一株植物乳桿菌產(chǎn)苯乳酸特性的研究

鄧　林，劉延嶺（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川都江堰611830）

一株植物乳桿菌產(chǎn)苯乳酸特性的研究

鄧林，劉延嶺
（四川工商職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川都江堰611830）

摘要：研究了一株植物乳桿菌DL-13產(chǎn)苯乳酸特性，通過反相液相色譜對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定。結(jié)果表明：DL-13能還原苯丙酮酸生成苯乳酸，最佳發(fā)酵條件為：溫度36℃，初始培養(yǎng)pH 7.0，苯丙酮酸濃度10 g/L，搖瓶轉(zhuǎn)速為100 r/min。在此條件下24 h時(shí)獲得最大苯乳酸含量為3.86 g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到38.6%。DL-13對(duì)其他底物如苯丙氨酸、苯丙酮酸鈉、苯丙酮酸銨、苯丙酮酸鈣等都具有一定的發(fā)酵能力。

關(guān)鍵詞：植物乳桿菌；苯乳酸；苯丙酮酸；特性

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是乳酸菌的一種，常存在于發(fā)酵的蔬菜和果汁中[1]。作為人體胃腸道的益生菌群，具有調(diào)節(jié)腸道內(nèi)菌群的平衡、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和降低膽固醇水平等保健作用[1-3]。除此之外，植物乳桿菌在發(fā)酵肉制品、發(fā)酵植物性食品等食品工業(yè)中應(yīng)用也十分廣泛[4]。

苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），也稱3-苯基乳酸或2-羥基-3-苯基丙酸，存在于天然蜂蜜中[5-6]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，苯乳酸作為天然抑菌物質(zhì)，可以抑制腐敗菌、致病菌，特別是對(duì)真菌的感染，有望在未來(lái)成為一種新型的防腐劑應(yīng)用于食品工業(yè)及藥物制劑[7]。

在前期試驗(yàn)中，研究了植物乳桿菌Lactobacillus plantarum DL-13的分離、鑒定。本試驗(yàn)以其為出發(fā)菌株，研究了其產(chǎn)苯乳酸的特性，以期為進(jìn)一步的菌種馴化選育及工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸奠定理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株

植物乳桿菌Lactobacillus plantarum DL-13：由我院食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏。

1.1.2試劑

苯乳酸：美國(guó)Sigma公司。其他試劑均為分析純：成都金山化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（MRS）：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖20.0 g，吐溫-80 1.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.6。

種子培養(yǎng)基：液體MRS培養(yǎng)基。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，牛肉膏10.0 g，酵母膏5.0 g，檸檬酸氫二銨2.0 g，葡萄糖10.0 g，苯丙酮酸10.0 g，吐溫-80 5.0 mL，乙酸鈉5.0 g，磷酸氫二鉀2.0 g，硫酸鎂 0.58 g，硫酸錳0.25 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 6.2～6.4。

1.2儀器與設(shè)備

DYZ-160P型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海德洋意邦儀器有限公司；721型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1100型高效液相色譜儀、Agilent Zorbax SB-C18 USP L1分析柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）：美國(guó)Agilent公司。

1.3方法

1.3.1菌體生長(zhǎng)量的測(cè)定

采用離心干重法[7]。取發(fā)酵液100 mL，6 500 r/min離心10 min，用PBS磷酸緩沖液（pH=7.4）洗滌3次，105℃干燥至恒重后稱重。

1.3.2還原糖的測(cè)定

采用DNS（3，5-二硝基水楊酸）法測(cè)定發(fā)酵液中的還原糖（以葡萄糖計(jì)）[8]。取3 mL DNS試劑加到1 mL離心過的發(fā)酵液中，混勻，于熱水浴中加熱15 min后迅速冷卻至室溫。加水定容至25 mL，充分混勻后于520 nm處測(cè)定吸光度。同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3苯乳酸合成過程的分析

在裝液量為25 mL的250 mL錐形瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵24 h后進(jìn)行分析，分別考察溫度、初始培養(yǎng)pH、苯丙酮酸濃度和搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響。

每隔2小時(shí)取一次樣，測(cè)定苯丙酮酸在苯乳酸產(chǎn)生過程中的變化情況。采用反相高效相色譜對(duì)苯丙酮酸分解前后的組成成分進(jìn)行分析、鑒定。

反相高效液相色譜法條件為：流動(dòng)相A為0.5g/L三氟乙酸溶液，B為乙腈溶液，洗脫程序是0～20 min為10%～100%B，20min～23min保持100%B。檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30℃；流速1 mL/min，進(jìn)樣量10 μL[9-10]。

2　結(jié)果與討論

2.1菌株DL-13的培養(yǎng)過程

菌株DL-13于36℃、初始培養(yǎng)pH 6.4，搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下，在發(fā)酵培養(yǎng)基上培養(yǎng)的過程參數(shù)見圖1。

菌株在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，當(dāng)培養(yǎng)基中葡萄糖在22 h左右徹底耗盡后，菌體干重達(dá)到最大值4.8 g/L。在培養(yǎng)過程中，pH在前2 h有稍微上升，接著逐漸下降，在12 h時(shí)降至6.0，最后降至4.3。

2.2發(fā)酵產(chǎn)物的鑒定

李興峰等研究發(fā)現(xiàn)[10]：在乳酸菌利用苯丙氨酸合成苯乳酸的過程中，轉(zhuǎn)氨反應(yīng)是限速步驟，成為苯乳酸產(chǎn)生的瓶頸，可以采用苯丙酮酸代替苯丙氨酸作為底物合成苯乳酸。本試驗(yàn)采用苯丙酮酸作為底物，使用反相高效相色譜對(duì)苯丙酮酸分解前后的組成成分進(jìn)行分析、鑒定。結(jié)果表明，苯丙酮酸在菌株DL-13的生長(zhǎng)代謝過程中，通過合成苯乳酸的途徑進(jìn)行分解。

圖1　菌株DL-13的培養(yǎng)過程Fig.1　Time course of strain DL-13

圖2　菌株DL-13發(fā)酵上清液的HPLC圖譜Fig.2　Chromatograms of strain DL-13 culture medium supernatant

2.3菌株DL-13的苯乳酸合成特性

2.3.1溫度對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響見圖3。

由于乳酸菌為中溫菌，目前乳酸菌利用苯丙酮酸發(fā)酵合成苯乳酸的反應(yīng)都選擇在30℃～37℃左右進(jìn)行[11]?？梢钥闯觯闐L-13合成苯乳酸的最佳溫度為36℃左右，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為38.0%，高于或低于此溫度，轉(zhuǎn)化率都有所降低，這與其他報(bào)道相符[11-12]。并且在高于37℃后，轉(zhuǎn)化率急速下降。說(shuō)明苯丙酮酸的分解和苯乳酸的生成與溫度具有相關(guān)性。低于36℃時(shí)，隨著溫度的升高，相關(guān)酶的活性增強(qiáng)，有利于苯乳酸的生成；而過高的溫度又會(huì)導(dǎo)致酶的變性失活，使合成效率大大降低。因此確定最佳發(fā)酵溫度為36℃。

2.3.2初始培養(yǎng)pH對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響初始培養(yǎng)pH對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響見圖4。

圖3　溫度對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響Fig.3　Effect of temperature on Phenyllactic acid production

圖4　初始培養(yǎng)pH對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響Fig.4　Effect of initial pH on Phenyllactic acid production

由于乳酸菌的最適生長(zhǎng)pH范圍為5.5～6.0，所以選取了pH 4.5～8.5進(jìn)行培養(yǎng)?？梢钥闯?，菌株DL-13合成苯乳酸的最佳pH為7，此時(shí)轉(zhuǎn)化率為38.5%，高于或低于此pH，轉(zhuǎn)化率都有所降低，這與其他報(bào)道一致[12]。并且在4.5～7的pH范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率緩慢增加，說(shuō)明菌株DL-13耐酸性較強(qiáng)。因此確定最佳初始培養(yǎng)pH為7.0。

2.3.3底物苯丙酮酸濃度對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響

在菌株DL-13合成苯乳酸的過程中，底物苯丙酮酸一方面可以通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)生成苯丙氨酸，一方面又可以通過還原反應(yīng)生成苯乳酸[13]。為了實(shí)現(xiàn)最大的苯乳酸得率，確定底物苯丙酮酸的最適添加濃度，在添加了不同苯丙酮酸濃度的MRS液體培養(yǎng)基中對(duì)菌株DL-13進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后檢測(cè)發(fā)酵液中苯乳酸的含量和轉(zhuǎn)化率，結(jié)果如圖5所示。

至10 g/L時(shí)，苯乳酸含量隨之增加至3.80 g/L，最大得率為38.0%。但隨后，雖然苯乳酸含量變化不明顯，由于底物苯丙酮酸濃度的增加，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率迅速降低。這可能由于參與相關(guān)反應(yīng)的酶已經(jīng)飽和，增加苯丙酮酸的濃度已無(wú)意義，因此確定苯丙酮酸在發(fā)酵培養(yǎng)基中的添加量為10 g/L。

2.3.4搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響

乳酸菌是一種兼性厭氧菌，在有氧或無(wú)氧環(huán)境中均能生長(zhǎng)繁殖?？稍谟醒酰∣2）或缺氧條件下，可通過不同的氧化方式獲得能量，兼有需氧呼吸和無(wú)氧發(fā)酵兩種功能。故在研究兼性厭氧菌發(fā)酵時(shí)，可根據(jù)所需選擇通氧量以獲得相應(yīng)結(jié)果[14]。搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響見圖6。

圖5　苯丙酮酸濃度對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響Fig.5　Effect of phenylpyruvic acid concentration on Phenyllactic acid production

圖6　搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DL-13合成苯乳酸的影響Fig.6　Effect of rotation speed on Phenyllactic acid production

可以看出，靜止培養(yǎng)也能獲得較大的生物量和苯乳酸含量，但是隨著搖瓶轉(zhuǎn)速的增加，50 r/min時(shí)，能獲得最大的生物量4.5 g/L，100 r/min時(shí)，能獲得最大的苯乳酸產(chǎn)量3.78 g/L。這可能是由于兼性厭氧菌在有氧的環(huán)境下進(jìn)行有氧呼吸大量繁殖，在無(wú)氧的環(huán)境下進(jìn)行無(wú)氧呼吸一般不繁殖而進(jìn)行發(fā)酵。綜合分析，選擇100 r/min搖瓶轉(zhuǎn)速進(jìn)行培養(yǎng)。

2.3.5DL-13轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯乳酸的過程

菌株DL-13于36℃，初始培養(yǎng)pH7.0，苯丙酮酸濃度10 g/L，搖瓶轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下，轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯乳酸的過程見圖7。

從圖7可知，培養(yǎng)4 h左右即有苯乳酸產(chǎn)生，8 h后快速增加，至24 h時(shí)達(dá)到最大，含量為3.86 g/L，此后逐漸下降。為了獲得最大得率，應(yīng)在24 h時(shí)停止培養(yǎng)并分離發(fā)酵產(chǎn)物。苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為苯乳酸的得率為38.6%。此外，苯乳酸產(chǎn)生的過程中還有少量的苯丙氨酸生成，且在24 h左右達(dá)到最大值?？梢钥闯觯奖彼崤c苯乳酸的合成大致一致。

2.4菌株DL-13對(duì)其他底物的利用實(shí)驗(yàn)

有文獻(xiàn)表明[15]，乳桿菌可以以苯丙氨酸、苯丙酮酸、苯丙酮酸鈉、苯丙酮酸銨、苯丙酮酸鈣等作為底物，發(fā)酵代謝合成苯乳酸。在36℃、初始培養(yǎng)pH 6.4，搖瓶轉(zhuǎn)速為150 r/min條件下的條件下，選取了數(shù)種具有代表性的底物進(jìn)行考察，研究菌株對(duì)這些化合物的利用情況。結(jié)果見表1。

圖7　菌株DL-13轉(zhuǎn)化苯丙酮酸生成苯乳酸的過程Fig.7　Phenyllactic acid production from phenylpyruvic acid by strain DL-13

表1　菌株DL-13對(duì)其他底物的利用Table 1　Utilization of other substrats by strain DL-13

可以看出，除了苯丙酮酸鈣外，其他形式的底物轉(zhuǎn)化率都達(dá)到了25%以上，且以苯丙酮酸銨的轉(zhuǎn)化率最高，為32.0%。這可能是由于鈣鹽的溶解性較差所致。

3　結(jié)論

通過對(duì)菌株DL-13的苯乳酸合成特性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)苯丙酮酸在菌株DL-13的生長(zhǎng)代謝過程中，通過合成苯乳酸的途徑進(jìn)行分解。在發(fā)酵過程中，溫度、pH、底物苯丙酮酸的濃度及搖瓶轉(zhuǎn)速對(duì)苯丙酮酸轉(zhuǎn)化和苯乳酸的合成都具有較大影響。

菌株DL-13實(shí)驗(yàn)室搖瓶條件下利用苯丙酮酸合成苯乳酸的最佳條件是溫度36℃，初始培養(yǎng)pH 7.0，苯丙酮酸濃度10 g/L，搖瓶轉(zhuǎn)速為100 r/min，在此條件下24 h時(shí)獲得最大苯乳酸含量，為3.86 g/L，苯丙酮酸轉(zhuǎn)化為苯乳酸的得率為38.6%。

研究還發(fā)現(xiàn)菌株DL-13對(duì)其他底物如苯丙氨酸、苯丙酮酸鈉、苯丙酮酸銨、苯丙酮酸鈣等都具有一定的發(fā)酵代謝能力，表明其在發(fā)酵生產(chǎn)苯乳酸方面具有很好的應(yīng)用價(jià)值。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.043

收稿日期：2015-05-04

基金項(xiàng)目：四川省教育廳課題（13ZB0364）

作者簡(jiǎn)介：鄧林（1977—），女（漢），副教授，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

Study on Phenyllactic Acid Production Characteristics of Lactobacillus Plantarum

DENG Lin，LIU Yan-ling
（Sichuan Technology and Business College，Dujiangyan 611830，Sichuan，China）

Abstract：Phenyllactic acid production characteristics of Lactobacillus plantarum DL-13 was studied.The production of fermentation was identified by HPLC.The results showed that phenylpyruvic acid was reduced by strainDL-13intophenyllacticacid3.86g/Lphenyllactic acid content was received after culturing DL-13 24 hours under the optimal fermentation condition：temperature 36℃，initial pH 7.0，phenylpyruvic acid content 10 g/L and shaking speed 100 r/min.The conversion rate was 38.6%.DL-13 could also ferment other substrates such as phenylalanine，sodium phenylpyruvate，phenylpyruvic acid ammoniumand calcium phenylpyruvate.

Key words：Lactobacillus plantarum；phenyllactic acid；phenylpyruvic acid；characteristic