硫利達嗪增強伊馬替尼對慢性粒細胞白血病細胞K562的抑制作用及機制

牛　伶，夏雷鳴，劉　柳，李　坦，李　斌，鮑揚漪，劉　欣

硫利達嗪增強伊馬替尼對慢性粒細胞白血病細胞K562的抑制作用及機制

牛伶1，夏雷鳴1，劉柳1，李坦1，李斌1，鮑揚漪1，劉欣2

摘要目的觀察硫利達嗪（THZ）、伊馬替尼（IM）單藥及聯(lián)合對人慢性粒細胞白血病（CML）細胞K562的誘導(dǎo)作用，并探討其機制。方法采用四甲基偶氮唑藍（MTT）法測定THZ、IM單藥及聯(lián)合對細胞的抑制作用，計算兩藥協(xié)同指數(shù)（CI）。檢測THZ、IM單藥及聯(lián)合對細胞凋亡的影響。Western blot法檢測凋亡蛋白Cleaved-Bid、Procaspase 3，凋亡調(diào)節(jié)蛋白Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT表達的變化。結(jié)果THZ 16 μmol／L作用24 h后K562細胞增殖明顯抑制，低劑量細胞毒性作用不明顯。IM低劑量即有較強的細胞毒性作用，兩藥聯(lián)合后經(jīng)計算有較好的協(xié)同作用。根據(jù)CI值選定藥物濃度作用K562細胞24 h，流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，THZ單藥組無明顯細胞凋亡，IM單藥組、IM聯(lián)合THZ組均存在不同程度的細胞凋亡，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。Western blot法結(jié)果顯示各實驗組細胞胞內(nèi)Cleaved-Bid表達量增加，Procaspase 3表達量下降?？沟蛲龅鞍譈cl-2、pPI3K、pAKT下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達明顯上調(diào)，各實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。結(jié)論低劑量THZ聯(lián)合IM對CML細胞K562具有顯著的增殖抑制作用，其作用較IM單用作用強，THZ有明確增敏IM的作用。與IM、THZ單藥組比較，IM聯(lián)合THZ組Cleaved Bid表達量上調(diào)、Procaspase 3表達量下降，其殺傷機制可能與線粒體通路及抑制PI3K-AKT通路均有關(guān)。

關(guān)鍵詞慢性粒細胞白血病；硫利達嗪；伊馬替尼；細胞凋亡；凋亡蛋白；凋亡調(diào)節(jié)蛋白

2015-07-01接收

液腫瘤科，合肥230061

2安徽省立醫(yī)院血液內(nèi)科，合肥230001

鮑揚漪，女，教授，碩士生導(dǎo)師，責任作者，E-mail：761760565＠qq．com

慢性粒細胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）是一種常見惡性血液系統(tǒng)腫瘤。伊馬替尼（imatinib，IM）作為CML治療的一線方案，其療效已得到廣泛認可［1］，分子緩解率（molecular remission，MR）達到90%以上［2］，持續(xù)治療可使大多數(shù)患者長期維持在慢性期，生存期大大延長。80%以上的患者可以存活8年，年死亡率低于2%［3］。但隨著IM治療經(jīng)驗的積累，其局限性也被廣泛報道。首先，IM不能清除患者體內(nèi)的白血病干細胞（leukimia stem cells，LSCs），目前認為LSCs是CML復(fù)發(fā)的根源［4］。其次，未獲得完全分子學(xué)緩解（complete molecular remission，CMR）的患者在停藥后出現(xiàn)復(fù)發(fā)的比例可能超過60%，甚至達到100%［5］。目前大量IM耐藥病例被報道，但是具體機制目前尚不明確［6］。尋找與IM有協(xié)同作用的藥物，發(fā)揮更好的治療效果成為新方向。多巴胺受體抑制劑硫利達嗪（thioridazine，THZ）被廣泛用于治療精神類疾病和抗耐藥結(jié)核菌感染。近來THZ抗多種惡性腫瘤方面的作用被大量報道［7-8］。該研究旨在觀察THZ、IM對CML-K562細胞的效應(yīng)，并對兩藥協(xié)同在凋亡中的作用進行初步探討。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1主要儀器FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）；680全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司）；8000DH型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；CKX41型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1．1．2實驗藥物與細胞株THZ（美國Gibco公司），IM（英國Kinasechem公司），K562細胞株由安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院血液腫瘤科實驗室傳代保存。

1．1．3主要試劑1640培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、二甲基亞砜（DMSO）、胎牛血清（美國Gibco公司）；流式抗體Annexin V-FICT／PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒；四甲基偶氮唑藍（MTT）檢測試劑盒（美國Sigma公司）；小鼠抗人Cleaved-Bid、Procaspase 3、Bcl-2、Bax、pPI3K、pAKT單克隆抗體（美國Abcam公司）。

1．2方法

1．2．1K562細胞培養(yǎng)細胞株培養(yǎng)于10%滅活胎牛血清的1640培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、5% CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱中。實驗前細胞培養(yǎng)2周。

1．2．2THZ、IM單藥和聯(lián)合 K562細胞株細胞光鏡、細胞活性率、細胞凋亡細胞光鏡：取對數(shù)生長期CML細胞，1 000 r／min離心5 min，重復(fù)2次，調(diào)整細胞數(shù)量為4×104個／m l，100μl／孔種至96孔板，對照組和THZ單藥組、IM單藥組、IM聯(lián)合 THZ組均設(shè)3個復(fù)孔，37℃孵育過夜。實驗組設(shè)計如下：THZ取0、2、4、8、16μmol／L加入THZ單藥組、IM取0、0．1、1、10、100μmol／L加入IM單藥組，16 μmol／L THZ聯(lián)合0、0．1、1、10、100μmol／L IM作為聯(lián)合用藥組，對照組加入培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0、24、48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)學(xué)變化。

細胞抑制率：每孔加入10μl MTT（5 g／L），避光孵育4 h，吸棄上清液，每孔加入100μl DMSO，室溫振蕩10 min，以酶標儀在490 nm雙波長檢測相應(yīng)的吸光度（absorbance，A），細胞抑制率（%）＝死細胞總數(shù)／（活細胞總數(shù)＋死細胞總數(shù)）×100%。實驗重復(fù)3次。

細胞凋亡：取對數(shù)生長期K562細胞，調(diào)整細胞數(shù)量至3×104個／m l，每孔2ml種于6孔板，實驗組3孔，對照組1孔。THZ、IM分別以2μmol／L、1 μmol／L及聯(lián)合加入實驗組孔，對照組換液不加藥，收集細胞（包括上清液中細胞），預(yù)冷的PBS洗滌2次，調(diào)整細胞密度為1×106／ml，取60μl懸液加入流式管中，以10μl Annexin V-FITC和5μl PI標記，震蕩混勻后室溫避光孵育15 min，PBS洗滌2遍后加入400μl流式鞘液，以流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡程度。Annexin V-FITC和PI標記的細胞即為凋亡細胞。細胞凋亡率（%）＝凋亡細胞數(shù)／總細胞數(shù)× 100%。實驗重復(fù)3次。

1．2．3THZ、IM聯(lián)合PI3K-AKT-mTOR信號通路蛋白Western blot分析取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)目3×104個／m l培養(yǎng)于6孔板中，每孔2 m l，實驗組3孔，對照組1孔。37℃孵育過夜，THZ、IM分別以2μmol／L、1μmol／L及聯(lián)合加入實驗組孔，培養(yǎng)24 h，PBS洗滌2遍，收集細胞。蛋白裂解液冰上裂解30 min，4℃、12 000 r／min離心30 min提取總蛋白。BCA法蛋白定量后加入5×Loading Buffer，100℃變性15 min，12%SDS-PAGE凝膠電泳，按照30 μg／孔上樣，12%SDS-PAGE凝膠電泳，恒壓80 V電泳至分離膠，恒壓120 V至電泳結(jié)束，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜上（220 mA、120 min），TBST配制5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入小鼠抗Bcl-2（1∶1 000）、小鼠抗Bax（1∶1 000）、小鼠抗pPI3K（1∶1 000）、小鼠抗pAKT（1∶1 000）一抗室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min，辣根過氧化酶標記山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，TBST沖洗3次，每次10 min，ECL顯影，暗室曝光成像。

1．3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件進行分析，計數(shù)資料以±s表示，所有數(shù)據(jù)均重復(fù)3次取中位數(shù)為實驗數(shù)據(jù)，采用CompuSyn軟件計算藥物協(xié)同指數(shù)（combinationindex，CI），CI＜1為具有協(xié)同效應(yīng)。組間比較采用單因素方差分析及SNK-q檢驗。

2　結(jié)果

2.1IM、THZ單藥及聯(lián)合對K 562細胞凋亡的影響MTT實驗結(jié)果顯示：2、4、8μmol／L THZ對K562細胞影響小，藥物作用24 h后抑制率（%）分別為6±5、7±2、9±5，16μmol／L THZ處理K562細胞24 h的抑制率（%）約為65±2，處理48 h后抑制率（%）為97±1．5；0．1、1、10和100μmol／L IM對K562細胞抑制率均有明顯影響，0．1、1、10、100 μmol／L IM處理K562細胞24 h的抑制率（%）分別為50±12、70±11、74±14、85±11；16μmol／L THZ聯(lián)合不同濃度的IM對K562細胞均有明顯的抑制作用。THZ單藥16μmol／L作用24、48 h與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝170．008，F(xiàn)＝471．222；P＜0．01）。IM單藥各種濃度作用24、48 h與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝24．906，F(xiàn) ＝26．983；P＜0．01）。IM聯(lián)合 THZ中16μmol／L THZ＋1μmol／L IM、16μmol／L THZ＋10μmol／L IM兩組作用24、48 h與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝9．025，F(xiàn)＝5．429；P＜0．01）。見圖1。THZ、IM單加及聯(lián)合作用K562細胞24 h的殺傷效應(yīng)，經(jīng)CompuSyn軟件計算兩者的CI，結(jié)果顯示兩者具有良好的協(xié)同效應(yīng)。見表1、圖2。根據(jù)CI值，選定2 μmol／L THZ和1μmol／L IM進行單藥聯(lián)合實驗，藥物作用24 h。細胞光鏡（×200）下觀察，THZ、IM單藥及聯(lián)合作用24 h后，對照組細胞輪廓明確、清楚，生長旺盛，而隨著藥物濃度的增加，細胞明顯輪廓不清、體積縮小、邊緣透亮、間隙增加。見圖3。流式細胞儀結(jié)果顯示，2μmol／L THZ、1μmol／L IM及聯(lián)合作用24 h后K562的抑制率（%）分別為12．4± 5．7、71．75±4．9、87．31±6．4。IM聯(lián)合THZ組與IM單藥、THZ單藥組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F＝192．4，P＜0．01）。見圖4。

2.2IM聯(lián)合THZ作用K562細胞株凋亡相關(guān)蛋白表達變化凋亡蛋白Cleaved-Bid、Procaspase-3活性檢測結(jié)果顯示，藥物作用24h后，不同藥物組

K562的Cleaved-Bid、Procaspase-3表達水平較對照組出現(xiàn)差異，THZ組較對照組Cleaved-Bid表達升高、Procaspase 3表達下降，IM單藥、IM聯(lián)合THZ組變化更明顯。方差分析 F值，Cleaved-Bid：F＝16．515，Procaspase 3：F＝62．859。組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見圖5。凋亡調(diào)節(jié)蛋白在不同藥物組中藥物作用24 h后，Western blot檢測結(jié)果顯示，各實驗組線粒體通路抗凋亡蛋白Bcl-2下調(diào)、促凋亡蛋白Bax表達明顯上調(diào)，PI3K-AKT通路中，pPI3K、pAKT各實驗組與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．01）。見圖6。 ?

表1　THZ、IM單藥和聯(lián)合作用K 562細胞24 h的毒性效應(yīng)值及對應(yīng)CI

3　討論

Druker etal［1］指出在 IM一期試驗中，接受IM治療4周后54例患者中有53例獲得完全的血液學(xué)反應(yīng)（complete hematologic responses，CHR），IM治療超過一年的患者96%為CHR。Kantarjian et al［9］在二期試驗中，532例每天接受400 mg IM治療的患者在中位隨訪時間18個月內(nèi)，95%獲得CMR，89%疾病未進展。但臨床上耐藥以及嚴重不良反應(yīng)的發(fā)生越來越多［10］，且現(xiàn)主流觀點認為IM并不能清除骨髓中CML-LSCs，而其是導(dǎo)致疾病復(fù)發(fā)的根源［4］。尋找新的能夠作用于CML-LSCs的藥物成為CML治療的新方向。目前THZ的殺傷作用研究較多，該藥可作用于廣泛類別的腫瘤，特別是對腫瘤干細胞有殺傷作用，但不會影響正常干細胞［11］。THZ殺傷腫瘤細胞的機制尚未完全明確，多條與凋亡有關(guān)的通路可能與該機制有關(guān)［12］。線粒體凋亡途徑是凋亡的重要途徑，激活后線粒體膜通透性增高導(dǎo)致細胞凋亡。其中Bcl-2超家族蛋白關(guān)鍵因子，Bcl-2家族中的Mcl-1是抗凋亡蛋白，可維持線粒體膜的穩(wěn)定性，Bax是促凋亡蛋白，正常時Bax和 Bcl-2可形成異源二聚體共同維持線粒體膜穩(wěn)定性，出現(xiàn)病理變化時Bax-Bcl-2二聚體解離，Bax同源二聚體增多，形成膜孔道，改變線粒體膜電位，促凋亡因子被釋放到細胞質(zhì)中，導(dǎo)致細胞凋亡。PI3K-AKT通路誘導(dǎo)細胞的增殖、分化，避免細胞發(fā)生凋亡，此信號通路作為細胞生長增殖的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在維持細胞惡性生物學(xué)特性中起重要作用［13］。

本研究顯示，低劑量THZ對 K562細胞無明顯抑制作用，IM單藥細胞毒性作用較強，Compusyn軟件分析CI顯示低劑量THZ聯(lián)合低劑量IM有良好的協(xié)同作用。關(guān)于低劑量THZ和IM作用K562細胞凋亡作用，實驗中以Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白加以驗證：低劑量THZ作用于 K562細胞24 h后Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白表達無明顯變化，低劑量IM、低劑量IM聯(lián)合THZ作用K562細胞24 h后Cleaved-Bid、Procaspase 3表達量均有變化，但聯(lián)合后Cleaved-Bid、Procaspase 3蛋白表達量變化更明顯。本研究進一步分析了THZ、IM單藥及聯(lián)合作用于K562細胞的線粒體、PI3K-AKT凋亡通路調(diào)節(jié)蛋白的表達量以期分析其可能的作用機制。結(jié)果顯示低劑量IM單藥及低劑量IM聯(lián)合THZ在兩條通路中均起作用，兩條通路凋亡相關(guān)蛋白均上調(diào)，抑凋亡相關(guān)蛋白均下調(diào)。

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Inhibition and m echanism of im atinib for chronic m yeloid leukem ia enhanced by thioridazine

Niu Ling1，Xia Leiming1，Liu Liu2，et al
（1Dept of Hematology and Oncology，The Third Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei230061；2Dept of Hematology，Anhui Provincial Hospital，Hefei230001）

AbstractObjectiveTo study the effects of thioridazine（THZ）and imatinib（IM）on chronicmyeloid leukemia （CML）cells（K562 cells）．MethodsThe K562 cellswere treated by different concentrations of IM（0，0．1，1，10 and 100μmol／L）and THZ（0，2，4，8 and 16μmol／L）for24 and 48 h．The effects ofeach drug on the inhibition of cellswere examined by the MTT assay．Then K562 cellswere treated by different concentrations of IM（2，4，8 and 16μmol／L）and THZ（0．1，1 and 10μmol／L）for24 h alone or in combination．The inhibition of cellswas examined by the MTT assay．The combinational index（CI）was calculated by the CompuSyn software．Next K562 cellswere treated by IM of 1μmol／L and THZ of 2μmol／L for 24 h alone or in combination．Apoptosiswas detected by the Annexin V／PI staining and flow cytometry．Apoptosis related proteins，pPI3K and pAKT were detected by theWestern blotting．ResultsResults of the MTT assay indicated thatbeing treated by THZ of low concentrations alone had no significant influence on the inhibition of K562 cells，while being treated by THZ of 16 μmol／L showed significant effect on inducing death of K562 cells．IM alone had effect on inducing death of K562 cells of a low concentration．K562 cells being treated by IM combined with THZ had a good synergistical effect on inducing death．Then K562 cellswere treated with selected drug concentration according to CIvalues for 24 h，it revealed that thioridazine group had no significant apoptosis effect by flow cytometry，while in imatinib group，twodrug combination group there had different degree of apoptosis effect，and the control group was statistically significant（P＜0．01）．Meanwhile，results of the Western blot showed that the increased expression of Cleaved Bid in each experimental group cells，while decreased expression of Procaspase 3．Up-regulation of anti apoptosis protein （Bcl-2，pPI3K and pAKT）expression and downregulation of apoptosis protein Bax expression demonstrated that the difference was statistically significant（P＜0．01）comparing each experimental groups with the control group．ConclusionIM plus THZ can synergistically induce caspase-independent apoptosis of K562 cells．The killing mechanism may be associated with themitochondrial pathway and inhibition of the PI3K-AKT pathway．

Key wordschronic myeloid leukemia；Thioridazine；Imatinib；apoptosis；apoptosis related proteins；apoptosis regulating protein；PI3K-AKT pathway

中圖分類號R 737．9；R 971．41

文獻標志碼A

文章編號1000-1492（2015）11-1597-06

基金項目：安徽省自然科學(xué)基金（編號：1508085MH195）

作者單位：1安徽醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院（合肥市第一人民醫(yī)院）血

作者簡介：牛伶，女，副主任醫(yī)師；