HPLC法測定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量

宋永朋，馬華麗（青海省輕工業(yè)研究所有限責(zé)任公司，青海西寧810001）

HPLC法測定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量

宋永朋，馬華麗
（青海省輕工業(yè)研究所有限責(zé)任公司，青海西寧810001）

摘要：采用高效液相色譜法測定白刺籽中槲皮素和山萘酚的含量。采用的條件為Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相甲醇-水（含0.4%的磷酸）48∶52的比例線性洗脫，流速1 mL/min；檢測波長360 nm；柱溫35℃。兩種成分均達(dá)到基線分離，槲皮素的線性范圍為0.029 28 μg～0.204 96 μg，山萘酚的線性范圍為0.003 4 μg～0.011 9 μg；槲皮素的平均回收率為100.7%（RSD=2.1%），山萘酚的平均回收率為98.5%（RSD=1.7%）。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜；槲皮素；山萘酚；白刺籽

白刺為蒺藜科白刺屬甘青白刺（Nitraria tangutorum Bor）的果實，俗稱酸胖、地棗、沙櫻桃等。白刺作為沙漠中罕見的野生漿果，即可鮮食，又可入藥。具有健脾胃，助消化，安神，解表，下乳等功效，可治療脾胃虛弱、消化不良、神經(jīng)衰弱、月經(jīng)不調(diào)等癥[1]。采用樹脂及正反相硅膠色譜柱從白刺籽中分離純化出6種化合物，經(jīng)波譜分析鑒定為胡蘿卜苷、4-羥基六氫吡啶羧酸、槲皮素、尿囊素、1-甲基-1，2，3，4四氫-B-咔啉-3-羧基酸，L-酪氨酸[2]。但用高效液相色譜法測定上述化學(xué)成分含量的方法鮮見報道，由于對照品的局限性，本文現(xiàn)只對于白刺籽中槲皮素和山萘酚進行了方法學(xué)研究。

1　儀器、試劑及樣品采集

1.1儀器

Agilent1100高效液相色譜儀、KQ3200B超聲波清洗器：昆侖超聲儀器有限公司；FZ102植物試樣粉碎機：天津市泰斯特儀器有限公司；ME2353電子天平：北京賽多利斯儀器有限公司。

1.2試劑及材料

甲醇（色譜純）：山東禹王實業(yè)有限公司禹城化工廠；二次蒸餾水、磷酸（分析純）：北京紅星化工廠；槲皮素（批號100081-200406）和山萘酚（批號110861-200405）對照品：中國藥品生物制品檢定所。白刺籽是白刺果經(jīng)壓榨后得到的種子。白刺籽晾干后粉碎過80目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

2　方法與結(jié)果

2.1溶液配制

2.1.1對照品儲備液

準(zhǔn)確稱取對照品槲皮素0.366mg、山萘酚0.034mg、分別置10 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容，配制成相應(yīng)濃度的對照品儲備液，使用時稀釋為所需濃度。

2.1.2樣品溶液

準(zhǔn)確稱取粉碎至80目的白刺籽樣品2.000 4 g，加入甲醇15 mL，超聲提取45 min，抽濾，以甲醇洗滌濾渣2次，每次1 mL。濾渣重復(fù)上述操作3次，所得濾液與前一次濾液合并，濃縮后定容至50 mL。過0.45 μm濾膜，在選定色譜條件下測定有效成分的含量。

2.2色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流動相：甲醇和水（含0.04%磷酸）=48∶52；流速1 mL/min；檢測波長為360 nm，柱溫35℃。該色譜條件下槲皮素和山萘酚2種成分均被洗脫且達(dá)到基線分離，保留時間分別為12.001、20.179 min，見圖1。

圖1　對照品及樣品色譜圖Fig.1　Chromatograms of chemical reference subetancea and sample

2.3線性關(guān)系考察

精密量取2種對照品儲備液，以甲醇溶解，配成濃度分別為槲皮素0.029 28、0.058 56、0.087 84、0.117 12、0.1464、0.20496mg/mL；山萘酚0.0034、0.0051、0.0068、0.008 5、0.010 2、0.011 9 mg/mL的對照品標(biāo)液系列溶液，每次進樣5 μL，以峰面積的積分值定量。槲皮素、山萘酚的回歸方程分別如下：A=3 852.6C-7 362，r2= 0.999 2；A=18 961C+2.150 5，r2=0.998 8；（見圖2、圖3）線性范圍分別為0.029 28 μg～0.204 96 μg，0.003 4 μg～0.011 9 μg。

圖2　槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　Standard curve of quercetin

圖3　山萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3　Standard curve of kaemferol

2.4檢測限

在選定的色譜條件下，當(dāng)信噪比S/N=3時，對各組分最低檢測限進行測定，結(jié)果槲皮素、山萘酚的最低檢測限分別為0.25、0.38 ng。

2.5精密度試驗

取濃度為 0.073 2 mg/mL槲皮素，山萘酚0.004 25 mg/mL對照品溶液，在選定的色譜條件下測定色譜峰的峰面積，經(jīng)計算RSD分別為0.64%、0.49% （n=5），表明儀器精密度良好。

2.6重復(fù)性試驗

準(zhǔn)確稱取白刺籽樣品2.0 g，共6份，按“2.1.2”方法操作，在選定的色譜條件下測定槲皮素、山萘酚的含量，經(jīng)計算RSD分別為1.4%、2.3%（n=5），表明該方法重復(fù)性良好。

2.7回收試驗精密

準(zhǔn)確稱取3份已測知含量的白刺籽樣品各0.5g，添加各對照品溶液適量，按“2.1.2”方法操作，測得槲皮素、山萘酚平均回收率（n=5）分別為100.7%、98.7%，RSD分別為2.1%、1.7%?；厥章试囼灲Y(jié)果見表2。

表2　回收率試驗結(jié)果（n=5）Table 2　Recoveries of added sample（n=5）

3　結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

取2.1.2制備的樣品溶液按上述色譜條件進行分析，經(jīng)DAD檢測器檢測上述2種待測組分的峰純度且其紫外光譜與對照品一致后，按外標(biāo)法以峰面積積分值計算，得3種有效成分的含量（每個樣品重復(fù)進樣3次，取平均值置信區(qū)間95%）結(jié)果白刺籽中槲皮素的含量為1.987 2 μg/μL、山萘酚的含量為0.019 6 μg/μL。

3.2討論

3.2.1檢測波長的確定

上述對照品溶液分別進樣后，利用DAD檢測器在200 nm～400 nm掃描其吸收光譜，槲皮素和山萘酚對照品均在360 nm波長處有較高的吸收[3-4]，故選擇該波長為檢測波長。

3.2.2流動相的選擇

上述2種有效成分色譜峰易拖尾，經(jīng)試驗，當(dāng)在水中加入0.004%（體積比）磷酸時可改善槲皮素和山萘酚的峰形，故選擇甲醇和含0.004%磷酸的水做流動相。

總之，用HPLC法測定白刺籽中2種成份的含量，具有分析簡便快速、結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點，對全面評價藥物質(zhì)量有積極的作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]中國科學(xué)院冰川凍土沙漠研究所.中國沙漠地區(qū)藥用植物[M].蘭州:甘肅人民出版社,1973:538

[2]王洪倫,李玉林,王小燕,等.柴達(dá)木盆地唐古特白刺種子的化學(xué)成分研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2007,19(4):614-616

[3]盧永昌,閆紅.HPLC測定雪蓮中蘆丁和槲皮素的含量[J].華西藥學(xué)雜志,2007,22(1):79-80

[4]趙文彬,劉金榮,樊蓮蓮,等.從槐米中提取槲皮素方法的研究[J].石河子大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2006,24(3):301-304

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.035

收稿日期：2014-04-02

基金項目：科技部科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金（12C26216307131）

作者簡介：宋永朋（1986—），男（漢），助理研究員，研究生，現(xiàn)從事青藏高原特色生物資源開發(fā)工作。

Determination of Quercetin and Kaemferol in the Seed of Nitraria Tangutorum Bobr by HPLC

SONG Yong-peng，MA Hua-li
（Qinghai Light Industry Institute Co.，Ltd，Xining 810001，Qinghai，China）

Abstract：To determination the content of quercetin and rantiliroside of Nitraria tangutorum Bobr by HPLC.The samples were separated with the column of Hypersil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）which was eluted with methanol and water（0.04%phosphoric acid）in 48∶52 with detected wavelength at 360 nm，flow rate at 1 mL/ min，column temperature at 35℃.The results indicated that two compounds were basically insolated.The linear ranges of quercetin and kaemferol were 0.029 28 μg-0.204 96 μg，0.003 4 μg-0.011 9 μg respectively；the average recoveries were 100.7%（RSD=2.1%），98.5%（RSD=1.7%）respectively.

Key words：HPLC；quercetin；kaemferol；Nitraria tangutorum Bobr