離子交換層析分離純化發(fā)酵米糠中的Y-氨基丁酸

王姣斐，陳　野，陳遠(yuǎn)平（.武警杭州士官學(xué)校軍需系，浙江杭州30023；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

離子交換層析分離純化發(fā)酵米糠中的Y-氨基丁酸

王姣斐1，陳野2，*，陳遠(yuǎn)平1
（1.武警杭州士官學(xué)校軍需系，浙江杭州310023；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457）

摘要：以米曲霉發(fā)酵處理的米糠為研究對(duì)象，研究發(fā)酵米糠中γ-氨基丁酸的分離純化方法，采用超聲波輔助提取對(duì)米糠發(fā)酵物進(jìn)行初步提取，然后采用離子交換層析法進(jìn)行純化，提取液經(jīng)過(guò)離心、脫色、脫鹽等預(yù)處理，通過(guò)靜態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)和吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)確定離子交換層析的最適條件。結(jié)果表明，選取732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、上樣pH為3.0、上樣液濃度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脫液pH 8.0～10.0，收集餾分，測(cè)得其γ-氨基丁酸的純度為73%，計(jì)算得提取純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。

關(guān)鍵詞：發(fā)酵米糠；γ-氨基丁酸；離子交換層析；分離純化

γ-氨基丁酸是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，是由谷氨酸通過(guò)谷氨酸脫羧酶的作用發(fā)生脫羧反應(yīng)而生成[1-2]。免疫學(xué)研究表明，γ-氨基丁酸是人體中樞神經(jīng)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有極為重要的生理功能[3-4]，在促進(jìn)大腦活性、健腦益智、抗癲癇、促進(jìn)睡眠、美容潤(rùn)膚、延緩腦衰老機(jī)制、降血壓[5]等方面作用明顯，同時(shí)還具有改善腎機(jī)制、抑制脂肪肝及肥胖癥[6]、促進(jìn)肝功能[7]等作用。目前γ-氨基丁酸的制備方法主要有植物富集法和微生物發(fā)酵法[8-10]，運(yùn)用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)γ-氨基丁酸是通過(guò)微生物自身酶系的脫羧作用來(lái)提高米糠中γ-氨基丁酸的含量[11]。

米糠是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中重要的加工副產(chǎn)品[12]，米曲霉是食品工業(yè)中常見(jiàn)的微生物，主要用于生產(chǎn)醬油及一些生物活性物質(zhì)，具有良好的蛋白酶活性[13-14]，這些都為以米糠作為原料生產(chǎn)γ-氨基丁酸提供了理論基礎(chǔ)。本研究的研究對(duì)象是米曲霉發(fā)酵后的預(yù)處理米糠，主要采用超聲波輔助法和離子交換層析法對(duì)發(fā)酵米糠中的γ-氨基丁酸進(jìn)行分離純化，研究分離純化條件對(duì)γ-氨基丁酸產(chǎn)率的影響，為今后的規(guī)?；a(chǎn)提供理論和試驗(yàn)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品：美國(guó)Sigma公司；723型、734型、D001型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；發(fā)酵米糠：天津科技大學(xué)食品加工與保鮮實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

BS-100A型自動(dòng)部分收集器：分析儀器廠有限公司；HL-2型恒流泵：上海亞榮生化儀器廠；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；SHZ-3型循環(huán)水式多用真空泵：上海滬西分析儀器廠；Agilent C18色譜柱：美國(guó)Agilent儀器公司；D-2000 Elite型高效液相色譜儀：日立實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酵米糠γ-氨基丁酸的超聲波輔助提取

根據(jù)γ-氨基丁酸易溶于水的特性[15]，采用蒸餾水作為提取溶劑，采用超聲波輔助提取法，將發(fā)酵米糠在適量蒸餾水中浸泡30 min，使發(fā)酵物固體被提取液充分潤(rùn)濕，設(shè)定發(fā)酵物與提取液之間適當(dāng)料液比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)，得到發(fā)酵提取液，采用高效液相色譜法測(cè)定提取液中γ-氨基丁酸含量，研究不同料液比、超聲時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)提取液中γ-氨基丁酸的含量的影響。

1.3.2發(fā)酵提取液的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取50.000 g發(fā)酵物，加入適量蒸餾水，超聲提取30 min，混合物離心取上清液，濾渣與適量蒸餾水混勻，超聲輔助提取30 min，合并收集兩次提取上清液，定容至500 mL容量瓶。上清液60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至200 mL，加入4 g活性炭，勻速攪拌10 min，然后在80℃保溫20 min。溶液用濾紙過(guò)濾，并用蒸餾水反復(fù)洗滌濾液兩次，合并濾液60℃真空旋轉(zhuǎn)濃縮至60 mL，濃縮的溶液加入140 mL無(wú)水乙醇脫鹽，室溫下處理1 h。溶液過(guò)濾，60℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醇，蒸餾水定容至100 mL[16]。

1.3.3發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的含量測(cè)定

發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸含量的測(cè)定采用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生高效液相色譜法，具體色譜條件如下：

色譜儀：使用D-2000 Elite（Hitachi）系列高效液相色譜儀，紫外檢測(cè)器；

色譜柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；

色譜條件：流動(dòng)相：20%乙腈-20%甲醇-60%醋酸鈉緩沖液（pH7.2：NaAc·3H2O 1.6 g，色譜純甲醇200 mL，色譜純乙腈200 mL，加超純?nèi)ルx子水至1 L），柱溫40℃，檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的選擇

本研究純化γ-氨基丁酸采用目前精制氨基酸應(yīng)用最廣泛的方法——離子交換層析法，采用陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作為分離介質(zhì)[17]。

表1　3種強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的基本性能指標(biāo)Table 1　The basic performance indexs of the three strongly acidic resin

1.3.5陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的制備[18]

將150 mL樹(shù)脂置于潔凈的燒杯中，用溫水反復(fù)漂洗，直至排水清晰為止，用蒸餾水浸泡樹(shù)脂12 h，然后抽干水分，重復(fù)上述過(guò)程2次，使樹(shù)脂充分膨脹。用300 mL 1 mol/L的鹽酸溶液浸泡樹(shù)脂2 h～4 h，并不時(shí)攪拌。然后用蒸餾水洗滌，至吸出液的pH接近4.0。隨后用300 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液浸泡6 h～12 h，并用蒸餾水沖洗至pH為略堿性，再用300 mL 1 mol/L的鹽酸溶液處理，使樹(shù)脂變?yōu)闅湫?，最后用蒸餾水洗至pH為4.0，并且無(wú)氯離子存在。

1.3.6靜態(tài)吸附試驗(yàn)[19]

1.3.6.1吸附量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取已經(jīng)過(guò)預(yù)處理的濕樹(shù)脂3.0 g，布式漏斗抽濾吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入一定濃度的米糠發(fā)酵提取液100 mL，調(diào)節(jié)pH為3.0，瓶口密封，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件下振蕩24 h，使發(fā)酵液中的γ-氨基丁酸充分吸附在樹(shù)脂，過(guò)濾，測(cè)定溶液中γ-氨基丁酸的濃度，同時(shí)測(cè)定初始發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的濃度，按下式計(jì)算樹(shù)脂在相同條件下對(duì)發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的吸附量。

1.3.6.2解吸率的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取按照上述方法充分吸附好的樹(shù)脂3.0 g，布式漏斗抽濾吸干表面水分，裝入250 mL錐形瓶中，準(zhǔn)確加入濃度為1 mol/L的氨水溶液100 mL，瓶口密封，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件下振蕩24 h，過(guò)濾，高效液相色譜法測(cè)定濾液中γ-氨基丁酸的濃度，按照下式計(jì)算樹(shù)脂的解吸率。

1.3.6.3吸附時(shí)間對(duì)樹(shù)脂吸附容量的影響

準(zhǔn)確稱取732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂5.0 g，吸干樹(shù)脂表面的水分，置于250 mL錐形瓶中，加入已知質(zhì)量濃度的米糠發(fā)酵提取液150 mL，密封瓶口，在溫度為25℃，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min條件的搖床培養(yǎng)箱中振蕩，分別在吸附時(shí)間為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 h時(shí)測(cè)定發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的濃度，測(cè)定3次取平均值。

1.3.6.4上樣液pH對(duì)樹(shù)脂吸附容量的影響

取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的發(fā)酵物提取液，分別調(diào)pH為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，取適量經(jīng)預(yù)處理的樹(shù)脂與發(fā)酵物提取液混合，100 r/min振蕩24 h，使之完全吸附，高效液相色譜法測(cè)定吸附后提取液的γ-氨基丁酸含量，測(cè)定吸附量。

1.3.7動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)[20]

1.3.7.1上樣濃度對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

取適量預(yù)處理好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，布式漏斗抽濾除去表面水分，裝入玻璃層析柱中，分別取稀釋至濃度為0.5、1.0、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL的γ-氨基丁酸發(fā)酵提取液100 mL，以1 mL/min的上樣流速上樣，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測(cè)定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計(jì)算陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附量。

1.3.7.2上樣流速對(duì)樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響

取適量預(yù)處理好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂，布式漏斗抽濾除去表面水分，裝入玻璃層析柱中，分別取稀釋至濃度為2 mg/mL的γ-氨基丁酸發(fā)酵提取液100 mL，以1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL/min的上樣流速上樣，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測(cè)定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計(jì)算陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附量。

1.3.8洗脫實(shí)驗(yàn)

當(dāng)洗脫液的酸堿度不同時(shí)，γ-氨基丁酸的洗脫效果也不盡相同，將上述吸附好的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析柱分別加入pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的洗脫劑100 mL，收集流出液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮并稀釋定容至100 mL，測(cè)定流出液中γ-氨基丁酸的濃度，計(jì)算陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附量。

2　結(jié)果與討論

2.1γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖1。

圖1　γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1　Standard curve of GABA

將配制的不同濃度γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)系列溶液衍生后分別吸取20 μL進(jìn)樣，按選定的色譜條件進(jìn)行分析，每個(gè)標(biāo)品進(jìn)樣3次，峰面積取平均值。在一定濃度范圍內(nèi)，γ-氨基丁酸的紫外吸收（可轉(zhuǎn)變?yōu)槟硶r(shí)刻出峰的峰面積大?。┡cγ-氨基丁酸濃度呈線性關(guān)系。以γ-氨基丁酸的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。通過(guò)回歸方程計(jì)算求得回歸方程y=0.022 8x-0.369，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 4，工作曲線如圖1所示。

2.2超聲波輔助提取條件優(yōu)化

超聲波輔助提取目前廣泛的應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)的分離提取和檢測(cè)前處理中，具有操作步驟少，提取效果好，節(jié)省能源，試驗(yàn)時(shí)間短等眾多優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用前景廣闊。根據(jù)γ-氨基丁酸易溶于水的特性，采用蒸餾水作為提取溶劑，使用超聲波提取提取儀提高提取效率，研究料液比、超聲時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)米糠發(fā)酵物中GABA含量的影響。料液比對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見(jiàn)圖2。

由圖2的趨勢(shì)可以看出，隨著料液比的增加，米糠發(fā)酵提取液中γ-氨基丁酸的含量迅速增加，當(dāng)料液比達(dá)到1∶10（g/mL）時(shí)，提取液中γ-氨基丁酸含量的增速減緩并逐漸趨于穩(wěn)定。當(dāng)料液比過(guò)低時(shí)，米糠發(fā)酵物不能與提取液充分接觸，并且超聲提取的原理就是利用提取過(guò)程中水分子與物料顆粒之間的作用力來(lái)提高提取效率的，因此料液比增高有助于增強(qiáng)提取效果。然而如果料液比過(guò)高，提取液體積過(guò)大，增加提取量的效果相對(duì)不明顯，不利于γ-氨基丁酸提取液的后續(xù)濃縮和純化。綜合考慮成本和其他因素，確定最佳提取料液比為1∶10（g/mL）。超聲時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見(jiàn)圖3。

圖3　超聲時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響Fig.3　Effect of the ultrasonic timeon GABA content in fermented product

由圖3可知，提取液中γ-氨基丁酸的含量隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)當(dāng)而呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間達(dá)到30 min時(shí)達(dá)到最大提取；當(dāng)超聲時(shí)間小于40 min時(shí)，發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量趨于穩(wěn)定，當(dāng)提取時(shí)間大于40 min時(shí)，γ-氨基丁酸的含量呈現(xiàn)緩慢的下降趨勢(shì)，這可能是由于超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲儀中提取液溫度上升，加之超聲作用，不利于提取液中γ-氨基丁酸的穩(wěn)定，因此選取超聲輔助提取時(shí)間為30 min。與傳統(tǒng)的熱水浸提法相比，超聲波輔助提取具有較大的優(yōu)勢(shì)，這一提取過(guò)程中機(jī)械作用和空化作用相互協(xié)同[21]，增大了水分子和物料分子之間的運(yùn)動(dòng)頻率和速度，并且增強(qiáng)了溶劑穿透能力，可以大大地縮短提取時(shí)間，從而提高了γ-氨基丁酸的溶出速度和含量。

當(dāng)進(jìn)行固體的液體超聲提取時(shí)，為了提高提取效率，一般需要進(jìn)行分步提取。提取次數(shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響見(jiàn)圖4。

圖4　提取次數(shù)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中GABA提取效果的影響Fig.4　Effect of the extraction timeson GABA content in fermented product

由圖4可以看出，發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的含量隨著提取次數(shù)的增加呈現(xiàn)先增大后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。提取次數(shù)對(duì)發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸含量的影響顯著，前3次提取效果比較明顯，當(dāng)繼續(xù)進(jìn)行第4次、第5次提取時(shí)，γ-氨基丁酸的含量變化不大，說(shuō)明此時(shí)已經(jīng)沒(méi)有更多的γ-氨基丁酸轉(zhuǎn)移到提取液中，提取已經(jīng)基本完全。而且提取次數(shù)過(guò)多不僅會(huì)提高試驗(yàn)成本，而且會(huì)造成得到的提取液體積過(guò)大，不利于γ-氨基丁酸提取液的后續(xù)濃縮和純化。因此選擇提取次數(shù)3次最為合適。

2.3離子交換層析對(duì)γ-氨基丁酸的純化

2.3.1樹(shù)脂的選取和制備

根據(jù)離子交換層析的主要原理和有關(guān)發(fā)酵液中γ-氨基丁酸的純化相關(guān)文獻(xiàn)可知[22]，與其他類型的樹(shù)脂相比，強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)γ-氨基丁酸的靜態(tài)交換容量較大，因此本試驗(yàn)選取了732型、734型和D001型3種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂作為研究對(duì)象。三種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的靜態(tài)吸附容量見(jiàn)圖5。

圖5　三種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的靜態(tài)吸附容量Fig.5　Static capacity of three kinds of ion-exchange resins

由圖5可以看出，3種陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的靜態(tài)吸附容量都比較大，均超過(guò)了20 mgGABA/g樹(shù)脂，其中734型樹(shù)脂吸附容量較低，732型和D001型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂吸附容量較高。這兩種樹(shù)脂中732型屬于凝膠型樹(shù)脂，D001型屬于大孔型樹(shù)脂，一般來(lái)說(shuō)大孔型樹(shù)脂具有強(qiáng)度大，離子擴(kuò)散速度快，使用時(shí)效率高，所需處理時(shí)間縮短等特點(diǎn)，但吸附量往往不如凝膠型樹(shù)脂。732型凝膠樹(shù)脂具有價(jià)格低廉，吸附量大，吸附速度快等特點(diǎn)，因此選取732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。李向平等[22]的研究比較001×7、001×4、D001、S-9、S604、201×7、117、D113和D204等7種不同類型的樹(shù)脂對(duì)γ-氨基丁酸的靜態(tài)吸附容量，研究發(fā)現(xiàn)弱酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂和強(qiáng)堿型陰離子交換樹(shù)脂的交換容量比較小，而強(qiáng)酸型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的靜態(tài)吸附容量普遍較大，與本研究的結(jié)論一致。該研究測(cè)得交換容量達(dá)到1.6 mmol/g樹(shù)脂以上，比本研究測(cè)定得到的交換容量稍高，且D001型樹(shù)脂的交換容量比732型樹(shù)脂交換容量大，與本研究略有不同。分析原因可能在其測(cè)定γ-氨基丁酸的靜態(tài)吸附容量是以γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液作為吸附溶液，而本試驗(yàn)是采用預(yù)處理后的米糠發(fā)酵物提取液，這兩種試驗(yàn)方法各有千秋，采用γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液在測(cè)定吸附前后γ-氨基丁酸濃度變化時(shí)，結(jié)果較為準(zhǔn)確，計(jì)算得到的靜態(tài)吸附容量更精確，但并不能完全代表樹(shù)脂對(duì)實(shí)際發(fā)酵液的吸附情況；本研究采用預(yù)處理后的米糠發(fā)酵物提取液進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)定吸附前后γ-氨基丁酸濃度變化不如前者精確，但更能夠預(yù)測(cè)出不同類型樹(shù)脂在特定發(fā)酵提取液中的吸附容量，因?yàn)榘l(fā)酵提取液中還可能存在其他雜質(zhì)氨基酸，可能會(huì)對(duì)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂對(duì)γ-氨基丁酸的吸附造成競(jìng)爭(zhēng)，這也是本研究測(cè)定吸附容量略低的原因。

2.3.2732型樹(shù)脂吸附量和解析率的測(cè)定

由2.3.1試驗(yàn)結(jié)果，可以得到732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附量為34.3 mg/g樹(shù)脂。用100 mL NH3·H2O解吸3.0 g充分吸附了GABA的樹(shù)脂，25℃振蕩處理24 h后過(guò)濾，測(cè)定濾液中GABA濃度，根據(jù)公式計(jì)算得出陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的解吸率為98.7%。黃懷生等[23]使用不同種類的陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化茶葉中γ-氨基丁酸，在初始濃度1.608 mg/mL的條件下，測(cè)定吸附平衡后，樹(shù)脂的吸附量為42.9 mg/g，使用2/4NH3· H2O在室溫下進(jìn)行解吸，測(cè)得解吸率為98.08%，與本研究結(jié)果基本一致。

2.3.3靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

吸附時(shí)間與靜態(tài)吸附量的關(guān)系試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示。

圖6　吸附時(shí)間與靜態(tài)吸附量的關(guān)系Fig.6　Effect of absorption time on static capacityof resins

由圖6可以看出，隨著吸附時(shí)間的增加，吸附量先迅速增大，之后呈穩(wěn)定趨勢(shì)。陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在吸附開(kāi)始的0.5 h之內(nèi)的吸附速度非常快，基本己經(jīng)達(dá)到其吸附總量的70%，在2 h以后，吸附量基本趨于穩(wěn)定。732樹(shù)脂的吸附速度很快，并且吸附量也較大，2 h左右即可基本實(shí)現(xiàn)完全吸附。這與文獻(xiàn)[23]中732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂在5 h后吸附已經(jīng)超過(guò)了90%的研究結(jié)果基本一致。綜合吸附量、解吸率和吸附速率這3個(gè)因素考慮，可以看出732樹(shù)脂是比較適合分離純化米糠發(fā)酵提取液中的γ-氨基丁酸的。上樣液pH對(duì)樹(shù)脂GABA吸附量的影響見(jiàn)圖7。

圖7　上樣液pH對(duì)樹(shù)脂GABA吸附量的影響Fig.7　Effect of pH on static capacityof resins

從圖7中可以看出，交換樹(shù)脂的γ-氨基丁酸吸附量隨著上樣液pH的變化呈現(xiàn)劇烈的變化，吸附量首先快速增大，并且在pH為3.0時(shí)達(dá)到最大，之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，當(dāng)提取液的pH下降到7.0時(shí)，樹(shù)脂的γ-氨基丁酸吸附量已經(jīng)下降到5 mgGABA/g樹(shù)脂以下。由此可知酸性提取液有助于樹(shù)脂的良好吸附，這是因?yàn)镚ABA本身就是一種氨基酸，同時(shí)帶有堿性基團(tuán)，因此在酸性環(huán)境中氨基易結(jié)合一個(gè)質(zhì)子而成陽(yáng)離子狀態(tài)，容易被樹(shù)脂吸附[24]。由上圖可知，要達(dá)到較好的吸附效果，應(yīng)當(dāng)使上樣液pH控制在3.0左右。

2.3.4離子交換樹(shù)脂吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果

離子交換樹(shù)脂吸附動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖8　上樣液GABA質(zhì)量濃度對(duì)交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響Fig.8　Effect of GABA mass concentration on static capacityof resins

由圖8可知，交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量隨著提取液質(zhì)量濃度的增大呈上升趨勢(shì)，當(dāng)γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度在2 mg/mL以下時(shí)，吸附量的上升速度很快；當(dāng)提取液的質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時(shí)，吸附量的增速減緩并趨于穩(wěn)定。雖然提取液的質(zhì)量濃度越大，樹(shù)脂吸附量隨之增大，但提取液質(zhì)量濃度過(guò)大，不僅會(huì)增大提取液預(yù)處理時(shí)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)的工作量，而且不利于控制成本，因此本研究選擇上樣液質(zhì)量濃度控制在2 mg/mL較為合適。上樣液流速對(duì)交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響見(jiàn)圖9。

圖9　上樣液流速對(duì)交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附的影響Fig.9　Effect of flow velocities on static capacityof resins

由圖9可知，交換樹(shù)脂動(dòng)態(tài)吸附量隨著流速的增加而減小，流速為1 mL/min的時(shí)候吸附量為最佳，但是如果上樣流速過(guò)低導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期延長(zhǎng)，因此綜合考慮試驗(yàn)便捷性和吸附量隨上樣流速的降低程度，本研究選擇上樣流速為2 mL/min。

2.3.5洗脫實(shí)驗(yàn)結(jié)果

不同pH的洗脫液對(duì)GABA的洗脫程度不同，將上述吸附好的樹(shù)脂層析柱分別加入pH為5.0、6.0、7.0 的100 mL檸檬酸緩沖液和pH為8.0、9.0、10.0和11.0 的100 mL NH3·H2O進(jìn)行洗脫。堿性條件下GABA中的羧基電離出一個(gè)質(zhì)子而帶負(fù)電荷，呈陰離子狀態(tài)，從而使陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的吸附量大大降低，以此達(dá)到解吸附的目的。洗脫液pH對(duì)洗脫效果的影響見(jiàn)圖10。

圖1　0　洗脫液pH對(duì)洗脫效果的影響Fig.10　Effect of eluent pH on the degree of elution

由試驗(yàn)可以看出，當(dāng)洗脫液為酸性時(shí)，洗脫液中幾乎檢測(cè)不到GABA的存在，當(dāng)洗脫液的pH逐漸上升到堿性時(shí)，洗脫液中的GABA濃度開(kāi)始上升，在pH=8.0～10.0時(shí)，洗脫效果最佳。

取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的發(fā)酵物粗提液200 mL，調(diào)節(jié)其γ-氨基丁酸質(zhì)量濃度約為2.0 mg/mL，調(diào)pH為3.0，上樣流速2 mL/min，將粗提液勻速上樣到裝有陽(yáng)離子交換樹(shù)脂的層析柱上，上樣完成后用300mL蒸餾水以1mL/min的流速?zèng)_洗，再用150mL0.1mol/L的氨水以1mL/min的流速?zèng)_洗，以便除去其他吸附在層析柱中可在酸性和中性洗脫劑中洗脫的雜質(zhì)氨基酸。沖洗完成后用1 mol/L氨水溶液作為洗脫劑，2 mL/min的流速勻速通過(guò)層析柱，并實(shí)時(shí)測(cè)定洗脫液的pH，收集pH 8～11的洗脫液，分裝各小試管，分別測(cè)定其γ-氨基丁酸含量，取γ-氨基丁酸含量大于60%的組分。洗脫過(guò)程中，使用蒸餾水和0.1 mol/L的氨水可以將提取液中的非特異性雜質(zhì)除去。為了把γ-氨基丁酸從樹(shù)脂中解吸出來(lái)，需要減弱帶電粒子間的相互作用力，這通常是通過(guò)增加離子強(qiáng)度或增大pH從而降低電荷作用力或改變?chǔ)?氨基丁酸的極性來(lái)實(shí)現(xiàn)的[16]。如果使用第一種方法洗脫，那么就會(huì)引入新的無(wú)機(jī)鹽到γ-氨基丁酸提取液中，從而偏離了獲得高純度γ-氨基丁酸的目的。作為有效且價(jià)格低廉的試劑，氨水可以很容易的增大體系的pH，并且很容易從溶液中去除，因此使用氨水作為洗脫劑從樹(shù)脂中洗脫γ-氨基丁酸。各管洗脫液體積及γ-氨基丁酸含量見(jiàn)表2。

表2　各管洗脫液體積及γ-氨基丁酸含量Table 2　The valume and GABA content of different collect liquid

由表2可知，收集γ-氨基丁酸含量大于60%的餾分，混合并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氨水，待旋蒸體積不變時(shí)，用蒸餾水將濃縮液定容至10 rnL，測(cè)得其γ-氨基丁酸的濃度為17.9 mg/rnL，純化提取物中γ-氨基丁酸的純度為73.1%，由此計(jì)算得到本研究中離子交換層析法純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。提取液純化前的液相色譜圖見(jiàn)圖11和圖12。

圖1　1　提取液純化前的液相色譜圖Fig.11　High performance liquid chromatogram of fermented liquid before extraction and purification

由圖12可以看出，經(jīng)過(guò)純化后γ-氨基丁酸的特征色譜峰十分明顯，色譜圖中雜峰的干擾較之純化前有了明顯的減少，說(shuō)明離子交換層析對(duì)發(fā)酵物提取液中γ-氨基丁酸的純化有一定的效果。同時(shí)我們也注意到，在5.5 min處有一較為明顯的雜峰干擾，這可能是發(fā)酵物提取液中存在的谷氨酸沒(méi)有完全除去，后續(xù)實(shí)驗(yàn)我們會(huì)繼續(xù)優(yōu)化純化條件，改進(jìn)實(shí)驗(yàn)方法以得到更好的試驗(yàn)結(jié)果。

圖1　2　提取液純化后的液相色譜圖Fig.12　High performance liquid chromatogram of fermented liquid after extraction and purification

3　結(jié)論

本研究采用超聲波輔助提取對(duì)發(fā)酵米糠進(jìn)行初步提取，然后采用離子交換層析法進(jìn)行純化，提取液經(jīng)過(guò)離心、脫色、脫鹽等預(yù)處理，通過(guò)靜態(tài)吸附試驗(yàn)和吸附動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)確定離子交換層析的最適條件。結(jié)果表明，選取732型強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、上樣pH為3.0、上樣液濃度2 mg/mL，流速2 mL/min，洗脫液pH 8.0～10.0，收集餾分，測(cè)得其γ-氨基丁酸的純度為73%，計(jì)算得提取純化γ-氨基丁酸的得率為44.9%。

參考文獻(xiàn)：

[1]王海修,張偉中.米糠的保健作用研究[J].糧食儲(chǔ)藏,2003,3l(5):39-42

[2]祝方清.淺議米糠保健功效[J].糧食加工,2004,7(3):51-52

[3]李玉東.日本流行米糠護(hù)膚[J].糧食科技與經(jīng)濟(jì),2006,31(1):20-21

[4]Rice K G,Wu P G,Brand L,et al.Experimental determination of oligasseeharide three dimensional structure[J].Curr Opin Struct Biol, 1993(3):669-702

[5]李璐,李宗軍.新型米糠功能食品的研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2011,7 (7):105-107

[6]Donald E P.Rice:not just for throwing[J].Food tech,2001,55(2):53-58

[7]LemosMRB,Souza-SoaresLA.Rice and its byproducts in southern Brazil[J].Vetor.Revista de Ciências Exatas e Engenharias.Editora da FundaoUniversidade do Rio Grande,FURG,Rio Grande,RS,Brasil: 2000(10):21-36

[8]Swati Bhauso,Patil&Md,Khalid Khan.Germinated brown rice as a value added riceproduct:A review[J].Journal Food Sci Technol, 2011,48(6):661-667

[9]SuYC,Wang JJ,Lin TT,et al.Production of the secondarymetabolites gamma-aminobutyric acid and monacolin K byMonascus[J].Journal Industry Microbiol Biotechnol,2003(30):41-46

[10]Aoki H,Uda I,Tagami K,et al.Production of a new Tempehlikefermented soybean containing a high level of gammaaminobutyricacid byanaerobicincubationwithRhizopus[J].BiosciBiotechnolBiochem, 2003(67):1018-1023

[11]Emperatriz PachecodeDelahaye,Paula Jimenez,Elevina Perez.Effect of enrichment with high contentdietary fiber stabilized rice bran flour on chemical andfunction properties of storage frozen pizzas[J]. FoodEngineering,2005(68):1-7

[12]姚惠源,周素梅,王立.米糠與米糠蛋白的開(kāi)發(fā)利用[J].無(wú)錫輕工大學(xué)報(bào),2002,2(3):312-316

[13]劉麗萍,劉麗華.米曲霉研究進(jìn)展與應(yīng)用[J].中國(guó)調(diào)味品,2008(4): 28-32

[14]周其洋,陶文沂.米曲霉多酶系優(yōu)良菌株的誘變選育[J].中國(guó)調(diào)味品,2009,34(9):57-60

[15]SukHO,WonGC.Changes in the levels of y-aminobutyric acid andglutamatedecarboxylase in developing oybean seedings[J].Journal of Plant Research,2001(114):309-313

[16]Haixing Li,Ting Qin,Yan Chen,et al.Separation of gammaaminobutyric acid from fermented broth[J].Journal Industry Microbial Biotechnical,2011(38):1995-1999

[17]周駿山.實(shí)用氨基酸手冊(cè)[M].無(wú)錫市氨基酸研究所,1989:208-219

[18]耿予歡,張本山,高大維,等.強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化異麥芽低聚糖的研究[J].食品科學(xué),1999(5):6-8

[19]黃懷生,黃亞輝,鄭紅發(fā).732陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化Gabaron茶中γ-氨基丁酸的研究[J].茶葉通訊,2007,34(3):4-6

[20]Takayo S,Takashi M,Toshior H.Production of gmama-aminobutyric acid[J].1996(12):34-37

[21]王文,馮暴.超濾技術(shù)在GABA發(fā)酵液分離純化過(guò)程中的應(yīng)用[J].江蘇大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005,26(1):5-8

[22]李向平.發(fā)酵液中γ-氨基丁酸提取工藝的研究[D].杭州:浙江大學(xué),2007

[23]黃懷生,黃亞輝,鄭紅發(fā).732型陽(yáng)離子交換樹(shù)脂分離純化Gabaron茶中γ-氨基丁酸的研究[J].茶葉通訊,2007,34(3):4-8

[24]黃亞輝,曾貞,鄭紅發(fā).GABA茶中γ-氨基丁酸的TLC測(cè)定及提純研究[J].氨基酸和生物資源,2008,30(3):11-15

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.016

收稿日期：2015-07-05

作者簡(jiǎn)介：王姣斐（1989—），女（漢），助教，碩士，研究方向：飲食營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生，食品加工。

*通信作者：陳野（1968—），男（漢），教授，博士，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及農(nóng)產(chǎn)品副產(chǎn)物生物學(xué)轉(zhuǎn)化技術(shù)。

Ion-exchange Chromawgraphy Separeted and Purified γ-aminobutyric Acid from Fermentation Rice Bran

WANG Jiao-fei1，CHEN Ye2，*，CHEN Yuan-ping1
（1.Hangzhou Sergeant School of CAPF，Hangzhou 310023，Zhejiang，China；2.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Abstract：Rice Bran fermented by Aspergillus oryzae was as the object of study，the methods of separation and purification of gamma aminobutyric acid of fermented rice bran was researched.The ultrasonic extraction was used to separation GABA from rice bran and GABA purification was conducted by successive centrifugation，filtration，decoloration，desalination and ion-exchange chromatography（IEC）.Results showed that the selected 732 strong acid cation exchange resin，the sample pH value was 3 and sample concentration，2 mg/mL，flow rate of 2 mL/min，eluent pH 8-10 fractions were collected.The recovery rate for the wholepurification process was about 44.9%.The purified product was characterized by HPLC，and its purity reached about 73%.

Key words：fermantation rice bran；γ-Aminobutyric acid；Ion-exchange chromatography；separate and purify