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    哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達(dá)的關(guān)系

    2015-07-22 09:39:00張夢(mèng)瑩徐蕓蕓吳靜張盼張淡宜彭靜靜齊晨紀(jì)曉昀夏圣蘇兆亮王勝軍許化溪
    關(guān)鍵詞:配體極化哮喘

    張夢(mèng)瑩,徐蕓蕓,吳靜,張盼,張淡宜,彭靜靜,齊晨,紀(jì)曉昀,夏圣,蘇兆亮,王勝軍,許化溪

    (江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)系,江蘇鎮(zhèn)江212013)

    哮喘小鼠肺組織Nuocytes增多與GITR-GITRL表達(dá)的關(guān)系

    張夢(mèng)瑩,徐蕓蕓,吳靜,張盼,張淡宜,彭靜靜,齊晨,紀(jì)曉昀,夏圣,蘇兆亮,王勝軍,許化溪

    (江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與免疫檢驗(yàn)系,江蘇鎮(zhèn)江212013)

    目的:檢測(cè)哮喘小鼠肺組織中Nuocytes相關(guān)指標(biāo)和GITR-GITRL的表達(dá),探討哮喘時(shí)Th2極化微環(huán)境的改變。方法:選擇8只Balb/c小鼠,隨機(jī)分為2組,模型組于第1天,第11天用OVA致敏,第22至26天用2%OVA溶液霧化激發(fā),對(duì)照組用PBS處理;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)量;qRT-PCR法檢測(cè)Foxp3、RORα、ICOS、ST2、IL-5、IL-13和GITR及其配體GITRL的mRNA表達(dá)水平;對(duì)GITR-GITRL和Nuocytes及其相關(guān)分子的表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果與對(duì)照組相比,模型組小鼠肺組織中Nuocytes細(xì)胞數(shù)和GITR表達(dá)均升高,且GITRL、Foxp3、RORα、ICOS、ST2以及IL-5和IL-13 mRNA表達(dá)水平均明顯上調(diào);GITR與RORα和ST2、IL-5、IL-13的表達(dá)水平均呈正相關(guān)。結(jié)論:哮喘小鼠肺組織中Nuocytes和GITR-GITRL表達(dá)增高,提示哮喘時(shí)GITR-GITRL上調(diào)的T細(xì)胞免疫應(yīng)答可能與Th2主導(dǎo)的免疫失衡和Nuocytes極化相關(guān)。

    Nuocytes;GITR;GITRL;哮喘;小鼠

    哮喘是一種慢性過(guò)敏性氣道炎癥,病理特征主要表現(xiàn)為急性可逆性支氣管氣流受限、支氣管-肺組織高反應(yīng)性、氣道嗜酸粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液分泌增多等。目前,普遍認(rèn)為機(jī)體哮喘時(shí)的免疫狀態(tài)向Th2型偏倚[1],表現(xiàn)為2型細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄因子IL-4、GATA3等表達(dá)水平升高。

    近來(lái)發(fā)現(xiàn)一新型固有淋巴細(xì)胞Nuocytes[2-3]或稱Ⅱ型固有免疫細(xì)胞(Group 2 innate lymphoid cells,ILC2s),在哮喘疾病中起重要作用。Nuocytes經(jīng)IL-25、IL-33刺激活化,產(chǎn)生和分泌大量細(xì)胞因子,如IL-5和IL-13等。Nuocytes不表達(dá)T/B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等特異性標(biāo)志,可誘導(dǎo)共刺激分子(inducible costimulator,ICOS)為陽(yáng)性[4-5],維甲酸相關(guān)孤核受體α(retinoid acid receptor related orphan receptorα,RORα)是其分化和發(fā)揮生物學(xué)作用必需的轉(zhuǎn)錄因子。Nuocytes主要免疫作用是參與Th2應(yīng)答過(guò)程,其極化可能是構(gòu)成Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化的重要因素。

    糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體(glucocorticoid-induced TNF receptor family related protein,GITR)是腫瘤壞死因子受體(TNFR)超家族成員之一[6-8],為Ⅰ型跨膜蛋白,1997年由Nocentini等在雜交瘤細(xì)胞株上克隆出,其配體即GITRL。表達(dá)有GITR的Treg細(xì)胞能有效地發(fā)揮免疫抑制作用,控制和維持機(jī)體的免疫平衡。而當(dāng)GITR與其配體GITRL共表達(dá)時(shí),GITR-GITRL的相互作用則可消除Treg細(xì)胞的免疫抑制功能,并作為免疫應(yīng)答的正向協(xié)同刺激信號(hào),參與免疫性疾病的炎癥損傷過(guò)程。本研究擬通過(guò)檢測(cè)哮喘小鼠肺組織GITRGITRL和Nuocytes的分布以及相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)水平,分析GITR-GITRL對(duì)Nuocytes及其相關(guān)分子表達(dá)水平的影響,從區(qū)域免疫學(xué)的角度了解哮喘時(shí)Th2極化微環(huán)境的變化。

    1 材料與方法

    1.1 小鼠哮喘模型的建立

    SPF(Specific pathogen-free)級(jí)雌性Balb/c小鼠(6~8周齡)8只,購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心,動(dòng)物合格證號(hào):No.201403201。隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,每組4只。模型組建模方法參照文獻(xiàn)[9]并加以改進(jìn),即于第1天和第11天腹腔注射致敏液0.1 mL[50μg雞卵清蛋白(OVA)+10%氫氧化鋁凝膠2 mg],第22天至第26天以無(wú)菌PBS配制的2%OVA溶液超聲霧化吸入60 min,最后一次霧化吸入24 h后處死小鼠。對(duì)照組用PBS處理。

    1.2 試劑

    OVA(Sigma公司),Trizol試劑(Invitrogen公司);反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTM(TaKaRa公司);GITR和Lin單克隆抗體(eBioscience公司),ST2、ICOS單克隆抗體(Biolegend公司)。

    1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠肺組織GITR的表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)

    取小鼠肺組織,剪碎并用膠原酶消化,篩網(wǎng)過(guò)濾和ACK裂解液裂解紅細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)后用抗GITRAPC或抗Lineage-FITC、抗ICOS-PerCP/Cy5.5和T1/ST2-PE作熒光抗體染色,然后用C6流式細(xì)胞儀分析。

    1.4 RNA提取、引物設(shè)計(jì)及qRT-PCR

    剪取約1/4肺組織塊沖洗,剪碎后加1 mL Trizol提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,再以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR(反轉(zhuǎn)錄和定量試劑均為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每份標(biāo)本均設(shè)3個(gè)復(fù)孔并作3次重復(fù)檢測(cè)。引物均用Oligo 6軟件設(shè)計(jì)(表1),由上海生工生物技術(shù)公司合成。

    表1 引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用GraphPad軟件。組間數(shù)據(jù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),相關(guān)性分析用Pearson相關(guān)分析法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 哮喘小鼠模型誘導(dǎo)結(jié)果

    建模后哮喘小鼠表現(xiàn)為煩躁不安,弓背且腹部鼓動(dòng)明顯,點(diǎn)頭樣喘息,呼吸加深加快等;HE染色鏡下可見(jiàn)哮喘小鼠肺泡間及伴行血管周?chē)写罅垦装Y細(xì)胞浸潤(rùn)、黏膜皺壁減少、杯狀細(xì)胞肥大增生,見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比,OVA模型組血清總IgE水平明顯升高(t=2.427,P<0.05)。見(jiàn)圖2。

    圖1 模型組小鼠肺組織的病理改變(HE染色×10)

    圖2 小鼠血清總IgE水平比較

    2.2 肺組織Nuocytes數(shù)量和GITR表達(dá)水平的改變

    流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織內(nèi)GITR陽(yáng)性細(xì)胞增加,且伴有Nuocytes細(xì)胞數(shù)增多;免疫熒光抗體染色結(jié)果也顯示GITR表達(dá)增強(qiáng);qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠肺組織GITR mRNA表達(dá)水平明顯升高。見(jiàn)圖3。

    圖3 小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes細(xì)胞數(shù)量

    2.3 哮喘小鼠肺組織GITRL和Nuocytes相關(guān)分子的表達(dá)

    qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組小鼠肺組織中GITRLmRNA水平明顯高于對(duì)照組;此外,F(xiàn)oxp3以及Nuocytes細(xì)胞相關(guān)分子ICOS、ST2、RORα、IL-5和IL-13 mRNA表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)圖4。

    2.4 哮喘小鼠肺組織GITR與Nuocytes相關(guān)分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

    相關(guān)性分析結(jié)果表明,GITR表達(dá)與RORα,ST2,IL5和IL-13的表達(dá)呈明顯正相關(guān)(P均<0.05)。見(jiàn)圖5。

    圖4 GITR-GITRL和Nuocytes相關(guān)分子的mRNA表達(dá)

    圖5 GITR與nuocytes相關(guān)分子表達(dá)水平的相關(guān)性分析

    3 討論

    支氣管哮喘是以氣道過(guò)敏性炎癥為主要病理特征的免疫性疾病,近年來(lái)歐共體呼吸健康調(diào)查(ESRHS)和國(guó)際兒童哮喘與變態(tài)反應(yīng)研究機(jī)構(gòu)(ISAAC)的流行病學(xué)調(diào)查研究均顯示,哮喘患病率明顯升高。迄今為止,哮喘的病理機(jī)制尚不完全清楚。研究表明,哮喘患者體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞處于失衡狀態(tài),Th2細(xì)胞呈優(yōu)勢(shì)分化[10]。Nuocytes可分泌大量的IL-5和IL-13,支撐和維持著Th2細(xì)胞的極化狀態(tài),促進(jìn)哮喘的發(fā)展。

    GITR組成性地高表達(dá)于Treg細(xì)胞表面,而靜息的初始CD4+T細(xì)胞表面表達(dá)量相對(duì)較低,當(dāng)抗原刺激活化T細(xì)胞后,Treg和CD4+T細(xì)胞表面的GITR表達(dá)量均會(huì)增高[11-13]。在缺乏足夠GITRL時(shí),高表達(dá)GITR的Treg細(xì)胞具有負(fù)向免疫調(diào)控作用,而GITR與其配體GITRL結(jié)合則構(gòu)成T細(xì)胞活化的協(xié)同刺激信號(hào),GITR-GITRL的相互作用影響Treg細(xì)胞的增殖及其免疫抑制功能[8-9]。

    本研究顯示,哮喘小鼠肺組織內(nèi)GITR表達(dá)和Nuocytes數(shù)量升高;GITR及其配體GITRLmRNA表達(dá)水平相伴上調(diào),同時(shí)nuocytes相關(guān)分子ICOS、ST2、IL-5、IL-13及轉(zhuǎn)錄因子RORα的mRNA水平也明顯升高;GITR-GITRL表達(dá)量與Nuocytes細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子水平呈正相關(guān)。由此推測(cè),GITR和GITRL相伴高表達(dá),一方面可阻礙Treg細(xì)胞的負(fù)向調(diào)控作用,另一方面可能對(duì)Th2細(xì)胞極化發(fā)揮促進(jìn)作用。有研究表明,Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子GATA3是炎癥條件下穩(wěn)定Foxp3(Treg轉(zhuǎn)錄因子)表達(dá)及功能的正調(diào)控因子[14-15],而Treg細(xì)胞中Foxp3也可通過(guò)上調(diào)去泛素化酶USP21的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而維持GATA3蛋白的穩(wěn)定性[16]。本研究結(jié)果顯示,哮喘小鼠肺組織Foxp3 mRNA呈高表達(dá),由此可見(jiàn)其促進(jìn)Th2細(xì)胞的極化。GITR-GITRL高表達(dá)與Nuocytes相關(guān)細(xì)胞因子或轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)呈正相關(guān),可能是直接地相互影響,也可能是間接作用的結(jié)果,但最終都導(dǎo)致Th2細(xì)胞極化之微環(huán)境,構(gòu)成哮喘的免疫失衡狀態(tài),其具體機(jī)制仍待進(jìn)一步研究。

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    Relationship between increased nuocytes and GITR-GITRL expression levels in lung tissue of asthmatic m ice

    ZHANGMeng-ying,XU Yun-yun,WU Jing,ZHANG Pan,ZHANG Dan-yi,PENG Jing-jing,QIChen,JIXiao-yun,XIA Sheng,SU Zhao-liang,WANG Sheng-jun,XU Hua-xi
    (Department of Immunology,School of Medicine,Jiangsu University,Zhenjiang Jiangsu 212013,China)

    Objective:To detect the changes of numbers of nuocytes and levels of GITR-GITRL in the lung of asthmaticmice,analyze the relationship between them,then to explore the changes of Th2-polarized micro-environment at the locus of allergic inflammation when with asthma.M ethods:Eightmice were devided into 2 groups randomly,asthmamodelswere sensitized with OVA on 1st,11st day,then nebulized inhalation with OVA on day 22-26,control group with PBS.Flow cytometry was used to detect numbers of nuocytes and cellswhich express GITR;qRT-PCR was also used to test themRNA levels of GITR-GITRL,molecules and cytokines associated with nuocytes;pearson correlation analysiswas used to detect the correlation between GITR-GITRL and nuocytes.Results:Compared with the control group,model group showed high levels of nuocytes and GITR-GITRL,meanwhile,with increased mRNA levels of GITRL,F(xiàn)oxp3,RORα,ICOS,ST2,IL-5 and IL-13;and there was a positive correlation between GITR expression and RORα,ST2,IL-5,IL-13 expression.Conclusion:Nuocytes and the expression of GITR-GITRL increased synchronously in lung of asthmaticmice,which suggested that the up-regulation of T cell-mediated immune response by GITR-GITRLmay be associated with Th2-biased response and polarization of nuocytes.

    nuocytes;GITR;GITRL;asthma;mice

    張夢(mèng)瑩(1990—),女,碩士研究生;蘇兆亮(通訊作者),副教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:szl30@yeah.net;許化溪(通訊作者),教授,博士生導(dǎo)師,E-mail:xuhx@ujs.edu.cn

    R562.25

    A

    1671-7783(2015)04-0277-05

    10.13312/j.issn.1671-7783.y150099

    國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31270947)

    2015-05-06 [編輯] 劉星星

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