玉米須粗多糖體外抗氧化活性研究

周鴻立，張　碩，胡樂安，張　彬（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

玉米須粗多糖體外抗氧化活性研究

周鴻立，張碩，胡樂安，張彬
（吉林化工學(xué)院化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林吉林132022）

摘要：采用1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基、還原力4種模型研究玉米須粗多糖的抗氧化活性，試驗(yàn)結(jié)果表明玉米須粗多糖在濃度分別為0.1、1.0、2.0 mg/mL時(shí)對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基的半抑制濃度IC50分別為0.141、1.429、2.891 mg/mL，具有一定的還原能力，存在著明顯的量效關(guān)系，有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

關(guān)鍵詞：玉米須；多糖；自由基；體外抗氧化作用

玉米須（corn silk or stigma maydis）是禾本科作物玉米（Zea mays L.）的干燥花柱和柱頭，含有多種對人體有益的化學(xué)成分，如黃酮、皂苷、生物堿、多糖和有機(jī)酸等，具有多方面藥理作用[1]，資源豐富、價(jià)廉易得，其多糖具有增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤、降糖、利尿、解熱、利膽等作用，杜鵑[2]報(bào)道其毒性低，無法測到半數(shù)致死量（LD50），具有一定的開發(fā)價(jià)值。關(guān)于玉米須多糖提取純化及藥效學(xué)研究的比較多[3]，體外抗氧化研究的相對較少。其中梁子安等[4]研究了不含淀粉、蛋白質(zhì)和核酸的玉米須純化多糖，能明顯降低老年大鼠血清MDA含量及腦和肝組織Lf含量，明顯提高血清SOD，CAT，GSH-Px活性皮膚HYP含量；郭曉強(qiáng)等[5]分離得到2個(gè)單體多糖CSPS-1和CSPS-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)92.9%、95.3%，組分CSPS-1為中性糖對DPPH自由基具有輕微的清除作用，而組分CSPS-2為酸性糖對DPPH自由基生成具有促進(jìn)作用，2組分單糖對鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中超氧陰離子和Fenton反應(yīng)中羥基自由基均有清除作用，說明不同純度的多糖抗氧化活性有差異。目前臨床應(yīng)用水煎劑得到的成分主要為粗多糖，因此有必要研究玉米須粗多糖（CPCS）的體外抗氧化作用，為玉米須多糖的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

玉米須采自吉林省吉林市郊區(qū)，經(jīng)吉林大學(xué)王廣樹鑒定為甜黏1號，經(jīng)干燥處理后備用。1，1-二苯基苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國sigma公司進(jìn)口分裝；30%雙氧水、鄰二氮菲、三羥甲基氨基甲烷（trisbase）、鄰苯三酚、抗壞血酸（VC）、三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵、無水乙醇、EDTA-2Na等試劑均為分析純：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

752N紫外可見分光光度計(jì)、FA2004N電子天平：上海精密科學(xué)儀器有限公司；HH-S恒溫水浴鍋：江蘇金壇市正基儀器有限公司；GZX-GW·2-BS高溫干燥箱：上海博泰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；PHS-3C數(shù)字式酸度計(jì)：上海理達(dá)儀器廠；LDZ-5-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠；ZBP/C-YCL400P/3P超聲波藥品處理機(jī)：山東濟(jì)寧金百特。

1.2方法

1.2.1玉米須粗多糖的提取

玉米須干燥、粉碎過40目篩，稱取100 g放入5 000 mL的圓底燒瓶中，加入10倍量的水，浸泡過夜，加水至3 000 mL，90℃水浴加熱30 min，提取3次，第2、3次體積減半，濾液合并，濃縮至總體積1/4～1/3，加入無水乙醇至終濃度為70%，在冰箱靜止12 h，3 500 r/min離心10 min，真空干燥得玉米須粗多糖。

1.2.2玉米須粗多糖含量的測定

玉米須粗多糖含量測定采用苯酚—硫酸法[6]，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。

1.2.3清除DPPH自由基能力的測定

采用魯曉翔等[7]的方法。分別取0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同濃度的CPCS，在517nm處檢測吸光度。以0.002、0.004、0.006、0.008、0.010 mg/mL不同濃度梯度的VC作為陽性對照。2 mL蒸餾水加2 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液所測的吸光度為Ao；同體積樣品液加無水乙醇所測的吸光度為Aj；同體積樣品液加0.1 mmol/L的DPPH溶液所測的吸光度為Ai。

清除率/%=[1-（Ai-Aj）/Ao]×100

1.2.4清除羥基自由基能力的測定

采用Fenton法[8]研究。取0.75 mmol/L鄰二氮菲1 mL于試管中，依次加入PBS（pH 7.40）2 mL，蒸餾水1 mL，充分混勻后，加入0.75 mmol/L硫酸亞鐵1 mL，混勻，加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.12%的雙氧水1 mL，37℃水浴60 min，于536 nm處測定其吸光度Ap；用蒸餾水代替雙氧水，測定其吸光度Ab；用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL不同濃度的CPCS溶液代替蒸餾水1 mL，測定其吸光度As。以0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度梯度的VC做陽性對照。

清除率/%=（As-Ap）/（Ab-Ap）×100

1.2.5清除超氧陰離子自由基能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化法[9-10]。研究超氧陰離子自由基的清除作用。取0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mg/mL不同濃度的CPCS溶液，在325 nm波長測吸光度，V1為對照管鄰苯三酚的自氧化速率，△A/min；V2為樣品管鄰苯三酚的自氧化速率，△A/min。以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同濃度梯度的VC做陽性對照。計(jì)算對超氧陰離子自由基的清除率：

清除率/%=（V1-V2）/V1×100

1.2.6還原力的測定

采用戴晶晶的方法[11]。取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL不同濃度的CPCS 1 mL，在10 mL離心管中分別加入0.2 mol/L pH 6.6的磷酸緩沖液2.5 mL，加入2.5 mL 1%鐵氰化鉀，混合均勻后于50℃反應(yīng)20 min。取出后加入2.5 mL10%三氯乙酸終止反應(yīng)，5 000 r/min離心10 min。取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL三氯化鐵，混勻后靜置10 min，在700 nm處檢測吸光值。以0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL不同濃度的VC作為陽性對照，在波長700 nm條件下測定吸光度。

2　結(jié)果與分析

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線與多糖提取含量

回歸方程為A=7.530 1C+0.008 1，r2=0.999 8，玉米須粗多糖含量為24.44%。

2.2玉米須粗多糖清除DPPH自由基能力

玉米須粗多糖清除DPPH自由基能力見圖1。

圖1　清除DPPH自由基能力Fig.1　Scavenging effect on DPPH

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的質(zhì)子自由基，被廣泛應(yīng)用于抗氧化劑的研究中，具有穩(wěn)定、靈敏和簡便等優(yōu)點(diǎn)[12]。由圖1可知，CPCS在濃度為0.10 mg/mL時(shí)對DPPH自由基的清除率達(dá)到55.9%，而VC在濃度為0.01mg/mL時(shí)為92.92%，經(jīng)線性擬合計(jì)算得CPCS和VC的IC50分別為0.141 mg/mL和0.013 mg/mL。不同濃度的樣品對DPPH自由基的清除能力不同，隨著樣品濃度的增加，對DPPH自由基清除率越高，在試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)呈量效關(guān)系，這表明CPCS具有清除DPPH自由基的能力，清除效果不及VC。論文[6]中多糖濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到4.158%，雖然其純度（純度為92.9%）很高，其清除率卻不成比例，提示CPCS可能是多種抗氧化成分累加的結(jié)果，純度不能代表抗氧化作用。另外，也應(yīng)考慮該方法的主要缺陷是DPPH自由基會與其他自由基（如烷氧自由基）發(fā)生反應(yīng)，且自由基反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)的時(shí)間與抗氧化劑和DPPH的濃度比不成線性關(guān)系[13]，應(yīng)引起重視。鐘耀廣等[14]報(bào)道香菇多糖未脫蛋白和脫蛋白的多糖均具有抗氧化活性，均隨多糖濃度的增大而增大，但未脫蛋白的抗氧化活性高于脫蛋白的多糖，進(jìn)一步提示多糖的純度與抗氧化作用之間的不一致性。

2.3羥自由基清除率的測定

玉米須粗多糖清除羥基自由基能力見圖2。

圖2　清除羥基自由基能力Fig.2　Scavenging effect on hydroxyl radical

由圖2可知，當(dāng)CPCS的濃度為1.0mg/mL時(shí)，清除率為42.21%，而相同濃度VC的清除率為45.39%，經(jīng)線性擬合計(jì)算得CPCS和VC的IC50分別為1.429 mg/mL 和1.098 mg/mL。CPCS具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力，且隨著多糖質(zhì)量濃度的逐漸增加，對羥基自由基的清除能力也隨之增強(qiáng)，呈現(xiàn)良好的量效關(guān)系，但清除效果與VC接近。單體的多糖在濃度為2.0 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到43.8%，與粗多糖清除率接近。這說明粗多糖的羥基基團(tuán)能夠提供氫電子與羥基反應(yīng)，從而達(dá)到清除羥基自由基的效果，是否與雜質(zhì)在此體系沒有相關(guān)性或比較弱有待于進(jìn)一步探討。

2.4超氧陰離子自由基清除率的測定

玉米須粗多糖清除超氧陰離子能力見圖3。

圖3　清除超氧陰離子能力Fig.3　Scavenging effect on superoxide anion

由圖3可知，當(dāng)CPCS濃度達(dá)到2.0 mg/mL時(shí)，清除率為32.21%，而VC在濃度為0.1 mg/mL時(shí)清除率已達(dá)45.28%，增大CPCS濃度后，對超氧陰離子自由基的清除能力有增強(qiáng)的趨勢，即呈現(xiàn)出量效關(guān)系。超氧陰離子自由基是所有氧自由基中的第一個(gè)自由基，可以經(jīng)過一系列反應(yīng)產(chǎn)生其他氧自由基，與許多疾病有密切聯(lián)系，超氧陰離子自由基的清除對于保護(hù)機(jī)體細(xì)胞的早期氧化損傷至關(guān)重要[15]。經(jīng)線性擬合計(jì)算得CPCS和VC的IC50分別為2.891 mg/mL和0.144 mg/mL，CPCS對鄰苯三酚自氧化體系產(chǎn)生的超氧陰離子具有一定的清除作用，但清除作用較弱，論文[5]中多糖組分CSPS-1、CSPS-2在濃度為2.0mg/mL時(shí)清除率分別為47.7%、53.2%，CPCS清除率弱于單體多糖，說明CPCS中多種化學(xué)成分在這個(gè)體系中沒有協(xié)同作用，表明抗氧化作用的復(fù)雜性。

2.5玉米須粗多糖的還原能力的測定

玉米須粗多糖還原力作用見圖4。

圖4　還原力作用Fig.4　Reducing power

從圖4可知，隨著多糖濃度的增加，吸光度值逐漸增大，表示樣品的還原力越強(qiáng)[12]。在相同條件下，0.2 mg/mL VC在 700 nm處反應(yīng)體系的吸光度為1.139，而1.0 mg/mL的CPCS的吸光度為0.374。這表明粗多糖可以提供電子，并與自由基結(jié)合，轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的物質(zhì)，從而終止自由基的生成，具有一定的還原能力，其還原能力隨著樣品濃度的增大而增大，呈量效關(guān)系，但沒有VC還原能力強(qiáng)，未見CPCS還原能力測定的相關(guān)報(bào)道。

3　結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，CPCS對DPPH自由基、羥基自由基、超氧陰離子自由基有較好的清除作用，具有一定的還原能力，且濃度與清除率在一定濃度范圍內(nèi)呈量效關(guān)系，但CPCS清除效果較VC弱。論文[5]中的多糖雖然純度很高，但是在相同濃度的情況下清除DPPH自由基能力不如CPCS，究其原因，一方面可能與粗多糖中含有不同的化學(xué)成分有關(guān)：邸亞萍[16]研究發(fā)現(xiàn)玉米須黃酮的含量雖低但是其體內(nèi)、體外的抗氧化活性都很良好；也可能是由于粗多糖中多種級份多糖的含量有關(guān)，有報(bào)道認(rèn)為多糖自由基清除能力的差異可能是由于粗品多糖的自由基清除能力是多種級份多糖共同的貢獻(xiàn)[17]。另一方面可能是因?yàn)檎撐腫5]中用100℃、3 h提取條件提取玉米須多糖，溫度高、時(shí)間長，可能引起CPCS結(jié)構(gòu)的變化，從而影響了多糖的活性。

抗氧化活性的檢測方法與被測物的性質(zhì)、組成和監(jiān)測體系等密切相關(guān)，深入了解不同抗氧化活性檢測方法的原理、優(yōu)缺點(diǎn)和它們之間的關(guān)系，以及不同條件下對樣品抗氧化活性的檢測能力，對于全面、真實(shí)地了解抗氧化劑的活性具有重要的意義。但體外抗氧化研究反映的是一個(gè)側(cè)面，不足以全面了解多糖抗氧化作用。雖然CPCS抗氧化活性弱于VC，但在一定濃度范圍內(nèi)能夠抑制自由基引起的氧化損傷，對于離體大面積篩選抗氧化藥物有一定的價(jià)值。因此，還應(yīng)結(jié)合其它體內(nèi)外動(dòng)物模型以及技術(shù)手段，進(jìn)行較為全面的抗氧化作用評價(jià)，為高效利用玉米須多糖尋找新方法，也為開發(fā)高附加值玉米深加工產(chǎn)品提供參考。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.003

收稿日期：2014-03-06

基金項(xiàng)目：吉林省科技廳（20130303050NY）；吉林省教育廳（2013第319號）；吉林化工學(xué)院（2014059）

作者簡介：周鴻立（1967—），女（漢），教授，博士，研究方向：從事天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。

Study on Antioxidant Activity of the Crude Polysaccharide from Corn Silk in Vitro

ZHOU Hong-li，ZHANG Shuo，HU Le-an，ZHANG Bin
（College of Chemical and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin 132022，Jilin，China）

Abstract：4 methods including 1，1-diphenyl bitter basis phenylhydrazine（DPPH）free radical，hydroxyl free radical，superoxide anion free radicals and reducing power were used to evaluate the antioxidant activity of the crude polysaccharide from corn silk in vitro.And the crude polysaccharide of concentration values of 0.1，1.0 and 2.0 mg/mL respectively scavenged DPPH free radical，hydroxyl radical and super anion radical as half maximal inhibitory concentration IC50was values of 0.141，1.429 and 2.891 mg/mL，which had some reducing power，existed obviously concentration-response relationship.It is worthy of further study.

Key words：corn silk；polysaccharide；free radicals；antioxidant effect in vitro