超聲波輔助法提取毛蔥黃酮的工藝研究

劉　超，高炯杰（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

超聲波輔助法提取毛蔥黃酮的工藝研究

劉超，高炯杰
（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院食品工程學(xué)院，吉林吉林132101）

摘要：以毛蔥為原料，利用乙醇在超聲波輔助下提取毛蔥黃酮，經(jīng)AB-8大孔吸附樹脂純化，通過三氯化鋁和濃氨水定性試驗(yàn)，確定所制備的產(chǎn)品為純度較高的毛蔥黃酮。通過考察影響黃酮得率的主要3個(gè)因素乙醇濃度，超聲時(shí)間，超聲溫度，利用響應(yīng)面法確定毛蔥黃酮的最佳提取工藝為：乙醇濃度為85.12%，提取溫度為61.11℃，提取時(shí)間28.2 min，黃酮提取率達(dá)到2.024%。

關(guān)鍵詞：毛蔥；黃酮；乙醇提??；響應(yīng)面法

分蘗蔥頭，為百合科蔥屬植物（Allium cepa L.var. Agrogatum Don），多年生草本，其鱗莖近似球形，外包赤紅色皮膜，出葉后根部呈6～14個(gè)蔥頭，屬高產(chǎn)作物，適宜黑土地生長，在黑龍江中北部、吉林大部分地區(qū)都能種植這種作物，可間作，生育期58 d，不怕凍，產(chǎn)量高。分蘗蔥頭具有抑菌、降血糖、抑制血小板凝聚、降血脂、降血糖等生理功能[1-2]。其已被專家們發(fā)現(xiàn)至少有6種抗癌防衰老降脂作用的成分；對(duì)腦瘤、乳腺、前列腺等疾病都有很好的治療作用，特別是軟化脂肪中的血管治療更佳。世界各專業(yè)教授和性病專家們研究發(fā)現(xiàn)：把毛蔥經(jīng)過特殊加工后所取得的毛蔥汁（學(xué)術(shù)界稱之為毛蔥油），還可以阻斷結(jié)腸、口腔、肺、肝臟胰腺、食管癌過程都有明顯的治療作用，在東南亞國家，各自家庭中把毛蔥自然加工后取汁，經(jīng)常食用還可刺激正常免疫，阻斷宮頸癌和皮膚癌細(xì)胞的生長[3]。

蔥屬植物中的黃酮醇類成分主要為山柰酚（kaempferol）、槲皮素（quercetin）與葡萄糖組成的單糖苷至多糖苷。Ngocly T.等[4]于2005年從洋蔥皮中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的槲皮素縮合物，分別為槲皮素和原兒茶酸的縮合物、槲皮素氧化物和4-O-吡喃葡萄糖-槲皮素的縮合物以及槲皮素三聚物。2006年，F(xiàn)reddy A.等[5]又從洋蔥皮中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)槲皮素B環(huán)上的氧化產(chǎn)物，這些化合物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。

蔥屬植物對(duì)心血管系統(tǒng)疾病具有較強(qiáng)的治療作用，特別是其抗血小板聚集作用國內(nèi)外文獻(xiàn)中有較多報(bào)道。Alfonso C.等分別從A.neapolitanum[6]和A.ursinum[7]中得到7種新黃酮醇苷，對(duì)血小板聚集均有不同程度的抑制作用；2003年，F(xiàn)urusawa M.等[8]從洋蔥皮中提取得到的4個(gè)黃酮醇可抑制人的血小板聚集，其中槲皮素及其二聚物還可使ADP引起的聚合物分解，從而有效預(yù)防了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生；Lytn和Hazama C等[9]從洋蔥中分離9種黃酮類化合物，并研究了其抗氧化性作用；我國研究人員李鵬等[10]測(cè)定了分蕖蔥頭中提取的黃酮化合物的抗氧化活性，證明其具有顯著的抗氧化活性。

本文采用超聲波輔助法提取毛蔥黃酮，其提取溶劑是乙醇，對(duì)超聲時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，并在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助法提取毛蔥黃酮的工藝進(jìn)行優(yōu)化，得出超聲波輔助法提取毛蔥黃酮的最佳提取工藝，為今后的提取毛蔥黃酮等活性物質(zhì)擁有更佳的方法打基礎(chǔ)。響應(yīng)面分析法是一種優(yōu)化工藝條件的有效方法，與正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)相比，具有試驗(yàn)周期短，求得回歸方程精度高，可用于確定試驗(yàn)因素及其交互作用在工藝過程中對(duì)指標(biāo)響應(yīng)值的影響等。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

分蘗蔥頭：4月采于吉林市左家山區(qū)。

1.2儀器與設(shè)備

FA2004型精密電子天平：天津天馬衡基儀器有限公司；752N紫外可見分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司；BILON-650CT超聲波提取儀器：上海比朗儀器制造有限公司；FD-1A-50冷凍干燥機(jī)：上海谷寧儀器有限公司；HH-6恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；EYELA N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長科工貿(mào)有限公司。

1.3方法

1.3.1醇提法提取毛蔥黃酮

稱取切好的毛蔥100 g，置入95%的乙醇300 mL，在50℃下回流提取2次，每次1 h，過濾，合并2次濾液，減壓濃縮，用石油醚脫脂，除去色素和脂溶性成分，冷凍干燥，得粗提物，稱量備用。

1.3.2超聲波輔助法提取毛蔥黃酮

稱取切好的毛蔥100 g，置入95%的乙醇300 mL，浸泡12 h，再用超聲波輔助提取30 min，過濾，減壓濃縮，用石油醚脫脂，除去色素和脂溶性成分，冷凍干燥，得粗提物，稱量。比較兩次粗提物的重量，選擇合適的方法提取黃酮。

1.3.3AB-8大孔吸附樹純化毛蔥黃酮

將干燥好的提取物，用50℃的熱水溶解浸膏，放入50 mL的容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度；緩慢將溶液放入到大孔樹脂中，靜置0.5 h。加蒸餾水洗至無白色渾濁。加2倍體積的70%的乙醇[11]，洗脫黃酮，得黃色液體。將黃色液體減壓濃縮，真空冷凍干燥，稱量。

1.3.4單因素試驗(yàn)

1.3.4.1超聲時(shí)間對(duì)毛蔥得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的毛蔥100 g，用80%的乙醇，浸泡20 h，超聲功率450 kW，超聲溫度50℃，超聲時(shí)間10、20、30、40、50 min?？疾斐晻r(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率的影響。

1.3.4.2超聲溫度對(duì)毛蔥得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的毛蔥100 g，用80%的乙醇，浸泡20 h，超聲功率450 kW，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度40、50、60、70、80℃?？疾斐暅囟葘?duì)毛蔥黃酮得率的影響。

1.3.4.3乙醇濃度對(duì)毛蔥得率的影響

準(zhǔn)確稱取處理好的毛蔥100g，用55%、65%、75%、85%、95%的乙醇，浸泡20 h，超聲功率450 kW，超聲時(shí)間30 min，超聲溫度50℃?？疾煲掖紳舛葘?duì)毛蔥得率的影響。

1.3.5響應(yīng)面法優(yōu)化

用Design-Expert軟件，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，以毛蔥總黃酮的得率為試驗(yàn)指標(biāo)，以超聲提取時(shí)間，超聲溫度，乙醇濃度為自變量，選擇使用Box-Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1　設(shè)計(jì)響應(yīng)面因素及水平Table 1　Design of factors and levels in response surface

1.3.6毛蔥黃酮的定性檢測(cè)

毛蔥中純提取物，經(jīng)分離純化，進(jìn)行如下檢測(cè)，以確定為黃酮類物質(zhì)。

1.3.6.1三氯化鋁反應(yīng)

取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，滴加1%AlCl3的乙醇溶液，吹干。在可見光下成灰黃色，在紫外光（365 nm）下呈黃色熒光斑點(diǎn)即為黃酮。

1.3.6.2濃氨水反應(yīng)

取樣品溶液點(diǎn)在濾紙上，將濾紙放在濃氨水上30 s，立即在紫外光下觀察，若呈極明顯的黃褐色熒光斑點(diǎn)，即為毛蔥黃酮。

1.3.7毛蔥黃酮含量的測(cè)定

毛蔥黃銅得率計(jì)算公式如下：

毛蔥黃酮得率/%=m/M×100

式中：m為黃酮質(zhì)量，mg；M為毛蔥總質(zhì)量，mg。

2　結(jié)果與討論

2.1單因素試驗(yàn)

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)黃酮得率的影響

超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1　超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率的影響Fig.1　Effect of ultrasonic time on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

由圖1可知隨著超聲時(shí)間的增加，黃酮得率增加，當(dāng)超聲時(shí)間為20 min時(shí)，黃酮得率最大為1.89%。如果再增加超聲時(shí)間，可能使毛蔥的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取率下降，因此選20 min作為最佳超聲時(shí)間。2.1.2

2.1.2超聲溫度對(duì)黃酮得率的影響

超聲溫度對(duì)毛蔥黃酮得率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2　超聲溫度對(duì)毛蔥黃酮得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic temperature on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

由圖2可知，隨著超聲溫度的增加，提取率升高，當(dāng)超聲波溫度為60℃時(shí)，提取率達(dá)到2.01%；但當(dāng)超聲溫度繼續(xù)增加時(shí)，破壞黃酮結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取率逐漸下降，所以選擇最佳超聲溫度為60℃。

2.1.3乙醇濃度對(duì)黃酮的率的影響

乙醇濃度對(duì)毛蔥黃酮得率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3　乙醇濃度對(duì)毛蔥黃酮得率的影響Fig.3　Effect of ethanol concentration effect on the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

黃酮提取率隨乙醇濃度的增加而增大，在乙醇濃度為85%時(shí)，毛蔥黃酮最高得率達(dá)到2%，當(dāng)乙醇濃度大于85%時(shí)，提取率趨于穩(wěn)定，從經(jīng)濟(jì)效益考慮，選擇85%乙醇進(jìn)行提取。

2.2響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用響應(yīng)面法優(yōu)化毛蔥中黃酮的乙醇提取工藝。試驗(yàn)結(jié)果如表2、表3所示。

表2　數(shù)據(jù)分析Table 2　Data analysis

表3　毛蔥黃酮得率回歸模型方差分析表Table 3　Regression model analysis of variance table for yield of flavonoids

由表3可知，數(shù)學(xué)模型極其顯著，一次項(xiàng)C顯著，A、B極為顯著，AB、BC顯著，AC極顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2極為顯著，誤差項(xiàng)為不顯著，說明該模型得到的回歸方程與實(shí)際情況相差不大，試驗(yàn)誤差小，該模型的相關(guān)系數(shù)為R2=0.991 0＞0.9，表明模型內(nèi)部試驗(yàn)點(diǎn)相關(guān)。通過F值的大小，能得出影響毛蔥得率的因素作用顯著性大小依次是乙醇濃度＞超聲溫度＞超聲時(shí)間。以毛蔥黃酮得率為響應(yīng)值，使用Design-Exper軟件，得回歸方程：

黃酮提取率=2.00+0.034A-0.038B+8.750E-003C+ 0.013AB+0.020AC+7.500E-003BC-0.086A2-0.099B2-0.047C2

其中A為乙醇濃度，B為超聲時(shí)間，C為超聲溫度。式中系數(shù)絕對(duì)值大小表示對(duì)毛蔥黃酮得率的影響程度。求得方程得知A=85.12%，B=28.2 min，C=61.11℃，即最佳毛蔥黃酮提取工藝為：85.12%乙醇在61.11℃下提取28.2 min，毛蔥黃酮提取率達(dá)到2.024%。

2.2.1乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響

乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見圖4、圖5。

圖4　乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響的響應(yīng)面Fig.4　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time

圖5　乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響的等高線Fig.5　Contour line of ethanol concentration and ultrasonic time

由圖4、圖5可知，乙醇濃度和超聲時(shí)間的曲面較陡，說明這兩因素對(duì)提取毛蔥黃酮的得率均有極顯著的影響，呈良好的二次關(guān)系。等高線不趨近圓形，說明乙醇濃度與超聲時(shí)間交互作用時(shí)，對(duì)黃酮得率有顯著的影響。隨著乙醇濃度和超聲時(shí)間的增加，毛蔥得率下降。

2.2.2超聲溫度和乙醇濃度對(duì)毛蔥得率的影響

超聲溫度和乙醇濃度對(duì)毛蔥得率的影響的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見下圖6、圖7。

圖6　超聲溫度和乙醇濃度對(duì)毛蔥得率的影響的響應(yīng)面Fig.6　Response surface of ultrasonic temperature and ethanol concentration

圖7　超聲溫度和乙醇濃度對(duì)毛蔥得率的影響的等高線Fig.7　Contour line of ultrasonic temperature and ethanol concentration

由圖6、圖7可知，響應(yīng)面中影響毛蔥黃酮得率的因素乙醇濃度和超聲溫度的曲面較陡，說明單獨(dú)作用時(shí)，這兩個(gè)因素對(duì)提取毛蔥黃酮的得率均有極顯著的影響，呈良好的二次關(guān)系。等高線趨近圓形，說明乙醇濃度與超聲溫度交互作用時(shí)，對(duì)黃酮得率沒有顯著的影響。隨著乙醇濃度和超聲溫度的增加，毛蔥黃酮得率下降。

2.2.3超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率的影響

超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率的影響的響應(yīng)面和等高線結(jié)果見下圖8、圖9。

由圖8、圖9可知，響應(yīng)面中影響毛蔥黃酮得率的因素超聲溫度和超聲時(shí)間的曲面較陡，說明單獨(dú)作用時(shí)超聲溫度及超聲時(shí)間對(duì)提取毛蔥黃酮的得率均有極顯著的影響，呈良好的二次關(guān)系。等高線不趨近圓形，說明超聲溫度與超聲時(shí)間交互作用時(shí)，對(duì)黃酮得率有顯著的影響。隨著乙醇濃度和超聲時(shí)間的增加，毛蔥得率提高。

2.2.4最佳工藝結(jié)果

由響應(yīng)面進(jìn)一步分析可得，兩兩因素共同作用對(duì)毛蔥得率的影響的大小順序是：乙醇濃度和超聲溫度＞乙醇濃度和超聲時(shí)間＞超聲時(shí)間和超聲溫度。可以得知最佳工藝條件為：乙醇濃度85.12%，超聲時(shí)間28.2 min，超聲溫度61.11℃，黃酮得率為2.024%。

2.3毛蔥黃酮的定性分析

提取的毛蔥黃酮經(jīng)Alcl3反應(yīng)產(chǎn)生少量黃綠色沉淀；與濃氨水反應(yīng)現(xiàn)象是在紫外燈下呈墨綠色熒光斑點(diǎn)，證明該提取物為黃酮類化合物。

圖8　乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響的響應(yīng)面Fig.8　Response surface of ethanol concentration and ultrasonic time

圖9　乙醇濃度和超聲時(shí)間對(duì)毛蔥黃酮得率影響的等高線Fig.9　Contour line of ethanol concentration and ultrasonic time

3　結(jié)論

本研究利用超聲波輔助法提取毛蔥中黃酮化合物，以超聲處理時(shí)間、超聲溫度、乙醇濃度進(jìn)行單因素試驗(yàn)，用大孔吸附樹脂對(duì)其進(jìn)行分離純化，得到黃酮的純提物。以毛蔥黃酮得率為試驗(yàn)指標(biāo)，確定了最佳工藝條件，然后用響應(yīng)面試驗(yàn)方法對(duì)工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，從而得出最佳工藝參數(shù)。結(jié)果表明：最佳工藝條件是：85.12%乙醇在61.11℃下提取28.2 min，毛蔥黃酮提取率達(dá)到2.024%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.013

收稿日期：2015-05-28

基金項(xiàng)目：吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目-毛蔥（鬼子蔥）的深加工技術(shù)及蔥油膠囊的研制（吉教科合字[2014]第375號(hào)）

作者簡介：劉超（1982—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)、生物活性物質(zhì)研究。

Ultrasonic Assisted Extraction of Flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don

LIU Chao，GAO Jiong-jie
（School of Food Technology，Jilin Agriculture Science and Technology College，Jilin 132101，Jilin，China）

Abstract：Ultrasonic assisted extraction of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don by ethanol was studied in this essay.After macroporous adsorption resin AB-8，the purified flavonoids were identified by AlCl3and ammonia reactions.Three impact factors such as ethanol concentration，ultrasonic time and temperature were determined and optimized by response surface method.And the optimal conditions were as follows：the Allium cepa L.var.Agrogatum Don was extracted by 85.12%ethanol at 61.11℃for 28.2 min，and the yield of flavonoids from Allium cepa L.var.Agrogatum Don was 2.024%.

Key words：Allium cepa L.var.Agrogatum Don；flavonoids；ethanol extraction；response surface