不同花粉多酚類物質(zhì)組成比較

李紅兵，米　佳，張林鎖，羅　青，李曉鶯，曹有龍，李越鯤，戴國禮，冉林武，閆亞美，*（.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，寧夏銀川75000；.國家枸杞花粉工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川75000；.北方民族大學(xué)生命學(xué)院，寧夏銀川750004）

不同花粉多酚類物質(zhì)組成比較

李紅兵1，米佳2，張林鎖3，羅青2，李曉鶯2，曹有龍2，李越鯤2，戴國禮2，冉林武1，閆亞美2，*
（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，寧夏銀川750002；2.國家枸杞花粉工程技術(shù)研究中心，寧夏銀川750002；3.北方民族大學(xué)生命學(xué)院，寧夏銀川750004）

摘要：采用分光光度計(jì)法、HPLC、HPLC-MS法分析測定、鑒定枸杞花粉等多酚類物質(zhì)含量及主要組成。結(jié)果表明，枸杞花粉等6種不同多酚類物質(zhì)來源的植物材料總多酚類物質(zhì)含量的變化幅度為0.82 g/100 g～3.92 g/100 g。其中油菜花粉總多酚類物質(zhì)含量最高，其次是枸杞花粉。各種花粉中的主要多酚類物質(zhì)是黃酮類。枸杞花粉黃酮類物質(zhì)含量分別是荷花花粉、油菜花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉和茶花粉的1.42、0.72、2.78、1.20、2.37倍。初步分離鑒定出枸杞花粉多酚類物質(zhì)10個(gè)，其中主要組分有3個(gè)，含量均大于其它所測市售花粉。結(jié)果表明，較其它5種蜂花粉材料，枸杞花粉中多酚類物質(zhì)主要組分與之差異較大，是較好的開發(fā)功能性食品的資源。

關(guān)鍵詞：枸杞花粉；不同市售花粉；多酚類物質(zhì)

蜂花粉作為植物遺傳基因源，富含多酚類物質(zhì)特別是黃酮類化合物、多糖等多種功效成分[1-3]，具有抗氧化、抑菌、美容、治療前列腺增生等作用[1-4]。

氧化應(yīng)激是許多慢性退行性疾病發(fā)生發(fā)展的主要機(jī)制。探尋和研究具有抗氧化活性的天然植物化學(xué)物用于防治衰老相關(guān)的多種疾病，如阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化等，成為醫(yī)藥、植物化學(xué)等多個(gè)學(xué)術(shù)領(lǐng)域共同關(guān)注的課題。

多酚類物質(zhì)是隸屬于黃酮類化合物的一類多酚類物質(zhì)。大量體內(nèi)外研究表明，多酚類物質(zhì)通過其較強(qiáng)的抗氧化清除自由基作用[5-9]，顯示出抗炎、保護(hù)心血管、抗腫瘤等多種生物活性。因此許多富含多酚類物質(zhì)的物質(zhì)如藍(lán)莓、葡萄皮等在國外已經(jīng)得到了開發(fā)利用。

傳統(tǒng)藥食兩用滋補(bǔ)品枸杞，是目前我國西北地區(qū)特別是寧夏、青海、內(nèi)蒙等地廣泛種植的經(jīng)濟(jì)林木之一?！侗静菥V目》載：枸杞，春采葉，名“天精草”；夏采花，名“長生草”；秋采果，名“枸杞子”；冬采根，名“地骨皮”，即其根、莖、葉、花、果均為寶貴藥材，但枸杞蜂花粉的研究少見報(bào)道。本文開展了枸杞蜂花粉與其它5種市售蜂花粉多酚類物質(zhì)的含量及組成研究，旨在為枸杞新資源開發(fā)的研究奠定基礎(chǔ)，為拓寬枸杞大產(chǎn)業(yè)加工領(lǐng)域，使其向功能性食品和藥品的精深領(lǐng)域發(fā)展提供科學(xué)理論參考。

1　材料和方法

1.1材料與試劑

枸杞花粉采摘于國家枸杞花粉工程技術(shù)研究中心資源圃。其它新鮮市售花粉購于市場。采集或采購的花粉于-23℃保存。

DPPH（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl）、ABTS [2，2’-azinobis（3-ethylbenzenothiazoline-6-sulfonic）]、TPTZ（1，3，5-tri（2-pyridyl）-2，4，6-triazine）、VC、Folin-Ciocalteu試劑：購自美國Sigma公司；色譜純甲醇、三氟乙酸：購自MREDA公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2儀器與設(shè)備

1260高效液相色譜儀、AgilentZORBAX Stable Bond SB-C18 880975-902色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：安捷倫，美國；TSQ三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：THERMO；RE-5286旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；UV755B紫外可見光分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；KQ-250E型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1樣品的制備

取3.00 g枸杞花粉等6種花粉研磨粉末，加50 mL 1%甲酸甲醇溶液，勻漿，超聲提取30 min，重復(fù)3次，合并濾液濾紙抽濾，取上清液，用0.45 μm濾膜過濾，定容至200 mL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2總酚含量的測定

總酚含量的測定參考Liu等[10]的方法并稍作修改。將0.5 mL提取液加入到盛有1 mL蒸餾水的試管中，再加入0.3 mL稀釋10倍的Folin-Ciocalteu試劑，混勻，加入3mL1mol/LNa2CO3溶液，充分混勻后，在25℃黑暗處反應(yīng)80、760 nm處測定吸光度值。樣品中總酚含量以每100克花粉中沒食子酸當(dāng)量（g GAE/100 g）表示。

1.2.3黃酮含量的測定

黃酮含量的測定參考Liu等[11]的方法并稍作修改。取0.5 mL提取液置于盛有4 mL 30%乙醇的試管中，加入0.5 mL 5%NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min，加入0.5 mL 10%Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置6 min，加入1 mol/L NaOH溶液4 mL，靜置5 min后，定容至15 mL，在510 nm下測定吸光度值。樣品中黃酮含量以每100g花粉中蘆丁當(dāng)量（g RE/100 g）表示。

1.2.4枸杞花粉活性成分分離、鑒定

1.2.4.1色譜條件的選擇

流動相A：2%乙酸水溶液，B：甲醇；流速：1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：30℃。梯度洗脫條件如表1所示。

表1　HPLC梯度洗脫條件Table 1　The requirement of HPLC gradient elution

1.2.4.2枸杞花粉多酚類物質(zhì)HPLC-MS分離鑒定

1）枸杞花粉多酚類物質(zhì)HPLC分析條件同上。

2）枸杞花粉多酚類物質(zhì)MS分析條件

枸杞花粉多酚類物質(zhì)MS分析條件如表2所示。

表2　枸杞花粉多酚類物質(zhì)MS分析條件Table 2　The analysis requirement of MS

1.3統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003、SPSS 16.0、中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件（國家藥典委員會）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及分析。

2　結(jié)果分析與討論

2.1不同市售花粉多酚類物質(zhì)組成及含量比較

不同市售花粉多酚類物質(zhì)組成及含量比較如表3所示。

表3　不同市售花粉多酚類物質(zhì)含量及特征組分Table 3　The compositions and contents of polyphenol in different bee pollen

由表3可知，所選的6種富含多酚類物質(zhì)活性物質(zhì)的市售花粉中，各種市售花粉多酚類物質(zhì)含量差異較大，但主要的物質(zhì)為黃酮類化合物。其中，油菜花粉多酚類物質(zhì)含量最高，枸杞花粉次之，蕎麥花粉含量最小。枸杞花粉多酚類物質(zhì)含量分別是油菜花粉、荷花花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉和茶花粉的0.72、1.42、2.78、1.20和2.37倍。枸杞花粉資源是富含多酚類物質(zhì)的資源。

2.2各種市售蜂花粉多酚類物質(zhì)的HPLC指紋圖譜

HPLC分析不同花粉多酚，主要依據(jù)色譜的保留時(shí)間和峰面積，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版軟件（國家藥典委員會），輸入各樣品色譜圖，譜圖間距設(shè)置為30，得到不同花粉多酚HPLC色譜疊加圖（S1-S6），見圖1。

圖1　不同蜂花粉多酚類物質(zhì)HPLC圖Fig.1　HPLC profile of polyphenol（280 nm）of different bee pollen

設(shè)定枸杞花粉樣品為參照圖譜，時(shí)間窗設(shè)定為0.1，將各色譜峰進(jìn)行匹配，如表4所示。

表4　不同花粉多酚HPLC指紋圖譜匹配結(jié)果Table 4　The matching results of the polyphenols HPLC finger printing in different pollen

各種花粉多酚沒有共有峰，且枸杞花粉主要多酚組分只有3個(gè)，保留時(shí)間分別為40.18、47.78 min、和69.98 min，除了油菜花粉含有極少量共有化合物外，其它花粉均未含有。因此，枸杞花粉多酚組成有別于其它所測花粉。且該化合物峰面積遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它花粉主要組分峰面積，即可能含量遠(yuǎn)高于其它花粉。

2.3枸杞花粉多酚類物質(zhì)主要組分分離鑒定

HPLC-MS法是目前多酚類物質(zhì)分離鑒定的主要方法之一[12-14]，主要依據(jù)色譜的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息包括分子量信息等，參照文獻(xiàn)信息進(jìn)行化合物的鑒定。HPLCVAD-MS分離鑒定的枸杞花粉多酚類物質(zhì)準(zhǔn)分子離子、保留時(shí)間、及碎片離子信息如圖1～圖4及表5所示。

圖2　枸杞花粉主要多酚化合物（峰5）MS+圖Fig.2　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

圖3　枸杞花粉主要多酚化合物（峰7）MS+圖Fig.3　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

表5　枸杞花粉多酚類物質(zhì)HPLC-MS鑒定的分子量及結(jié)構(gòu)Table 5　Phenolic componds identified in the extract of Lycum pollen

圖4　枸杞花粉主要多酚化合物（峰8）MS+圖Fig.4　MS+of the polyphenols main fractions from Lycum Barbarum pollen

3　結(jié)論

較5種常見的天然市售花粉材料，枸杞花粉中富含多酚類物質(zhì)，特別是黃酮類物質(zhì)。枸杞花粉多酚類物質(zhì)含量分別是荷花花粉、油菜花粉、蕎麥花粉、向日葵花粉和茶花粉的0.72、1.42、2.78、1.20和2.37倍。除此外，枸杞花粉在成分組成上有別于其它花粉多酚類物質(zhì)構(gòu)成。該研究揭示，枸杞花粉可能作為較好的開發(fā)功能性食品的資源。對于其不同于其它花粉的多酚類物質(zhì)組成成分、及其構(gòu)效關(guān)系等，有待于進(jìn)一步研究。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.030

收稿日期：2014-08-05

基金項(xiàng)目：寧夏回族自治區(qū)自然基金（NZ13101、NZ13128）；寧夏農(nóng)林科學(xué)院院先導(dǎo)項(xiàng)目（NKYQ-13-01、NKYJ-15-16）

作者簡介：李紅兵（1968—），男（漢），實(shí)驗(yàn)師，大專，從事天然藥物研究工作。

*通信作者：閆亞美（1982—），女（漢），副研究員，博士，從事枸杞深加工研究工作。

The Difference of the Compositions of Polyphenols from Different Bee Pollen

LI Hong-bing1，MI Jia2，ZHANG Lin-suo3，LUO Qing2，LI Xiao-ying2，CAO You-long2，LI Yue-kun2，DAI Guo-li2，RAN Lin-wu1，YAN Ya-mei2，*
（1.Laboratory Animal Center，Ningxia Medical University，Yinchuan 750002，Ningxia，China；2.National Wolfberry Engineering Research Center，Yinchuan 750002，Ningxia，China；3.College of Bionomy，Northern Nationality University，Yinchuan 750004，Ningxia，China）

Abstract：The polyphonols of of the 6 different kinds of bee pollen，including Lycum Barbarum Pollenwere evaluated in the study.The total contents of polyphenol were measured using spectrophotometer methods.HPLC and HPLC-MS methods were used to analyze the composition of the polyphenols.The results showed that the total polyphenols of 6 different kinds of bee pollen were 0.82 g/100 g-3.92 g/100 g.Comparatively，the total polyhenols content of Lycium ruthenicum pollen was 1.42 times，0.72 times，2.78 times，1.20 times，and 2.37 times higher than that of Hindu Lotus pollen，rape pollen，F(xiàn)agopyrum esculentum Moench pollen，sunflower pollen and camellia pollen.10 polyphenols in Lycum Barbarum pollen were identified.Comparatively，Lycum Barbarum pollen had the higher value of total polyphenol content.It is a rich source of polyphenol，and one kinds of good resources for development of healthy food.

Key words：Lycum Barbarum pollen；different bee pollen；polyphenol