基于金/銀納米三明治結(jié)構(gòu)SERS特性的超靈敏前列腺特異性抗原檢測

封 昭,周 駿*,陳 棟,王少敏,王小軍,謝樹森

(1.寧波大學理學院微電子科學與工程系,浙江寧波 315211; 2.寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院,浙江寧波 315020; 3.福建師范大學醫(yī)學光電科學與技術(shù)教育部重點實驗室,福建省光子技術(shù)重點實驗室,福建福州 350007)

基于金/銀納米三明治結(jié)構(gòu)SERS特性的超靈敏前列腺特異性抗原檢測

封 昭1,周 駿1*,陳 棟1,王少敏2,王小軍2,謝樹森3

(1.寧波大學理學院微電子科學與工程系,浙江寧波 315211; 2.寧波大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院,浙江寧波 315020; 3.福建師范大學醫(yī)學光電科學與技術(shù)教育部重點實驗室,福建省光子技術(shù)重點實驗室,福建福州 350007)

基于金/銀納米三明治結(jié)構(gòu)的表面增強拉曼散射(SERS)特性,實現(xiàn)了前列腺特異性抗原(PSA)高靈敏度免疫檢測,檢測結(jié)果具有特異性。采用化學還原法制備金、銀納米粒子,用4-巰基苯甲酸(4-MBA)及前列腺特異性抗體(Anti-PSA)鏈接金、銀納米粒子制備免疫探針,在硅片表面原位生長金、銀納米粒子并鏈接Anti-PSA制備得到免疫基底。將免疫探針、免疫基底以及PSA組成三明治結(jié)構(gòu),進行基于SERS特性的免疫檢測。實驗結(jié)果表明,納米銀免疫探針與納米銀免疫基底組成的三明治結(jié)構(gòu)具有最佳的檢測效果,PSA的檢測靈敏度低至1.8 fg/mL(3.490×10-18mol/L),可應用于前列腺癌癥的早期檢測與診斷。

表面增強拉曼散射;納米免疫探針;納米免疫基底;免疫檢測

1 引 言

目前,癌癥已經(jīng)嚴重威脅人類的健康,并成為主要死因之一。世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布的《世界癌癥報告2014》估計,2030年全世界癌癥死亡人數(shù)將達到1 300萬人[1]。同時,世界衛(wèi)生組織提供的數(shù)據(jù)也顯示,1/3癌癥患者通過早期發(fā)現(xiàn)和早期治療,可以得到根治,如1期的乳腺癌、鼻咽癌和喉癌等5年存活率接近100%[1]。而現(xiàn)在臨床檢測發(fā)現(xiàn)的患者往往己經(jīng)處于癌癥中晚期而無法痊愈,甚至存活期不到1年。因此,開展癌癥的早期診斷技術(shù)研究,對于人民健康、社會和諧和經(jīng)濟持續(xù)發(fā)展,具有重大意義。

近年來,隨著分子生物學的發(fā)展,人們對癌癥病因和病理的認識不斷深化,特別是腫瘤標志物(Tumormarker)的發(fā)現(xiàn),對癌癥的早期診斷、預后和療效評價以及高危人群隨訪等都具有極大的實用價值。另一方面,基于貴金屬納米粒子表面增強拉曼散射(SERS)特性的生物傳感技術(shù),因其具有更高的空間分辨率和靈敏度,可以達到單分子檢測水平,顯示出良好的應用前景[2-6]。基于貴金屬納米粒子SERS特性的腫瘤標志物免疫檢測技術(shù)已成為當前的研究熱點[7-10]。

本文應用化學還原法合成出均勻性良好的金、銀納米粒子,然后與拉曼標記分子4-巰基苯甲酸(4-MBA)和前列腺特異性抗體(Anti-PSA)修飾鏈接制備金、銀納米免疫探針,并在硅片表面原位生長金、銀納米粒子層后鏈接Anti-PSA制備納米金或納米銀免疫基底,與前列腺特異性抗原(PSA)組合成為三明治結(jié)構(gòu),進行基于SERS特性的免疫檢測實驗。結(jié)果表明,銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的三明治結(jié)構(gòu)對PSA的檢測濃度低至1.8 fg/mL(3.49×10-18mol/ L),且具有很好的特異性。

2 實 驗

首先由化學還原方法分別合成金、銀納米粒子,然后依次將拉曼標記分子4MBA和Anti-PSA鏈接到納米粒子表面,再用牛血清白蛋白(BSA)包裹裸露的納米粒子表面,即制備得到金、銀納米免疫探針。接下來,將經(jīng)HF處理過的硅片浸入HAuCl4或AgNO3溶液,待金或銀離子在硅表面還原生成島狀納米膜后,滴加Anti-PSA溶液,即制備得到鏈接Anti-PSA分子的免疫基底。

在免疫檢測過程中,首先將20μL的PSA滴加在制備的免疫基底上,在37℃下置放3 h后,分別用0.05%Tween 20的TPS緩沖液、三羥甲基氨基甲烷(TBS)緩沖液和去離子水清洗去除未結(jié)合的抗原。然后,再滴加20μL免疫探針溶液到基底表面,在4℃下放置2 h后,分別用0.05%Tween 20的TBS緩沖液、TBS緩沖液和去離子水清洗,經(jīng)氮氣吹干,即形成由免疫基底、抗原和4-MBA標記的免疫探針組成的三明治結(jié)構(gòu),如圖1所示。

最后,將制備的納米金免疫基底、納米銀免疫基底、PSA和4-MBA標記的金、銀免疫探針分別組合成4種免疫三明治結(jié)構(gòu)用于拉曼光譜測量。

圖1 由金免疫基底、銀納米粒子免疫探針和前列腺特異性抗原組成的免疫三明治結(jié)構(gòu)。Fig.1 Sketch map of the standard sandwich protocol of SERS-based immunoassay

3 結(jié)果與討論

3.1 金、銀納米粒子免疫探針的特性

圖2為所合成的金、銀納米粒子的掃描電子顯微鏡(SEM)照片。從圖2可以看出,金納米粒子的平均直徑為(20±5)nm,銀納米粒子的平均直徑為(80±15)nm。金、銀納米粒子和4-MBA標記的金納米免疫探針的紫外-可見吸收光譜如圖3所示,其中曲線1和曲線2以水作為參比溶液,曲線3以磷酸鹽緩沖液作為參比溶液。從圖3(a)可見,所制備的金納米粒子的吸收峰位于520 nm處,其狹窄的半高寬反映出良好的分散性。加入4-MBA后,吸收峰從520 nm紅移到527 nm,說明4-MBA分子成功地鍵合在金納米粒子表面形成S—Au鍵[11];同時,由于金納米粒子的團聚,在673 nm處出現(xiàn)了一個新吸收峰[12-13]。加入anti-PSA后,金納米粒子的吸收峰又分別從527 nm和673 nm紅移至536 nm和684 nm,說明Anti-PSA成功吸附到4-MBA標記的金納米粒子表面。在圖3(b)中,銀納米粒子的最大吸收峰位于409 nm處,狹窄的半高寬同樣反映出良好的分散性。加入4-MBA后,銀納米粒子表面形成S—Ag鍵,吸收峰從409 nm紅移到426 nm,同時峰寬增加,說明4-MBA已與銀納米粒子鍵合并導致銀納米粒子部分團聚。加入Anti-PSA后,吸收峰又從426 nm紅移至438 nm處,表明抗體成功地吸附在4-MBA標記的銀納米粒子表面。圖3(c)是實驗測量中4-MBA溶液和免疫探針中PSA溶液的吸收光譜,從圖中可以看出這2種試劑在可見光范圍內(nèi)的吸收很小,對總的吸收光譜的貢獻可以忽略,進一步證明圖3(a)和圖3(b)中吸收峰的改變主要是分子與納米粒子鍵合引起的。

圖2 金納米粒子(a)和銀納米粒子(b)的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.2 SEM images of Au NRs(a)and Ag NRs(b)

圖3 (a)金納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的金納米粒子(曲線2)和4-MBA標記的金納米免疫探針(曲線3)的吸收光譜;(b)銀納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的銀納米粒子(曲線2)和4-MBA標記的銀納米免疫探針(曲線3)的吸收光譜;(c)4-MBA溶液和PSA溶液的吸收光譜。Fig.3 (a)Absorbance spectra of Au NPs(curve 1),4-MBA-labelled Au NPs(curve 2),and 4-MBA-labelled immune nano-Au probes(curve 3),respectively.(b)Absorbance spectra of Ag NPs(curve 1),4-MBA-labelled Ag NPs(curve 2),and 4-MBA-labelled immune nano-Ag probes(curve 3), respectively.(c)Absorbance spectra of 4-MBA solution and PSA solution.

在相同的測量條件下,4-MBA標記的金、銀納米粒子以及對應的免疫探針的SERS光譜如圖4所示?？梢钥闯?4-MBA標記的金、銀納米粒子的SERS信號明顯強于4-MBA標記的金、銀納米粒子免疫探針的SERS信號。正如我們報道過的,上述現(xiàn)象說明抗體修飾納米粒子后并沒有使4-MBA標記的納米粒子進一步團聚,而是增加納米粒子之間的距離使得熱點減少,從而導致拉曼信號減弱[13]。此外,金、銀納米粒子的增強因子(EF)可由公式EF=NbulkISERS/NSERSIbulk計算,式中Nbulk與Ibulk分別代表照射體積內(nèi)的4-MBA分子數(shù)以及拉曼峰的積分強度,NSERS與ISERS代表照射體積內(nèi)吸附在納米粒子表面的4-MBA分子數(shù)以及表面增強拉曼峰的積分強度。由圖4可得Ibulk= 6.1×103,吸附在金、銀納米粒子中4-MBA分子的ISERS分別為1.275 2×105和4.165 15×105。利用拉曼光譜儀的技術(shù)參數(shù)(激光波長為785 nm,物鏡數(shù)值孔徑為0.65,光斑直徑為1.473 μm),以及樣品中10-3mol/L的4-MBA濃度和2.471μm的穿透深度[14],計算出有效激發(fā)體積為4.209μm3和NSERS=2.532×106。實驗中,4-MBA粉末的透射深度為2μm,密度為1.5 g·cm-3,摩爾質(zhì)量為154.19 g·mol-1[15],則可得到Nbulk= 2×1010。經(jīng)計算,金、銀納米粒子的增強因子分別為1.55×105和3.7×105。可見,銀納米粒子比金納米粒子具有更好的拉曼增強效果。

圖4 (a)4-MBA標記的金納米粒子(曲線1)和4-MBA標記的金納米免疫探針的SERS光譜(曲線2); (b)4-MBA標記的銀納米粒子(曲線1)、4-MBA標記的銀納米免疫探針(曲線2)和干燥4-MBA粉末的SERS光譜(曲線3)。Fig.4 (a)SERSspectra of4-MBA-labelled Au NPs(curve 1),4-MBA-labelled immune nano-Au probes(curve 2).(b)SERS spectra of 4-MBA-labelled Ag NPs (curve 1),4-MBA-labelled immune nano-Ag probes (curve 2),and dry 4-MBA powder(curve 3),respectively.

3.2 納米金基底或納米銀基底的特性

在硅片表面生長的納米金與納米銀島膜的SEM照片如圖5所示。由圖可見,所制備的納米金島膜呈單層結(jié)構(gòu),由許多小的類“磁疇”的顆粒組成,島與島之間的間隙不大,近乎連續(xù),其“磁疇”的平均直徑為(50±20)nm,孔洞率為10%;而所制備的納米銀島膜是多層結(jié)構(gòu),其“磁疇”的平均直徑為(80±20)nm,孔洞率為15%。正是因為納米金與納米銀島膜中的類“磁疇”結(jié)構(gòu),促進了納米金與納米銀島膜表面SERS熱點的產(chǎn)生。

圖5 納米金基底(a)和納米銀基底(b)的SEM照片F(xiàn)ig.5 SEM images of nano-Au(a)and nano-Ag substrate(b)

為了比較納米金基底與納米銀基底的SERS增強效果,我們將兩種基底浸入10-2mol/L的4-MBA乙醇溶液中1 h后,放置在室溫下使其干燥。然后,在兩種基底上分別選取25個點進行4-MBA的SERS光譜測量,結(jié)果如圖6所示。由圖6(a)和6(b)可得,與納米金基底與納米銀基底對應的4-MBA的SERS光譜在1 078 cm-1處的平均峰值強度分別為9 400±370(RSD 4.2%)和21 598±1 490(RSD 2.5%)。顯然,納米銀基底比納米金基底有更強的拉曼增強效果。

與前述類似,同樣可以計算納米金和納米銀基底的增強因子。此時,Ibulk=6.1×103,Nbulk= 2×1010,激光輻照光斑面積A=1.704μm2,納米金基底的ISERS=2.04×105,納米銀基底的ISERS= 3.94×105。再根據(jù)文獻[16],假設(shè)基底的粗糙因子R=1,1 mol的4-MBA分子所占的面積δ=2× 109cm2·mol-1,則由公式NSERS=RA/δ計算得到吸附分子數(shù)為5.1×106。最后,計算得到納米金和納米銀基底的拉曼增強因子分別為1.3×105和2.5×105。顯然,納米銀基底的拉曼增強效果優(yōu)于納米金基底。

圖6 納米銀基底(a)和納米金基底(b)表面的4-MBA分子的SERS光譜Fig.6 SERS spectra of4-MBA molecules absorbed on nano-Au substrate(a)and nano-Ag substrate(b)

圖7 4種免疫三明治結(jié)構(gòu)下,對應兩種PSA濃度的4-MBA的SERS光譜。(a)金納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底; (b)金納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底;(c)銀納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底;(d)銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底。Fig.7 SERS spectra of 4-MBA corresponding to two concentrations of PSA.(a)Nano-Au immune probes-PSA-nano-Au immune substrate.(b)Nano-Au immune probes-PSA-nano-Ag immune substrate.(c)Nano-Ag immune probes-PSA-nano-Au immune substrate.(d)Nano-Ag immune probes-PSA-nano-Ag immune substrate.

3.3 前列腺特異性抗原的免疫檢測

將所制備的金、銀免疫探針與納米金免疫基底、納米銀免疫基底、PSA分別組合成4種免疫三明治結(jié)構(gòu)進行拉曼光譜測量。為了比較4種三明治結(jié)構(gòu)的免疫檢測性能,首先檢測兩種濃度PSA的SERS信號,結(jié)果如圖7所示。在相同的檢測條件下,銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的三明治結(jié)構(gòu)的檢測效果最佳,而金納米免疫探針-PSA-納米金免疫基底組成的三明治結(jié)構(gòu)的檢測效果較差,其他兩種免疫三明治結(jié)構(gòu)的檢測效果介于這兩者之間。因此,銀納米免疫探針-PSA-銀納米免疫活性基底形成的免疫三明治結(jié)構(gòu)具有更高的檢測靈敏度。

實際上,銀比金有更高的活性,納米銀粒子更容易團聚,將產(chǎn)生較多的熱點,從而導致更強電磁場增強。所以,納米銀探針的SERS信號明顯高于納米金探針的SERS信號。另一方面,根據(jù)電荷轉(zhuǎn)移模型,由于金比銀有更大的功函數(shù)(W金=5.1 eV,W銀=4.26 eV),在適當波長激發(fā)光的照射下,銀納米粒子表面的電子易于從其費米能級共振躍遷到吸附的4MBA分子最低未占據(jù)分子能級上,分子的有效極化率變化較大,因此銀納米粒子的拉曼散射增強較大[17]。此外,根據(jù)文獻[18-19],金納米粒子的SERS增強因子先隨粒徑的增大而提高,在60 nm左右時達到極大后又隨著粒徑的增大而降低,而銀納米粒子在80～100 nm之間時SERS強度最大,這與制備探針所用的金納米粒子(平均粒徑(20±5)nm)和銀納米粒子(平均粒徑(80±15)nm)的測量結(jié)果一致。同樣地,就基底而言,納米銀基底的多層島膜結(jié)構(gòu)也比納米金基底的單層島膜結(jié)構(gòu)能形成更多的熱點,從而使納米銀基底可以獲得更強的拉曼信號。這些不僅與對金、銀納米免疫探針、納米金免疫基底和納米銀免疫基底的表征結(jié)果相一致,也很好地解釋了銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的免疫三明治結(jié)構(gòu)具有高檢測靈敏度的原因。

下面研究銀納米免疫探針-PSA-納米銀免疫基底組成的免疫三明治結(jié)構(gòu)的檢測靈敏度以及對目標抗原檢測的特異性。首先,配制18 000, 1 800,180,18,1.8 fg/mL的5種抗原濃度的PSA樣本,并檢測對應樣本的拉曼光譜,如圖8(a)所示。再對圖8(a)中各樣本在1 078 cm-1處的峰值強度進行擬合,得到強度與濃度的關(guān)系如圖8(b)所示?？梢钥闯?SERS光譜的峰值強度與抗原濃度成正比關(guān)系,隨著抗原濃度的降低而減小?？紤]到檢測誤差和背景的影響,PSA的最低檢測濃度為1.8 fg/mL。在特異性檢測實驗中,甲胎蛋白(AFP)被用來進行對比實驗,測試結(jié)果如圖9所示。由圖可見,與AFP樣本對應的拉曼光譜與無PSA抗原(0 fg/mL)情況下測量的背景光譜幾乎相同,而且在1 078 cm-1的峰值強度遠遠弱于相同濃度下PSA樣本對應的測量結(jié)果。因此,銀納米粒子免疫探針-PSA-納米銀免疫基底構(gòu)成的三明治結(jié)構(gòu)對于PSA具有顯著的檢測特異性。

圖8 (a)對應不同PSA濃度的樣品檢測的4-MBA的SERS光譜;(b)1 078 cm-1處的峰值強度與PSA濃度的擬合曲線。Fig.8 (a)SERS spectra of 4-MBA corresponding to the different concentrations of PSA.(b)Dose-response curve of the peak intensity at1 078 cm-1 changed with the concentration of PSA.

圖9 相同抗原濃度下,與PSA和AFP對應的4-MBA的SERS光譜。Fig.9 SERS spectra of4-MBA for PSA and AFP at the same concentrations

4 結(jié) 論

通過制備金、銀納米粒子免疫探針和納米金與納米銀免疫基底,研究了由它們與PSA組成的4種免疫三明治結(jié)構(gòu)的免疫檢測特性。結(jié)果表明,以銀納米粒子免疫探針、PSA和納米銀免疫基底組成的免疫三明治結(jié)構(gòu)對PSA具有很高的檢測靈敏度,檢測濃度低至1.8 fg/mL。在相同的測量條件下,對比實驗也表明其對PSA的檢測具有很強的生物特異性。因此,構(gòu)建的銀納米粒子免疫探針-抗原-納米銀免疫基底的免疫三明治結(jié)構(gòu)對于腫瘤標志物的檢測具有很強的實用性。

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封昭(1990-),男,陜西咸陽人,碩士研究生,2013年于寶雞文理學院獲得學士學位,主要從事表面增強拉曼散射及其應用的研究。

E-mail：fengzhaozj@163.com

周駿(1958-),男,安徽當涂人,博士,教授,1996年于上海交通大學獲得博士學位,主要從事納米功能材料、光電子技術(shù)和生物光子學等方面的研究。

E-mail：yzhoujun@nbu.edu.cn

Hypersensitization Immunoassay of Prostate-specific Antigen Based on SERS of Sandw ich-type Au/Ag Nanostructure

FENG Zhao1,ZHOU Jun1*,CHEN Dong1,WANG Shao-min2,WANG Xiao-jun2,XIE Shu-sen3

(1.Department ofMicroelectronic Science and Engineering,Faculty of Science,Ningbo University,Ningbo 315211,China; 2.Affiliated Hospital ofSchool ofMedicine,Ningbo University,Ningbo 315020,China; 3.Key Laboratory ofOptoElectronic Science and Technology forMedicine ofMinistry of Education, Fujian Provincial Key Laboratory for Photonics Technology,Fujian Normal University,Fuzhou 350007,China) *Corresponding Author,E-mail：zhoujun@nbu.cn

Based on surface enhanced Raman scattering(SERS),a super-sensitive immunoassay of prostate specific antigen(PSA)was developed with the sandwich-type structure consisted of the nano-Ag immune probes and nano-Ag immune substrate.Experimentally,the chemical reductionmethod was used to prepare Au and Ag nanoparticles,the nano-Au/Ag immune probeswere prepared by immobilising Raman reportermolecule4-mercaptobenzoic acid(4-MBA)and anti-prostate specific antigen antibody(Anti-PSA)onto the surfaces of Au/Ag nanoparticles.The nano-Ag/Au immune substrateswere prepared by in-situ growing of Ag/Au nanoparticles on a silicon wafer and linkingwith Anti-PSA.The immunoassays of PSA were explored by the four kinds of sandwich-type structures consisted of the nano-Au/Ag immune probes and nano-Au/Ag immune substrates,respectively.It is found that the sandwich-type structure consisted of nano-Ag immune probe and nano-Ag immune substrate is the bestone to the immunoassay of PSA,and the detection limitof PSA is as low as1.8 fg/mL(3.490×10-18mol/L),which is suitable to be applied in early detection and diagnosis of prostate cancer.

surface-enhanced Raman scattering;nano-immune probe;nano-immune substrate;immunoassay

O433.1

A

10.3788/fgxb20153609.1064

1000-7032(2015)09-1064-07

2015-05-11;

2015-08-09

國家自然科學基金(61275153,61335011,61320106014);浙江省自然科學基金(LY12A04002);寧波大學王寬誠幸福基金資助項目