乳與乳制品中三聚氰胺快速檢測方法

王玉英，柴艷兵，張耀廣，趙媛媛，張玉娟，閆立紅（石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司質(zhì)量管理中心，河北石家莊050021）

乳與乳制品中三聚氰胺快速檢測方法

王玉英，柴艷兵，張耀廣，趙媛媛，張玉娟，閆立紅
（石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司質(zhì)量管理中心，河北石家莊050021）

摘要：研究了高效液相色譜法檢測乳與乳制品中三聚氰胺的檢測方法。采用三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色譜測定。該方法的檢出限為0.5mg/kg，相對標準偏差為1.09%～1.99%，回收率在95.15%～99.12%之間。與GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》第一法高效液相色譜法（HPLC法）相比，處理時間縮短了約3 h。關鍵詞：高效液相色譜；三聚氰胺；乳；乳制品

三聚氰胺（英文：Melamine）（化學式：C3H6N6），俗稱密胺、蛋白精，IUPAC命名為“1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺”，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機化合物，被用作化工原料。三聚氰胺含氮量很高（66%），加之生產(chǎn)工藝簡單、成本很低，在采用凱氏定氮法測定粗蛋白時，可提高表觀粗蛋白含量；不法生廠商為了降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益，在奶粉中加入三聚氰胺；一次大量攝入或長期攝入三聚氰胺會造成生殖、泌尿系統(tǒng)的損害，形成膀胱、腎部結(jié)石，并可進一步誘發(fā)膀胱癌。

自2008年以來，報道的三聚氰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法[1-14]、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[15-18]氣相-質(zhì)譜法[19-21]、液相-質(zhì)譜法[22]、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法[23-25]、離子交換色譜-紫外檢測法[26]、酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）[27]等。在這些方法中，高效液相色譜法的樣品處理方法通常要過固相萃取小柱，氣相-質(zhì)譜、液相-質(zhì)譜、液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜方法中樣品必須衍生化，其前處理方法時間長，且檢測費用較高。ELISA方法檢測費用較高。本試驗建立了HPLC的快速、靈敏、準確的檢測方法，檢測費用低，樣品處理時間短，僅需20min。本方法可完全滿足乳與乳制品安全檢測的需要。

1　材料與方法

1.1試劑

方法中所用試劑，除另有規(guī)定外，均為分析純試劑，水為超純水。

試劑：乙腈（色譜純）、氨水（含量為25%～35%）、甲醇（色譜純）、檸檬酸、辛烷磺酸鈉（色譜純）。

1%三氯乙酸：稱取1 g三氯乙酸用水定容到100mL。

離子對試劑緩沖液：準確稱取2.10 g檸檬酸和2.16 g辛烷磺酸鈉加入約980mL水溶解，調(diào)節(jié)pH至3.0后，用超純水定容至1 000m L。

甲醇水溶液（50%）：準確量取50mL甲醇和50mL水，混勻后備用。

氨化甲醇溶液（5%）：準確量取5mL氨水和95mL甲醇，混勻后備用。

三聚氰胺標準儲備液：精密稱取三聚氰胺0.0250g，用50%甲醇溶解并定容至25mL的容量瓶中，混勻，即得1 000μg/mL三聚氰胺標準儲備液。

三聚氰胺標準工作液：準確移取5.00m L三聚氰胺標準儲備液于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，混勻即得100μg/mL三聚氰胺標準工作液。

1.2設備

高效液相色譜儀Agilent1260（配有DAD或VWD）；離心機；超聲波清洗器；分析天平：感量為0.01mg；電子天平；一次性過濾器；針頭過濾器（有機系0.45μm）；渦旋混合器。

1.3方法

1.3.1檢測原理

試樣中三聚氰胺經(jīng)三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色譜測定，外標法定量。

1.3.2標準工作曲線

分別吸取三聚氰胺標準工作液0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5mL，置于25mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，得到三聚氰胺質(zhì)量濃度分別為0、1、2、5、8μg/mL 和10μg/mL標準系列液，分別進行HPLC分析。

1.3.3樣品處理

原料乳、滅菌乳及乳粉：準確稱取2.5 g（精確至0.01 g）試樣于25mL容量瓶中，加入10mL1%三氯乙酸溶液，加入5m L乙腈，振蕩混勻，用三氯乙酸定容至25m L。混勻超聲提取10min～20min。3 500 r/min～4 000 r/min以上離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，HPLC分析。

酸奶及蛋白飲料：準確稱取2 g（精確至0.01 g）試樣于25mL容量瓶中，加5mL乙腈溶解，用超純水定容至25mL，振蕩混勻超聲提取10min～20min后離心，3 500 r/min～4 000 r/min以上離心10min，經(jīng)0.45μm濾膜過濾，HPLC分析。

1.3.4儀器條件

色譜柱：C18（4.6mm×250mm，5.0μm）。

流動相：離子對試劑緩沖液-乙腈（80+20，體積比）混勻，過濾備用。

流速：1mL/min；進樣量：20μL；柱溫：40℃；波長：240 nm。

1.3.5上機測試

將三聚氰胺標準系列液依次注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積。

將制備好的試樣溶液注入高效液相色譜儀中，測定相應的峰面積。用保留時間定性，外標峰面積法定量。

2　結(jié)果與分析

2.1三聚氰胺標準工作曲線

三聚氰胺質(zhì)量濃度在0.5mg/L～8mg/L范圍內(nèi)，標準工作曲線呈線性關系，曲線的回歸方程為：y= 36.280 69x，相關系數(shù)R=0.999 98。三聚氰胺標準工作曲線如圖1所示。

圖1　三聚氰胺標準工作曲線Fig.1　The standard working curve ofmelam ine

2.2最低檢測限

取空白樣品測定3次，由儀器測得基線噪音（6*SD）平均值。

根據(jù)GB/T 5009.1-2003《食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則》中A2.1色譜法的檢出限計算公式為：

式中：b為標準曲線回歸方程中的斜率，響應值/ μg或響應值/ng；S為儀器噪音的3倍，即儀器能辨認的最小的物質(zhì)信號。

經(jīng)計算得到的該方法的檢出限為：0.5mg/kg。2.3準確度

根據(jù)方法的檢出限，分別對2.0、2.5、4.0mg/kg 3個點進行了加標回收率試驗，結(jié)果見表1。

表1　液態(tài)奶中三聚氰胺加標回收率Table 1　Liquidm ilkmelam ine recoveries

續(xù)表1　液態(tài)奶中三聚氰胺加標回收率Contiune table 1　Liquid m ilkmelam ine recoveries

由表1可以看出3個梯度的加標回收率結(jié)果在95.15%～99.12%。

2.4精密度

精密度結(jié)果見表2。

表2　精密度試驗（n=3×6）Table2　Precision test（n=3×6）

通過對兩個未知濃度的樣品分別重復測定6次，得到的相對標準偏差在1.09%～1.99%之間。

2.5穩(wěn)定性

穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。

表3　穩(wěn)定性試驗Table3　Breakdown test

通過對未知濃度的樣品在常溫（15℃～25℃）下，分別在放置2、5、10 d后進行檢測，得到的相對標準偏差為1.55%。

3　結(jié)論

采用三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色譜測定，外標法定量。該方法的檢出限為0.5mg/kg，相對標準偏差為1.09%～1.99%，回收率在95.15%～99.12%之間。與GB/T 22388-2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法》第一法HPLC相比，處理時間縮短了約3 h。該方法檢測乳與乳制品中三聚氰胺，簡便易行，準確性和精密度高，適用于乳與乳制品中三聚氰胺的檢測。

參考文獻：

[1]中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會.GB/T 22388-2008原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測方法[S].北京:中國標準出版社出版,2008:1-3

[2]王浩,劉艷琴,曹紅,等.固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用測定寵物食品中三聚氰胺[J].分析化學,2008,36(2):273

[3]張美金,林海丹,林峰,等.高效液相色譜法測定飼料和寵物食品中三聚氰胺含量[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志,2007,17(12):2205-2206

[4]楊云霞,劉彤,周桂英,等.小麥谷元粉中三聚氰胺的高效液相色譜法測定[J].分析測試學報,2008,27(3):322-324

[5]辜雪英,吳小花,仇滿珍.飼料中三聚氰胺殘留量高效液相色譜測定的研究[J].江西化工,2007(2):70-72

[6]倪沁顏.高效液相色譜法(HPLC)測定飼料中三聚氰胺的含量[J].福建分析測試,2008,17(1):57-59

[7]汪輝,曹小彥,彭新凱,等.高效液相色譜-二級管陣列法測定高蛋白食品中的三聚氰胺[J].食品與機械,2007,23(5):114-115

[8]宮小明,董靜,孫軍,等.HPLC法測定植物性原料中三聚氰胺[J].食品科學,2008,29(4):321-322

[9]占春瑞,郭平,溫志海,等.液相色譜檢測飼料中三聚氰胺殘留量的方法研究[J].飼料研究,2007(11):18-19

[10]陳婷.高效液相色譜法測定飼料中三聚氰胺含量[J].福建畜牧獸醫(yī),2007,29(6):10-11

[11]李德良.食品及飼料中三聚氰胺殘留量液相色譜檢測方法的研究[J].南昌高專學報,2007(6):131-132

[12]吳明禮,陳彩紅.高效液相色譜法(HPLC)測定單氰胺中三聚氰胺的含量[J].寧夏石油化工,2005(2):24-25

[13]俞建君,吳芳珍.反相離子對色譜法測定工業(yè)三聚氰胺含量[J].廣東化工,2007,7(34):126-127

[14]趙永彪,李自春,劉婷,等.高效液相色譜法測定寵物食品中的三聚氰胺[J].分析實驗室,2008(27):190-191

[15]丁濤,徐錦忠,李健忠,等.高效液相色譜-二極管陣列檢測法及高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J].色譜,2008,26(1):6-9

[16]李愛軍,張代輝,馬書民,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留[J].分析化學,2008,36(5):699-701

[17]染偉.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析寵物食品中三聚氰胺[J].分析測試學報,2007(26):285-286

[18]李愛軍,張代輝,馬書民,等.液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺殘留[J].分析化學研究簡報,2008,26(5):699-701

[19]賴碧清,鄭曉航,韓銀濤.高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用測定飼料中三聚氰胺含量[J].飼料工業(yè),2008,29(4):47-48

[20]蔣晨陽,范倩,林德清.氣質(zhì)聯(lián)用法測定飼料中的三聚氰胺[J].飼料工業(yè),2008,29(27):48-50

[21]王征.GC-MS法測定動物食品中的三聚氰胺[J].福建分析測試, 2008,17(2):1-4

[22]黃芳,黃曉蘭,吳慧勤,等.高效液相色譜-質(zhì)譜法對飼料及食品添加劑中三聚氰胺的測定[J].分析測試學報,2008,27(3):313-315

[23]馮家望,蔡勤仁,柳訓才,等.高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)技術測定奶及奶制品中三聚氰胺和環(huán)丙氨嗪[J].現(xiàn)代食品科技,2004,24 (10):1058-1059

[24]丁濤,徐錦忠,李健忠.效液相色譜-二極管陣列檢測法及高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性蛋白中殘留的三聚氰胺[J].色譜,2008,26(1):6-9

[25]蔡勤仁,歐陽穎瑜,錢振杰,等.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中殘留的三聚氰胺[J].色譜,2008,26(3):339-342

[26]何強,孔祥虹,李建華,等.離子交換色譜-紫外檢測法測定乳制品中三聚氰胺[J].中國乳品工業(yè),2008,36(6):55-56

[27]王兆華,宋希云,張恩盈,等.小麥胚乳貯藏蛋白多克隆抗體間接酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)的建立[J].萊陽農(nóng)學院學報,2006, 23(3):161-164

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.038

收稿日期：2014-03-21

作者簡介：王玉英（1982—），女（漢），工程師，碩士研究生，主要從事食品檢測方法研究。

Determ ination of Melam ine in M ilk and Dairy Products

WANGYu-ying，CHAIYan-bing，ZHANGYao-guang，ZHAOYuan-yuan，ZHANGYu-juan，YANLi-hong
（Shijiazhuang Junlebao dairy co.ltd，Quality ManagementCenter，Shijiazhuang 050021，Hebei，China）

Abstract：In this paper，HPLC was used to detect themelamine in raw milk and dairy products.In HPLC method，melamine was extracted by trichloroacetic acid and acetonitrile.The detection limit of thismethod is 0.5mg/kg，the relative standard deviation was1.09%-1.99%and the recoveriesbetween 95.15%-99.12%. Compared with the firstmethod in GB/T 22388-2008，thismethod processing time is reduced byabout3 h.

Key words：HPLC；melamine；milk；dairy products