛋白水平漸增高后降低 Western blot檢測結(jié)果顯示:0.1μm o l/L ISO作用于乳鼠心肌細胞后,可在作用后3顯著升高細胞內(nèi)CaMKⅡ水平(0.48± 0.004,P<0.05,vs 0.27±0.004 0 h),此后CaMKⅡ水平逐漸下降,在24 h時接近給藥前水平(0.26± 0.004,P>0.05,vs 0 h),并一直維持至48 h;72 h的CaMKⅡ的胞內(nèi)水平略有下降,低于給藥前水平(0.17± 0.005,P<0.05,vs 0 h)。細胞內(nèi)GRK2水平在ISO作用后3h開始顯著升高(0.57±0.0 06,P<0.05,vs 0 h 0.48±0.002),并在48 h達到高峰(0.88± 0.005,P<0.05,vs 0 h),72 h時GRK2略低于給藥前水平(0.46±0.002,P>0.05,vs 0 h)。β-arrestin的檢測結(jié)果顯示:在ISO作用后的觀察時間內(nèi),β-arrestin水平從3 h開始升高(0.42±0.004,P<0.05,vs 0h 0.38±0.0 06),48 h達高峰(0.5 3± 0.003,P<0.05,vs 0 h),72 h時β-arrestin水平開始下降(0.44±0.011,P<0.05,vs 0 h)。詳見圖4。

圖4 ISO對乳鼠心肌細胞內(nèi)CaMkⅡ、GRK2以及βa-rrestin表達的影響

3 討 論

心衰過程中,體內(nèi)存在兒茶酚胺類物質(zhì)升高現(xiàn)象[12],這些物質(zhì)長期存在會通過興奮心肌細胞膜表面的β1受體引起心臟正性調(diào)節(jié)作用[13],但其在體內(nèi)長期高水平存在時,機體會保護性下調(diào)位于心肌細胞膜表面的β1受體密度[14],以此來對抗兒茶酚胺類物質(zhì)的作用,也稱為脫敏現(xiàn)象。ISO也是一類重要的兒茶酚胺類物質(zhì)[15]。在基礎(chǔ)實驗研究中,其常被用作β受體激動劑[16],但多數(shù)研究只把ISO當做對照,而對ISO生物學功能的研究常常不夠深入,其脫敏現(xiàn)象的動態(tài)變化規(guī)律尚不十分清楚。

為了研究ISO對大鼠心肌細胞的脫敏性生物學效應(yīng)及其可能的機制,本實驗觀察了ISO對正常大鼠在體心功能的劑量依賴性效應(yīng),結(jié)果表明:在(5～500) nmol/L濃度范圍內(nèi),ISO對成鼠心功能有一個劑量依賴性的增強效應(yīng)。在ISO濃度達到100 nmol/L時,± dp/d t以及心率的升高幅度都基本接近峰值;在500 nmol/L時,心功能增強已不十分顯著。這與已有的研究報道相一致[17]。ISO對成年大鼠在體心功能有一個劑量依賴性的增強作用;100 nmol/L的ISO可產(chǎn)生比較顯著的增強效應(yīng),因此,在接下來的實驗中會以該濃度作為觀察濃度。

Ca2+是和心肌收縮密切相關(guān)的偶聯(lián)因子,其胞內(nèi)水平的高低直接影響心肌收縮力的強弱[18]。本研究采用離子成像技術(shù),觀察了100 nmol/L ISO對成鼠心室肌細胞內(nèi)游離鈣水平的影響,100μmo l/L ISO作用400s時,胞內(nèi)游離鈣水平開始顯著升高;在(1000～ 1 200)s時達高峰,此后又逐漸降低。ISO對在體心功能的增強效應(yīng)是通過增加胞內(nèi)游離鈣水平實現(xiàn)的。與此同時,Ca2+下游的重要調(diào)節(jié)蛋白CaMKⅡ的水平在ISO干預后3 h達高峰,此后逐漸下降。ISO的作用可使收縮期內(nèi)流進入細胞內(nèi)的鈣離子增多,其一方面可以直接通過和肌鈣蛋白結(jié)合誘發(fā)肌肉收縮的增強[19];同時Ca2+還可與鈣調(diào)蛋白結(jié)合,并活化下游的CaMKⅡ[20],有可能參與了心肌肥厚[21]、心律失常[22]以及心肌頓抑等疾病的發(fā)生發(fā)展過程。但在ISO作用1 200 s后,胞內(nèi)游離Ca2+開始下降,出現(xiàn)這一變化的機制尚不十分清楚。

為了搞清楚ISO細胞內(nèi)游離鈣水平下降的原因,通過乳鼠心肌細胞培養(yǎng)動態(tài)觀察了ISO對乳鼠心肌細胞跳動頻率的影響。0.1μm o l/L ISO亦可導致乳鼠心肌細胞跳動頻率的增加。在ISO干預后30 min,乳鼠心肌細胞的跳動頻率達高峰,該效應(yīng)維持至60 min后開始下降,在ISO作用72 h后,乳鼠心肌細胞跳動頻率基本接近靜息水平。這與以往的研究相一致[23],同時也能解釋ISO對大鼠在體心功能影響的變化規(guī)律,但由于在體及離體實驗條件的差異,因此,關(guān)鍵作用時間點并不完全重疊。

在心肌細胞膜受體脫敏研究中存在兩個關(guān)鍵蛋白,即GRK2和β-arrestin。GRK2作為一種激酶,可以磷酸化底物蛋白-G蛋白-上的特定位點,使之不能與G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)結(jié)合,反而與β-arrestin結(jié)合,終止了GPCRs下游G蛋白信號的轉(zhuǎn)導;而結(jié)合了GPCRs的β-arrestin可作為銜接蛋白進一步結(jié)合網(wǎng)格蛋白和β2銜接蛋白,形成內(nèi)吞小窩,在動力蛋白Dynamin的幫助下形成胞吞囊泡,促進GPCRs的內(nèi)化和脫敏[24]。因此,GRK2和β-arrestin表達的改變可在一定程度上代表GPCRs內(nèi)化的程度。針對ISO干預后出現(xiàn)以上脫敏現(xiàn)象的可能原因,對ISO干預乳鼠心肌細胞后不同時間點的胞內(nèi)相關(guān)蛋白水平進行了檢測,參與受體脫敏調(diào)節(jié)的蛋白GRK2和β-arrestin也在ISO作用后出現(xiàn)了表達水平的上調(diào),其中GRK2和β-a rrestin均在ISO作用4 8 h達高峰,此后開始下降。

ISO作為經(jīng)典的β-AR激動劑,對心臟的早期效應(yīng)表現(xiàn)為通過增加細胞內(nèi)游離鈣水平,產(chǎn)生正性調(diào)節(jié)作用,該效應(yīng)具有劑量依賴性;ISO對心臟的晚期效應(yīng)表現(xiàn)為生物學功能的脫敏,主要是由于胞內(nèi)GRK2及β-a rrestin蛋白表達增加導致了該現(xiàn)象的發(fā)生。對于ISO作用后,心肌細胞膜表面β1-AR的密度及親和力的改變將是進一步研究的重點。

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R285 R255

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.05.011

1672-1349(2015)05-0589-05

2014-06-30)

(本文編輯 王雅潔)

國家自然科學基金青年基金資助項目(No.81200120);山西省回國留學人員科研資助項目(No:2014-036);山西醫(yī)科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室主任基金(No.2010-14)

1.山西醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學系(太原030001);2.山西醫(yī)科大學細胞生理學省部共建教育部重點實驗室;3.山西省兒童醫(yī)院臨床醫(yī)學檢驗中心;4.首都醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理學與病理生理學系

劉慧榮,E-m ail:liuihr2000@126.com