前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9抑制劑的研究進(jìn)展

曾雨薇 綜述 羅素新 劉洪沛 審校

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400016)

近年來，冠心病成為導(dǎo)致中國乃至全球患者死亡的首要原因。膽固醇升高是冠心病的獨(dú)立危險因素，亦稱直接病因，其中最為重要的是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。新近的薈萃分析［1］發(fā)現(xiàn)，LDL-C每降低1 mmol/L，冠心病風(fēng)險可減少21%。因此，降低膽固醇被視為防治缺血性心腦血管疾病的核心策略。他汀類藥物是目前降膽固醇治療領(lǐng)域的一線藥物，其不僅有效降低血漿LDL-C水平，還能減少心腦血管疾病的發(fā)病率和病死率。盡管他汀類藥物臨床應(yīng)用廣泛，優(yōu)勢突出，但存在一定的局限性:(1)一些家族性高膽固醇血癥患者，LDL-C基線水平較高，在接受強(qiáng)化他汀類藥物治療后膽固醇水平仍不能達(dá)標(biāo);(2)他汀類藥物雖然一般耐受性良好，但仍有少部分患者由于各種不良反應(yīng)，不能耐受大劑量或根本不能耐受他汀類藥物治療;(3)盡管他汀類藥物能有效預(yù)防心血管疾病，但PROVE-IT研究顯示，部分心血管疾病高?；颊咴诮邮軓?qiáng)化他汀類藥物(阿托伐他汀80 mg)治療后仍有較大的心血管事件殘余風(fēng)險，在為期2年的研究中，風(fēng)險發(fā)生率達(dá)22.4%［2］，該類患者仍有額外的降脂治療需求。目前臨床實(shí)際應(yīng)用中，可聯(lián)用膽固醇吸收抑制劑依折麥布和煙酸類藥物進(jìn)一步降低LDL-C，但此類藥物降脂效果有限，且現(xiàn)有臨床研究尚未發(fā)現(xiàn)其可顯著減少患者主要心血管終點(diǎn)事件發(fā)生率，也只能作為降低LDL-C的二線藥物。因此，進(jìn)一步研發(fā)針對脂代謝的不同作用靶點(diǎn)，更為安全、有效的新型降脂藥物成為目前血脂領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9，PCSK9)的發(fā)現(xiàn)為這些患者提供了新的治療前景?，F(xiàn)對PCSK9抑制劑的研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 PCSK9與高膽固醇血癥的關(guān)系

PCSK9是一種主要由肝臟合成的分泌型絲氨酸蛋白酶，屬于前蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，其基因位于常染色體1p34-32，編碼神經(jīng)凋亡調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化酶1，參與神經(jīng)細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)過程，更重要的是，其與膽固醇代謝直接相關(guān)。PCSK9基因功能缺失型突變可致LDL-C明顯減少，冠心病的發(fā)病率顯著降低，而PCSK9基因功能獲得型突變則致LDL-C水平大幅度升高，并與一種嚴(yán)重的純合子家族性高膽固醇血癥有關(guān)。PCSK9基因突變也是除低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)和載脂蛋白B基因突變之外，第三個與常染色體顯性家族性高膽固醇血癥有關(guān)的基因突變［3］。

LDL-C主要通過肝細(xì)胞表面的LDL-R清除。PCSK9則通過細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外途徑調(diào)控肝臟的LDL-R水平，進(jìn)而影響LDL-C的代謝。PCSK9釋放入血后與肝細(xì)胞表面的LDL-R特異性結(jié)合，引導(dǎo)后者進(jìn)入肝細(xì)胞，到達(dá)溶酶體，在溶酶體中LDL-R發(fā)生降解，肝細(xì)胞表面LDL-R減少，肝細(xì)胞對LDL-C的清除能力下降，導(dǎo)致LDL-C水平升高，這是細(xì)胞外途徑。PCSK9在分泌入血前也能調(diào)節(jié)局部肝臟組織中LDL-R的表達(dá)，然而細(xì)胞內(nèi)途徑具體機(jī)制尚不明確。抑制PCSK9能阻斷PCSK9介導(dǎo)的LDL-R降解，上調(diào)肝細(xì)胞表面的LDL-R水平，從而達(dá)到降低LDL-C的目的，是治療高膽固醇血癥的合理靶點(diǎn)。有趣的是，他汀類藥物的研究［4］發(fā)現(xiàn)他汀類藥物在抑制膽固醇合成的同時，可升高血漿PCSK9水平，且存在劑量依賴關(guān)系，并與他汀類藥物治療時間成正比，提示PCSK9抑制劑與他汀類藥物聯(lián)用或許能明顯提高其降脂效果。

2 PCSK9抑制途徑及相關(guān)藥物

2007年，第一個PCSK9抑制劑誕生，繼后，多種不同途徑的PCSK9抑制劑應(yīng)運(yùn)而生，主要包括:(1)抑制PCSK9的合成:反義寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)、小分子干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA);(2)抑制PCSK9與LDL-R結(jié)合:單克隆抗體、小分子多肽。目前已進(jìn)入臨床研究階段的PCSK9抑制劑見表1。

表1 臨床研究階段的PCSK9抑制劑一覽

2.1 抑制PCSK9的合成

2.1.1 ASOs類抑制劑

ASOs通常由8～50個核苷酸組成，其短小序列核苷酸與mRNA結(jié)合，抑制蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄［5］，達(dá)到沉默靶基因的目的。ASOs通過與PCSK9 mRNA結(jié)合抑制PCSK9的轉(zhuǎn)錄，從而抑制PCSK9的合成。肝臟是易于攝取外源性ASOs類藥物的器官，也是PCSK9的主要合成場所，這為ASOs類PCSK9抑制劑聚集于此并充分發(fā)揮作用提供了有利的條件，使肝細(xì)胞中PCSK9 mRNA水平明顯降低，肝細(xì)胞表面的LDL-R表達(dá)顯著增加，LDL-C減少。2007年，Graham等報道了第二代ASOs類PCSK9抑制劑靶向作用于小鼠PCSK9有良好的降脂效果，高脂喂養(yǎng)的小鼠通過皮下注射PCSK9 ASOs治療6周后，PCSK9 mRNA減少了92%，肝細(xì)胞表面LDL-R水平升高了2倍，總膽固醇和LDL-C分別減少了53%和38%，但HDL-C也減少了54%。動物研究證實(shí)運(yùn)用ASOs抑制PCSK9 mRNA可明顯降低LDL-C水平，然而隨后兩項(xiàng)關(guān)于 ASOs類藥物 SPC-5001和BMS-844421的Ⅰ期研究［6-7］并未得出陽性結(jié)果，已在2011年提前終止，原因尚不明確。

鎖核酸(locked nucleic acid，LNA)技術(shù)也被運(yùn)用到了PCSK9 ASOs中。LNA作為一種寡核苷酸衍生物，有穩(wěn)定的空間構(gòu)象，對RNA有良好的識別能力和親和力，與天然核酸構(gòu)成的ASOs相比，LNA構(gòu)成的新型ASOs結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，識別能力和親和力更強(qiáng)。研究證實(shí)了以人和動物PCSK9為靶標(biāo)的LNA的有效性，人肝細(xì)胞轉(zhuǎn)染LNA ASOs后，PCSK9水平明顯減少，肝細(xì)胞表面LDL-R增多。小鼠尾單次靜脈注射LNA ASOs后，肝細(xì)胞中PCSK9 mRNA減少了60%，藥效持續(xù)16 d，肝臟表面LDL-R水平上調(diào)2.5～3倍持續(xù)8 d以上［5］。在非人靈長類動物試驗(yàn)中，使用PCSK9特異性的LNA ASOs藥物SPC-5001后，PCSK9水平減少了85%，LDL-C減少了50%，總膽固醇減少水平與 LDL-C相一致［8］。以 PCSK9為靶標(biāo)的 LNA ASOs為高膽固醇患者提供了一種有效的治療策略，未來可能成為他汀類藥物治療的補(bǔ)充，其藥物SPC-5001的Ⅰ期臨床研究正在進(jìn)行中。

2.1.2 siRNA類抑制劑

抑制PCSK9合成的另一種方法是siRNA，它從機(jī)制上有別于ASOs。PCSK9 siRNA與PCSK9 mRNA靶向的RNA干擾沉默復(fù)合體結(jié)合，抑制PCSK9 mRNA的轉(zhuǎn)錄，同時啟動了靶mRNA序列特異性的降解機(jī)制，有序、高效、特異地降解PCSK9 mRNA，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默［9］。PCSK9 siRNA被研制成可靜脈注射的脂質(zhì)化微顆粒，以減少毒副作用及對其他siRNA的干擾。在小鼠和大鼠試驗(yàn)中，單次靜脈注射脂質(zhì)體siRNA，可使其PCSK9 mRNA最大沉默50%～60%，減少PCSK9水平，降低LDL-C達(dá)30%。在非人靈長動物中單劑量給藥可快速起效，48 h后LDL-C降低了50% ～60%，藥效持續(xù)3周，對HDL-C、三酰甘油無影響。ALN-PCS是Alnylam公司研發(fā)的脂質(zhì)體siRNA類PCSK9抑制劑，其Ⅰ期研究［10］納入了32例 LDL-C＞3.0 mmol/L的健康志愿者，接受不同單劑量靜脈給藥，研究結(jié)果顯示，該藥起效快、作用持久，不同劑量組間存在明顯的量效關(guān)系，觀察到最大劑量效應(yīng)最強(qiáng)，PCSK9減少達(dá)70%，LDL-C降低達(dá)40%，HDL-C、脂蛋白a無明顯改變。ALN-PCS安全性、耐受性好，無藥物相關(guān)的嚴(yán)重不良反應(yīng)報道。該藥的Ⅰ期研究臨床有效終點(diǎn)取得了陽性結(jié)果。由于Ⅰ期研究樣本量小，未來還需大型研究來進(jìn)一步驗(yàn)證其治療高膽固醇血癥的有效性和安全性。

2.2 抑制PCSK9與LDL-R結(jié)合

2.2.1 小分子多肽類抑制劑

PCSK9作用于細(xì)胞表面的LDL-R，是基于它們之間直接的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用，運(yùn)用抗體對抗PCSK9可破壞其相互作用，從而抑制PCSK9介導(dǎo)的肝細(xì)胞表面的LDL-R降解。2008年，Mayer等研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白AnxA2與PCSK9的CHRD片段特異性結(jié)合，抑制該區(qū)域與LDL-R的相互作用，其小分子模擬肽為抑制PCSK9提供了新的思路。LDL-R的EGFA段模擬多肽類藥物1D05-IgG2為單克隆抗體類模擬肽，對PCSK9的催化區(qū)具有高度親和力，與LDL-R競爭性結(jié)合PCSK9，抑制PCSK9對LDL-R的降解能力，增加肝細(xì)胞表面LDL-R的水平。動物試驗(yàn)［11］中，獼猴單劑量注射1D05-IgG2后，LDL-C減少達(dá)50%。然而PCSK9與小分子接觸面積有限，產(chǎn)生的疏水作用不強(qiáng)，結(jié)合后容易脫落，且小分子模擬肽設(shè)計難度較大，這都為該類藥物的開發(fā)設(shè)置了難度。2014上半年，CVI公司研發(fā)的小分子PCSK9抑制劑CVI-LM001已申報臨床。

2.2.2 單克隆抗體類抑制劑

在目前眾多的PCSK9抑制劑中，單克隆抗體類藥物發(fā)展最為迅速。2009年，Duff等研究發(fā)現(xiàn)PCSK9特異性抗體通過識別PCSK9與LDL-R結(jié)合的前片段-催化域，阻斷PCSK9與LDL-R之間的相互作用，減少PCSK9介導(dǎo)的LDL-R降解，提高LDL-C的清除率。同年，Chan等為非人靈長類動物單次靜脈注射人源PCSK9單克隆抗體mAb1，發(fā)現(xiàn)其可有效降低 LDL-C水平，證明了單克隆抗體降低 LDL-C的有效性。PCSK9作為一種蛋白質(zhì)大分子，較易通過雜交瘤技術(shù)獲得單克隆抗體。隨著近幾年的快速發(fā)展，許多PCSK9單克隆抗體類藥物已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段(見表1)，其中熱門研究藥物為Amgen公司的evolocumab(AMG-145)和 Regeneron/Sanofi公司的 alirocumab(REGN-727/SAR-236553)，已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。

Evolocumab和alirocumab先后進(jìn)入臨床試驗(yàn)，Ⅰ期研究［12-13］中兩種藥物均能迅速、有效地降低LDL-C水平，且耐受性良好，無嚴(yán)重的藥物不良反應(yīng)，治療相關(guān)不良反應(yīng)發(fā)生率與安慰劑組相似。

Evolocumab和 alirocumab的Ⅱ期研究［14-20］顯示，兩種藥物單獨(dú)或聯(lián)合他汀類藥物治療除了有效降低LDL-C水平外，還影響了其他致動脈粥樣硬化脂蛋白水平:明顯降低總膽固醇、非HDL-C、載脂蛋白B水平，且下降幅度與LDL-C相似;有效降低脂蛋白a水平，在 GAUSS研究［21］中單用evolocumab使脂蛋白 a水平降低了20%～26%，而在alirocumab的一項(xiàng)研究中，聯(lián)合阿托伐他汀80 mg治療可使脂蛋白a明顯下降達(dá)34.7%［18］;輕微升高HDL-C水平，三酰甘油輕微下降或無明顯變化。Ⅱ期試驗(yàn)的安全性數(shù)據(jù)十分鼓舞人心，兩種藥物的一般耐受性良好、不良反應(yīng)少。

Evolocumab和alirocumab的Ⅲ期研究正在進(jìn)行中，納入人數(shù)較Ⅱ期研究明顯增多，同時隨訪時間延長，其中10項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果于2014年先后公布，包括evolocumab 的 MENDEL-2、GAUSS-2、DESCARTES-2、LAPLACE-2、RUTHERFORD-2、TESLA 研究，以及 alirocumab的 ODYSSEY MONO、ODYSSEY COMBOⅡ、ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ、ODYSSEY Long-Term研究。MENDEL-2［22］、LAPLACE-2［23］、DESCARTES-2 研 究［24］和RUTHERFORD-2研究［25］驗(yàn)證了evolocuma單獨(dú)或聯(lián)合他汀類藥物(伴或不伴依折麥布)治療對于非家族性或家族性高膽固醇血癥患者安全有效。對于罕見的純合子家族性高膽固醇血癥患者，evolocumab也同樣安全有效，TESLA研究［26］發(fā)現(xiàn) evolocumab可使該類患者LDL-C水平從基線顯著降低31%。GAUSS-2研究［27］在evolocumab耐受性方面作了相關(guān)報道，他汀類藥物不耐受患者使用evolocumab后僅有23%出現(xiàn)肌肉相關(guān)不良反應(yīng)，且發(fā)生率與使用依折麥布組無明顯差異。Alirocumab的ODYSSEY系列研究結(jié)果涉及多個治療領(lǐng)域。首先公布的ODYSSEY MONO研究［21］通過比較證明了alirocumab降脂效果明顯優(yōu)于依折麥布。ODYSSEY COMBOⅡ研究［28］針對使用最大耐受劑量他汀類藥物治療血脂仍未達(dá)標(biāo)的心血管疾病高危患者，研究發(fā)現(xiàn)alirocumab對于這類患者降LDL-C效果明顯、藥效持久，52周時 alirocumab組LDL-C仍保持在較基線水平降低49.5%。ODYSSEY FHⅠ和Ⅱ研究［29］進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)即使對于雜合子家族性高膽固醇血癥患者，alirocumab仍能明顯降低LDL-C達(dá)49%，且52周時LDL-C降低程度依舊保持在與24周時接近的水平。ODYSSEY Long-Term研究［29］通過事后分析探討了alirocumab對于心血管事件高?；颊咧饕难苁录挠绊?，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療65周后，alirocumab組患者主要心血管事件絕對發(fā)生率為1.4%，安慰劑組為3.0%，相對風(fēng)險下降了54%。雖然為事后分析結(jié)果，但也為alirocumab在降低心血管事件風(fēng)險方面增添了新的證據(jù)。

現(xiàn)有的短期研究顯示單克隆抗體類藥物降低LDL-C的幅度超過50%，這一降幅相當(dāng)于大劑量的強(qiáng)效他汀類藥物治療，且安全性與耐受性良好，無嚴(yán)重不良反應(yīng)。至此，單克隆抗體已具備了作為優(yōu)秀降膽固醇藥物的基本條件。然而，在血脂異常干預(yù)以及心血管疾病的防治中，LDL-C的降低只能作為一個替代終點(diǎn)，不能單憑替代性終點(diǎn)評價藥物療效。已公布的研究周期較短、樣本量小，缺乏長期有效性和安全性的證據(jù)。為了進(jìn)一步評估PCSK9單克隆抗體對心血管事件的影響，evolocumab和alirocumab均開展了以心血管事件的發(fā)生率為主要終點(diǎn)的Ⅲ期隨機(jī)雙盲平行對照研究——FOURIER研究和ODYSSEY OUTCOMES研究。兩個研究分別納入了22500例和18000例心血管疾病患者，隨訪時間5～6年，主要終點(diǎn)包括冠心病死亡、非致死性心肌梗死、非致死性缺血性卒中、需住院的不穩(wěn)定型心絞痛、冠狀動脈血運(yùn)重建等［30］，研究預(yù)計2018年結(jié)束，屆時才能比較可靠地判定這類藥物對臨床主要心血管終點(diǎn)事件的影響。

3 展望

從發(fā)現(xiàn)PCSK9基因突變到研發(fā)PCSK9抑制劑類藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)不到10年的時間里，PCSK9抑制劑成績斐然，有望發(fā)展成為一種前景廣闊的藥物。目前正在研究的PCSK9抑制劑中，小分子類藥物CVILM001正在申報臨床，LNA類藥物SPC-5001和siRNA類藥物ALN-PCS處于Ⅰ期研究階段，單克隆抗體類PCSK9抑制劑發(fā)展最為迅速，已進(jìn)入Ⅲ期臨床試驗(yàn)。2014年8月，安進(jìn)公司率先向美國食品藥品監(jiān)督管理局提交了首個PCSK9抑制劑evolocumab的上市申請。雖然現(xiàn)有臨床研究已證實(shí)PCSK9抑制劑能顯著降低LDL-C水平，且安全性良好，但強(qiáng)效降低LDL-C水平是否能轉(zhuǎn)化為降低心血管事件風(fēng)險?持續(xù)極低水平的LDL-C是否會有其他不良反應(yīng)?長期使用PCSK9抑制劑是否安全?PCSK9抑制劑是否能和他汀類藥物一樣，成為降脂治療的一線藥物甚至超越他汀類藥物?這些問題亟待目前的研究結(jié)果以及今后進(jìn)一步大量的臨床研究驗(yàn)證。

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