紫杉醇生物合成研究歷史、現(xiàn)狀及展望

邱德有張彬楊艷芳邵芬娟滕文靜

（1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190）

紫杉醇生物合成研究歷史、現(xiàn)狀及展望

邱德有1張彬2楊艷芳1邵芬娟1滕文靜2

（1. 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100091；2.國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作北京中心，北京 100190）

紫杉醇是從紅豆杉中分離出來的一種二萜類化合物，是目前臨床上使用最廣泛的抗癌藥物之一。回顧了紫杉醇生物合成的研究歷史，主要包括參與紅豆杉紫杉醇生物合成的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因、紅豆杉代謝組、內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成研究歷史以及國(guó)際上紫杉醇生物合成專利情況等。介紹了近年來紅豆杉和內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成研究的現(xiàn)狀。最后探討了本領(lǐng)域未來的研究方向并對(duì)其前景進(jìn)行展望。

紫杉醇；生物合成； 現(xiàn)狀；前景

紫杉醇（Taxol）是紅豆杉屬植物中的一種二萜類化合物。紅豆杉（Taxus）又名紫杉，為紅豆杉科紅豆杉屬植物。全世界共有11個(gè)種，我國(guó)有4個(gè)種和1個(gè)變種，即東北紅豆杉（T. cuspidata Sieb. Et. Zucc）、云南紅豆杉（T. yunnanensis Cheng et L. K. Fu）、西藏紅豆杉（T. wallichiana Zucc）、中國(guó)紅豆杉（T. chinensis （Pilger）Rehd）和南方紅豆杉（T. chinensis （Pilger）Rehd. var. mairei （Lemee rt levl）Cheng et L. K. Fu）。早在1971年，Wani等［1］就從短葉紅豆杉（T. brevifolia）中分離出了這種二萜化合物紫杉醇，并發(fā)現(xiàn)它具有很強(qiáng)的抗腫瘤能力。紫杉醇作為最為有效的天然抗癌藥物之一，目前與其半合成類似物多烯紫杉醇一起已經(jīng)成為臨床上使用最廣泛的癌癥化療藥物。由于紫杉醇在紅豆杉中的含量很低（約占樹皮干重的0.01%-00.2%）加之紅豆杉屬植物生長(zhǎng)緩慢，資源量少，所以過去一段時(shí)間內(nèi)供求矛盾突出。這對(duì)紫杉醇的進(jìn)一步開發(fā)利用造成了很大的困難。為了解決這一問題，國(guó)內(nèi)外在高產(chǎn)紫杉醇紅豆杉的篩選、化學(xué)全合成及半合成、細(xì)胞培養(yǎng)、真菌發(fā)酵等研究方面進(jìn)行了探索，取得了一定的成績(jī)，但離徹底解決紫杉醇的高效供應(yīng)問題還有一段距離。

可以想象在未來的一段時(shí)間內(nèi)，紫杉醇及其半合成前體的供應(yīng)將繼續(xù)依賴于生物學(xué)方法，即通過紅豆杉植物或者紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)來獲得。更進(jìn)一步，也可通過基因操作提高紅豆杉細(xì)胞和微生物中紫杉醇生物合成相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)量來提高紫杉醇的產(chǎn)量。所以，紫杉醇生物合成的研究是解決紫杉醇問題的關(guān)鍵。

鑒于此，本文回顧了紫杉醇生物合成的研究歷史，主要綜述了參與紅豆杉紫杉醇生物合成的結(jié)構(gòu)基因、調(diào)控基因、紅豆杉代謝組、內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成的研究歷史以及國(guó)際上紫杉醇生物合成專利情況等，其次介紹近年來紅豆杉和內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成研究的現(xiàn)狀，最后對(duì)本領(lǐng)域未來的研究方向及其前景進(jìn)行展望，旨在為有關(guān)研發(fā)工作提供一定的參考和借鑒作用。

1 紫杉醇生物合成研究的歷史

1.1 參與紫杉醇生物合成的結(jié)構(gòu)基因

從紫杉醇合成前體牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl pyrophosphate，GGPP）到紫杉醇的合成約需20步酶促反應(yīng)，主要包括GGPP合成酶，紫杉二烯合成酶（taxadiene synthase，TS），羥基化酶、?；负妥兾幻傅?，它們分別是GGPP合成酶、紫杉二烯合成酶、紫杉烷 5α-羥基化酶、紫杉烷 10β-羥基化酶、紫杉烷 1α-羥基化酶、紫杉烷2β-羥基化酶、紫杉烷 7β-羥基化酶、紫杉烷 9α-羥基化酶、紫杉烷 13α-羥基化酶、紫杉烷 2α-O-苯甲酰基轉(zhuǎn)移酶、紫杉烷 10β-O-乙?；D(zhuǎn)移酶、紫杉醇側(cè)鏈N-苯甲?；D(zhuǎn)移酶、紫杉醇側(cè)鏈 C2-羥基化酶、紫杉烷 C-13-O-苯丙烷側(cè)鏈乙酰CoA酰基轉(zhuǎn)移酶、β-苯丙氨酸變位酶、乙酰CoA連接酶、β-苯丙氨酸水解酶、9α-羥基氧化酶、4，20 環(huán)氧化酶、環(huán)氧乙烷環(huán)氧四環(huán)變位酶。紫杉醇生物合成基因的分離及鑒定工作主要是由美國(guó)華盛頓大學(xué)Croteau教授領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行完成的，他們完成了這些酶編碼基因中的12個(gè)基因加上紫杉烷 14β-基化酶和紫杉烷 5α-O-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的編碼基因的克隆和鑒定（表1）。

早在1996年，Croteau實(shí)驗(yàn)室的Wildung［1］就分離到了紫杉二烯合成酶（taxadiene synthase）的基因。接著，Croteau實(shí)驗(yàn)室Hefner［2］克隆并鑒定了牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸合成酶（geranylgeranyl pyrophosphate synthase，GGPPS）的編碼基因。羥基化酶編碼基因的克隆和鑒定工作主要由Croteau實(shí)驗(yàn)室的Anne Schoendorf、Stefan Jennewen、Mydoanh Chau、Mark R. Wildung等人完成，而?；妇幋a基因的克隆和鑒定工作主要由該實(shí)驗(yàn)室的Kevin D. Walker、Daniela Hampel、Mark R. Wildung等人完成的，而β-苯丙氨酸變位酶編碼基因的克隆和鑒定工作則是由Kevin D. Walker等人完成。此外，Hampel等［15］從紅豆杉中分離出了兩個(gè)使紅豆杉細(xì)胞代謝物紫杉素（Taxusin）?；孽；D(zhuǎn)移酶基因（TAX9和TAX14），這些基因促使代謝流無法走向紫杉醇。該發(fā)現(xiàn)為今后利用基因抑制及敲除等技術(shù)手段促進(jìn)紫杉醇及其前體的生物合成提供了一個(gè)新的思路和理論基礎(chǔ)。值得一提的是盡管該實(shí)驗(yàn)室的Raymond Ketchum、Yousun Kim和Deyou Qiu（邱德有）等人雖然沒有直接參與有關(guān)基因的克隆，但他們所培養(yǎng)的紅豆杉細(xì)胞以及所做的有關(guān)代謝組學(xué)的分析等努力為上述一些的基因克隆工作提供不可或缺的細(xì)胞材料和研究思路，貢獻(xiàn)也不容忽視。2011年，K?ksal 等［16］對(duì)紫杉二烯合成酶的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，此項(xiàng)工作為今后通過蛋白質(zhì)工程技術(shù)改造紫杉二烯合成酶來進(jìn)一步提高其活性奠定了一個(gè)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

近年來，國(guó)內(nèi)外其它研究者也陸續(xù)地開展了紫杉醇生物合成基因的克隆及表達(dá)的工作。關(guān)于國(guó)內(nèi)外參與紫杉醇生物合成的結(jié)構(gòu)基因研究的具體概況以及紫杉醇生物合成部位的研究歷史，我們之前的綜述性文章作了詳細(xì)地介紹［17-19］，這里就不再重復(fù)。

1.2 參與紫杉醇生物合成的調(diào)節(jié)基因

1.2.1 參與紫杉醇生物合成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子 除了紅豆杉中參與紫杉醇生物合成的結(jié)構(gòu)基因之外，研究者還對(duì)參與紫杉醇生物合成調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子開展了一定的研究。轉(zhuǎn)錄因子在植物次生代謝途徑中起到重要的調(diào)控作用，能夠調(diào)控不少次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)量。參與植物次生代謝生物合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、AP2/EREBP、WRKY、bHLH、MADS-box和bZIP等這幾類家族。目前人們已經(jīng)報(bào)道了一些關(guān)于參與紫杉醇生物合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。例如，姚瑞楓等［20］利用酵母單雜交技術(shù)對(duì)與紫杉醇生物合成途徑中的dbat基因啟動(dòng)子的順式元件相結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了篩選工作，得到了6個(gè)結(jié)合蛋白的編碼基因。戴怡齡［21］從東北紅豆杉中分離、克隆到兩個(gè)AP2類轉(zhuǎn)錄因子，其中TcDREB能與紫杉醇合成途徑中的TS、T5H、T10H和T13H四個(gè)關(guān)鍵酶編碼基因的啟動(dòng)子相結(jié)合。Li等［22］從中國(guó)紅豆杉細(xì)胞中克隆了DBAT基因長(zhǎng)度為1 740 bp的5'端片段，他們利用該基因片段作為誘餌，通過酵母單雜交方法從中國(guó)紅豆杉懸浮細(xì)胞所建立的cDNA文庫(kù)中成功地獲得一個(gè)WRKY類轉(zhuǎn)錄因子TcWRKY，并發(fā)現(xiàn)TcWRKY的過量表達(dá)或者RNAi干擾抑制后都可以分別增強(qiáng)或者降低DBAT基因的表達(dá)水平。

1.2.2 參與紫杉醇生物合成調(diào)節(jié)的非編碼RNA mi-RNA（microRNA）是一種內(nèi)生的、長(zhǎng)度約為21-22 nt、不編碼蛋白質(zhì)的單鏈小分子RNA。研究發(fā)現(xiàn)miRNA通過轉(zhuǎn)錄切割或翻譯抑制的方式調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)生物體的細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、發(fā)育、代謝、凋亡、疾病發(fā)生等過程，在植物的生命活動(dòng)中起著非常重要的作用。Qiu等［23］對(duì)中國(guó)紅豆杉細(xì)胞小RNA高通量測(cè)序表明，中國(guó)紅豆杉有56個(gè)保守的miRNAs，它們分屬于23個(gè)miRNA 家族，另外兩個(gè)是非保守的miRNAs。我們發(fā)現(xiàn)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)后miR168和miR169表達(dá)水平下降，而miR164和miR390表達(dá)水平上調(diào)。此外，我們還對(duì)受MJ誘導(dǎo)的主要保守miRNAs的靶基因進(jìn)行了預(yù)測(cè)。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，所篩選出的小RNA不能作用于所有已克隆的15個(gè)紫杉醇生物合成相關(guān)基因，但發(fā)現(xiàn)中國(guó)紅豆杉miRNA的靶基因許多是一些轉(zhuǎn)錄因子，所以推測(cè)紅豆杉細(xì)胞中的miRNA分子很可能是通過作用于轉(zhuǎn)錄因子來影響紫杉醇生物合成的。Hao等［24］借助illumina測(cè)序技術(shù)，利用曼地亞紅豆杉葉子為材料對(duì)其小RNA和降解組進(jìn)行了測(cè)序分析，此研究獲得了871個(gè)成熟miRNA，869個(gè)已知植物miRNA家族的前體，并且他們還發(fā)現(xiàn)了T13H和T2H分別是miR164和miR171的可能的剪切靶標(biāo)。不過這些結(jié)果還需要用RACE等技術(shù)進(jìn)行有關(guān)miRNA對(duì)靶基因切割的驗(yàn)證，甚至進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的功能驗(yàn)證。

表1 已克隆的14個(gè)紫杉醇生物合成相關(guān)基因

1.3 紅豆杉代謝組

代謝組學(xué)（Metabolomics）作為一種新技術(shù)也已被應(yīng)用到包括紫杉醇在內(nèi)的紅豆杉紫杉烷類研究工作中。Ketchum等［25］發(fā)現(xiàn)紅豆杉細(xì)胞在添加茉莉酸甲酯后，其C-14氧取代的紫杉烷的總含量由5%減少到2%，而紫杉醇、巴可亭III和10-去乙酰基巴可亭III在內(nèi)的C-13氧取代的紫杉烷則大為增加，分別增加了4.72%、無窮大和4.12倍。因此，紫杉烷14 β-羥基化酶很可能是紫杉醇生物合成調(diào)控的一個(gè)十分重要的靶標(biāo)。Ketchum等［26］利用代謝組學(xué)方法結(jié)合同位素示蹤技術(shù)，還進(jìn)一步證實(shí)了紫杉烷14 β-羥基化酶和紫杉烷13α-羥基化酶所催化的反應(yīng)在紫杉醇生物合成中所起的關(guān)鍵調(diào)控作用。Tanaka等［27］利用LC-IT-TOF-MS質(zhì)譜技術(shù)對(duì)1-5年生的南方紅豆杉小苗中的紫杉烷類化合物進(jìn)行了鑒定和分離。國(guó)內(nèi)研究者也開展了相關(guān)研究工作。如Han等［28］對(duì)在層流剪切力作用下的東北紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行了代謝輪廓譜分析，成功地鑒定出了65個(gè)細(xì)胞內(nèi)的代謝物。Hao等［29］在采用illumina測(cè)序技術(shù)對(duì)南方紅豆杉植株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作的基礎(chǔ)上，利用基因數(shù)字表達(dá)譜技術(shù)（digital gene expression，DGE）進(jìn)一步分析了南方紅豆杉根、莖、葉中紫杉醇生物合成相關(guān)基因的表達(dá)水平，他們發(fā)現(xiàn)這些基因在根中的表達(dá)量要高于莖、葉中的表達(dá)量。接著，他們利用代謝組學(xué)技術(shù)中的超快液相色譜（ultra fast liquid chromatography，UFLC）和質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）技術(shù)對(duì)包括紫杉醇在內(nèi)的6種常見的紫杉類化合物在南方紅豆杉植株根、葉中的含量進(jìn)行了測(cè)定和比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些紫杉烷類在南方紅豆杉根中的含量要明顯高于它們?cè)谇o、葉中的含量，這一結(jié)果與紫杉醇生物合成相關(guān)基因在根中的表達(dá)量要高于莖、葉中的表達(dá)量的結(jié)果相吻合。

1.4 內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成

1993年，美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)Strobel實(shí)驗(yàn)室的Stierle等［30］從短葉紅豆杉的韌皮部分離到1株產(chǎn)紫杉醇的內(nèi)生真菌（Taxomyces andreanae），發(fā)現(xiàn)該菌的發(fā)酵液含紫杉醇24-50 ng/L。隨后，該實(shí)驗(yàn)室又從西藏紅豆杉枝條上分離到1株小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora），紫杉醇的產(chǎn)量比Taxomyces andreanae高很多，發(fā)酵液的紫杉醇含量高達(dá)60-70 μg/L［31］。盡管Strobel實(shí)驗(yàn)室用同位素示蹤的方法證明有關(guān)真菌能夠合成紫杉醇并對(duì)真菌中的質(zhì)粒進(jìn)行了研究，但他們并沒有在這些真菌中發(fā)現(xiàn)和克隆到任何紫杉醇生物合成基因。為此，黑龍江大學(xué)的趙凱等［32］進(jìn)行了一些嘗試，他們采用RT-PCR 技術(shù)從東北紅豆杉樹葉中獲得了紫杉二烯合成酶基因片段，并利用所獲得的紫杉二烯合成酶基因與紫杉醇產(chǎn)生菌HQD33基因組DNA 進(jìn)行了Southern雜交，初步結(jié)果證實(shí)了紫杉二烯合成酶的編碼基因可能存在于該內(nèi)生真菌中，但后續(xù)的工作卻未見有進(jìn)一步的報(bào)道。

1.5 國(guó)際上紫杉醇生物合成專利情況

國(guó)際上已有的紫杉醇生物合成的專利都是來自Croteau院士實(shí)驗(yàn)室。具體的發(fā)明專利情況，見表2。這些專利中，最早是在1999年授權(quán)，2019年就到期，而最晚的專利是2008年授權(quán)，要到2028年才過期，距現(xiàn)在還有13年的時(shí)間。

2 紫杉醇生物合成研究現(xiàn)狀

2.1 紅豆杉紫杉醇生物合成研究現(xiàn)狀

2.1.1 紫杉醇生物合成基因 紫杉醇的生物合成是一個(gè)復(fù)雜的過程，包括四環(huán)骨架的構(gòu)建和側(cè)鏈的加入。上文講到Croteau實(shí)驗(yàn)室還有紫杉烷 9α-羥基化酶、紫杉醇側(cè)鏈 C2-羥基化酶（側(cè)鏈C2位的細(xì)胞色素P450氧化酶）、乙酰CoA連接酶以及D環(huán)形成酶（4，20 環(huán)氧化酶、環(huán)氧乙烷環(huán)氧四環(huán)變位酶）的編碼基因沒有克隆出來。最近，乙酰CoA連接酶和紫杉烷 9α-羥基化酶編碼基因克隆工作取得了一些進(jìn)展，具體介紹如下。

乙酰CoA連接酶負(fù)責(zé)合成β-amino phenylpropanoyl CoAs。密西根州立大學(xué)的Kevin Walker教授實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)來自于微生物短短芽孢桿菌（Brevibacillus brevis）的短桿菌酪肽合成酶A具有CoA ligase的功能，能夠合成α-phenylalanyl、β-phenylalanyl和phenylisoserinyl CoA，后二者正是參與紫杉醇生物合成的前體。 該工作為今后克隆紅豆杉細(xì)胞中的乙酰CoA連接酶提供了方向［33］。

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所戴均貴［34］課題組發(fā)現(xiàn)銀杏（Ginkgo biloba）懸浮細(xì)胞能特異性地對(duì)2α，5α，10β，14β-四乙酰氧基-紫杉-4（20），11-二烯 （sinenxan A，SIA）進(jìn)行9α羥基化，表明銀杏細(xì)胞含有紫杉烷9α-羥基化酶的活性。這啟示我們?nèi)绻业姐y杏中紫杉烷9α-羥基化酶（taxoid 9alphahydroxylase）編碼基因，就有望在紅豆杉細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)紫杉烷9α-羥基化酶，從而完善紅豆杉紫杉醇生物合成這一重要代謝途徑。為此，2013年邱德有實(shí)驗(yàn)室與戴均貴課題組一起利用Illumina 的Genome Analyzer IIx對(duì)銀杏（Ginkgo biloba）細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了高通量測(cè)序。通過測(cè)序，獲得了銀杏細(xì)胞69 286個(gè) contig，56 387個(gè) scaffold，32 032個(gè) unigene。 Unigene平均長(zhǎng)度636 bp。通過分析unigene的功能注釋，發(fā)現(xiàn)66個(gè)unigene屬于CYP450基因家族，726個(gè)unigene參與次生代謝物合成，其中59個(gè)unigene與萜類合成有關(guān)，17個(gè)unigene與二萜類合成相關(guān)，最后利用生物信息學(xué)方法從Michigan State University銀杏成熟葉、側(cè)根、成熟果實(shí)、無菌苗以及次生莖的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中找到了與銀杏細(xì)胞CYP450高度同源的紫杉烷羥基化酶候選基因15個(gè)［35］。接著，我們用無細(xì)胞蛋白合成體系（in vitro cell-free protein synthesis assays）結(jié)合LC-MS 分析，從中發(fā)現(xiàn)一個(gè)屬于CYP716B的P450基因，它編碼的酶具有紫杉烷 9α-羥基化酶的活性。我們利用銀杏細(xì)胞這一獨(dú)特活性，在國(guó)際上率先從銀杏細(xì)胞中分離、克隆到紫杉烷 9α-羥基化酶的基因（taxoid 9α-hydroxylase），這項(xiàng)工作為今后從紅豆杉中克隆出紫杉烷 9α-羥基化酶的基因奠定了基礎(chǔ)［36］。

表2 已授權(quán)的紫杉醇生物合成基因的專利

2.1.2 紅豆杉轉(zhuǎn)錄組 相對(duì)于傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序而言，高通量測(cè)序技術(shù)被稱為“下一代測(cè)序技術(shù)”。它具有高測(cè)序產(chǎn)量和高解析度的優(yōu)點(diǎn)。高通量測(cè)序一次可以完成幾十萬到幾百萬條DNA分子序列的測(cè)定，目前亦被廣泛地應(yīng)用于紫杉醇生物合成的研究中。Sun等［37］利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)前后的曼地亞紅豆杉細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在29個(gè)已知的二萜類化合物骨架和紫杉醇生物合成相關(guān)的基因中有18個(gè)基因的表達(dá)量在MeJA誘導(dǎo)后升高。通過qRT-PCR（實(shí)時(shí)熒光定量PCR）技術(shù)驗(yàn)證了其中9個(gè)紫杉醇生物合成相關(guān)基因的表達(dá)確實(shí)發(fā)生顯著的上調(diào)，鑒定出了多個(gè)可能參與紫杉醇生物合成未知步驟的候選基因，并且發(fā)現(xiàn)了一些可能與有關(guān)紅豆杉細(xì)胞紫杉醇的運(yùn)輸和降解有關(guān)的基因。此外，我們還對(duì)潛在的miRNA進(jìn)行分析，結(jié)果表明miRNA很可能在MeJA誘導(dǎo)后紫杉醇生物合成基因的表達(dá)調(diào)控中起著重要作用［37］。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的Li等［38］也對(duì)茉莉酸甲酯（MeJA）誘導(dǎo)下的中國(guó)紅豆杉細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，為進(jìn)一步闡明MeJA誘導(dǎo)紫杉醇產(chǎn)生的分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。Li等的研究發(fā)現(xiàn)中國(guó)紅豆杉細(xì)胞多個(gè)網(wǎng)絡(luò)途徑受到了調(diào)控，包括植物組蛋白生物合成和苯丙氨酸生物合成途徑。除了illumina測(cè)序平臺(tái)之外，454測(cè)序平臺(tái)也已經(jīng)被利用到紅豆杉轉(zhuǎn)錄組的研究工作中。Wu等［39］利用454測(cè)序技術(shù)對(duì)東北紅豆杉的針葉進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，他們共獲得了81 148條高質(zhì)量的短reads，組裝出了20 557條無重復(fù)的序列，包括12 975條singletons和7 582條contigs，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)紫杉醇生物合成的候選基因。另外，Lenka等［40］利用消減抑制雜交（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）法對(duì)MeJA處理不同時(shí)間的東北紅豆杉懸浮細(xì)胞進(jìn)行分析，獲取得到了331個(gè)unigene的信息，與轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)相比較，消減抑制雜交得到的信息資源略少，但它和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序高通量測(cè)序一樣，也可以為今后開展紅豆杉紫杉醇生物合成未知基因的克隆提供思路。

2.1.3 紫杉醇合成生物學(xué)技術(shù) 美國(guó)麻省理工學(xué)院Gregory Stephanopoulos教授研究組的Ajikumar等［41］利用二萜生物合成上游的甲基赤蘚糖醇途徑（methylerythritol-phosphate pathway，MEP）以及下游萜類化合物合成通路中已知的基因信息，采取了一個(gè)多元模塊（multivariate-modular）的策略，使有關(guān)基因的拷貝數(shù)和啟動(dòng)子的強(qiáng)度得到了最優(yōu)化，結(jié)果成功地在大腸桿菌中過量表達(dá)包括紫杉二烯合成酶基因（TS）和紫杉烷 5α-羥基化酶基因（T5H）在內(nèi)的兩個(gè)合成紫杉醇前體的生物合成基因，大腸桿菌培養(yǎng)物中紫杉二烯的水平達(dá)到1 g/L，而紫杉二烯5α-醇（taxadiene 5α-ol）的產(chǎn)量也達(dá)到了（58±3）mg/L，大大增加了大腸桿菌中這兩種紫杉醇前體的產(chǎn)量。最近，同一實(shí)驗(yàn)室發(fā)明了一種含不同紫杉醇生物合成基因的大腸桿菌與酵母工程菌的共培養(yǎng)技術(shù)，他們發(fā)現(xiàn)含紫杉烷 5α-羥基化酶（T5H）及其還原酶基因CPR（即5αCYP-CPR基因）的酵母與含紫杉二烯合成酶基因（TS）的大腸桿菌共培養(yǎng)72 h后，紫杉二烯5α-醇的產(chǎn)量為2 mg/L。進(jìn)一步對(duì)上述酵母中有關(guān)啟動(dòng)子及含紫杉烷二烯合成酶基因（TS）的大腸桿菌進(jìn)行優(yōu)化后，兩種優(yōu)化菌株之間共培養(yǎng)120 h紫杉二烯5α-醇的產(chǎn)量達(dá)到了33 mg/L。而當(dāng)含紫杉二烯5α-醇乙酰基轉(zhuǎn)移酶基因（taxadien-5α-ol acetyl-transferase gene，TAT）、紫杉烷 10β-羥基化酶（T10H）及其還原酶基因CPR以及紫杉烷 5α-羥基化酶（T5H）及其還原酶基因CPR（即5αCYP-CPR基因）的工程酵母菌與經(jīng)過優(yōu)化的紫杉二烯合成酶基因（TS）的大腸桿菌菌株共培養(yǎng)后，每升培養(yǎng)物中紫杉二烯-5α-酯-10β-醇（taxadien-5α-acetate-10βol）的產(chǎn)量達(dá)到了30 mg/L［42］。這是國(guó)際上首個(gè)成功用酵母菌和大腸桿菌兩種微生物同時(shí)表達(dá)除還原酶基因CPR之外的4個(gè)紫杉醇生物合成基因的例子。這些工作為今后進(jìn)一步利用合成生物學(xué)技術(shù)生產(chǎn)并提高紫杉醇生物合成的能力奠定了良好基礎(chǔ)，提供了強(qiáng)有力的理論指導(dǎo)。

2.2 內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成研究現(xiàn)狀

Heinig 等［43］在2013年報(bào)道了產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae的基因組測(cè)序和其中一些二萜合成酶的測(cè)試結(jié)果，他們沒有在該內(nèi)生真菌中發(fā)現(xiàn)紫杉二烯合成酶基因的存在，并認(rèn)為從內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae所檢測(cè)到的紫杉醇是從其寄主植物中吸收過來的，而不是內(nèi)生真菌Taxomycesandreanae本身所合成的。但這一結(jié)論顯然與一些不能產(chǎn)紫杉醇的植物（如柏樹）等中也能分離到產(chǎn)紫杉醇真菌的結(jié)果相矛盾。同年，Xiong 等［44］從曼地亞紅豆杉（Taxus×media）中分離到81個(gè)內(nèi)生真菌，其中芒果球座菌（Guignardia mangiferae）HAA11、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）HBA29和膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）TA67這3個(gè)菌株能產(chǎn)紫杉醇。進(jìn)一步測(cè)序發(fā)現(xiàn)HBA29菌株中的TS基因和HAA11及TA67菌株中的BAPT基因與寄主植物曼地亞紅豆杉中的TS基因和BAPT基因的一致性分別只有 40.6%、40.0%和44.1%，因此他們認(rèn)為產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌與其寄主植物曼地亞紅豆杉之間很可能不存在水平基因轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)室在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院中央公益基金項(xiàng)目“植物內(nèi)生真菌紫杉醇生物合成分子機(jī)理的研究”的資助下，與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)的賴錦盛教授和美國(guó)波特蘭大學(xué)的Hoffman Angela教授等合作，完成了榛子產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌-青霉菌（Penicillium aurantiogriseum NRRL 62431）的全基因組測(cè)序工作并進(jìn)行了基因注釋，成功預(yù)測(cè)出11 476個(gè)基因。通過與紅豆杉轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行Blast比對(duì)等生物信息學(xué)分析，獲得了如GGPPS、PAM、酰基轉(zhuǎn)移酶和羥基化酶的編碼基因等多個(gè)紫杉醇生物合成相關(guān)的候選基因。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生真菌中的紫杉醇生物合成候選基因與紅豆杉等寄主植物中的有關(guān)基因編碼的氨基酸序列差異很大，同源性低，具有明顯不同的進(jìn)化模式，與紅豆杉等寄主植物應(yīng)該不存在水平基因轉(zhuǎn)移事件。我們的結(jié)論推翻了國(guó)際上流行的“水平基因轉(zhuǎn)移”的假說，并為下一步的研究提供了一個(gè)新思路和一批有用的基因資源［45］。

3 展望

在過去的20多年時(shí)間里，科研工作者在紫杉醇生物合成研究領(lǐng)域中取得了巨大進(jìn)展，已經(jīng)克隆獲得了十多個(gè)紫杉醇生物合成相關(guān)基因，但紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇生物合成途徑的研究需進(jìn)一步推進(jìn)和完善，因?yàn)榧t豆杉紫杉醇的生物合成途徑中還有多個(gè)基因未被成功克隆、鑒定出來，這其中包括側(cè)鏈C2位的羥基化酶、紫杉烷9α-羥基化酶、C9 位羰基形成所需的酶和D環(huán)形成酶之編碼基因。紫杉醇生物合成途徑剩余步驟的闡明及其有關(guān)基因的克隆與功能鑒定需要一系列合適的中間體，而紫杉醇生物合成途徑中的中間體在紅豆杉中往往含量很低或很快被代謝掉，很難直接從植物本身中分離到，或者很難用化學(xué)的方法人工合成。這是目前本領(lǐng)域所面臨的最關(guān)鍵的問題。一旦我們能夠獲得一些參與紫杉醇生物合成途徑未知步驟的合適中間體，那么紅豆杉細(xì)胞中紫杉醇生物合成途徑剩余步驟的解析以及生物合成途徑中剩余的多個(gè)未知基因的克隆與功能鑒定將會(huì)取得突破。另外，進(jìn)一步闡明紅豆杉細(xì)胞紫杉醇生物合成關(guān)鍵酶基因及其調(diào)控機(jī)制，并圍繞這些基因開展紅豆杉細(xì)胞轉(zhuǎn)基因的工作，對(duì)于提高紅豆杉細(xì)胞及植株中紫杉醇的產(chǎn)量、實(shí)現(xiàn)紫杉醇產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)也具有十分重要的意義。

合成生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠生產(chǎn)一定量的紫杉醇的前體物質(zhì)——紫杉二烯、紫杉二烯5α-醇甚至紫杉二烯-5α-酯-10β-醇，但距離應(yīng)用合成生物學(xué)技術(shù)全合成出紫杉醇還有相當(dāng)大的差距，還有一系列相關(guān)的基礎(chǔ)性工作需要開展，還需要進(jìn)行一番艱巨的攻關(guān)。一旦紅豆杉紫杉醇生物合成基因全部得到克隆和鑒定，利用合成生物學(xué)技術(shù)全合成紫杉醇就有可能會(huì)實(shí)現(xiàn)。盡管這方面的研究將面臨前所未有的困難和難以想象的挑戰(zhàn)，但我們有理由相信在國(guó)內(nèi)外有關(guān)科學(xué)家的共同努力下，這一夢(mèng)想會(huì)在不久的將來變成現(xiàn)實(shí)。

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History，Current Status and the Prospects of Taxol Biosynthesis Research

Qiu Deyou1Zhang Bin2Yang Yanfang1Shao Fenjuan1Teng Wenjing2
（1. State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，the Research Institute of Forestry，Chinese Academy of Forestry，Beijing 100091；2. Patent Examination Cooperation Center of the Patent Office，SIPO，Beijing 100190）

Taxol is a diterpene isolated from Taxus. It is one of the most widely used compounds in the treatment of lung, ovarian and breast cancer. In this paper, the history of taxol biosynthesis research, its current status and the present research progress are reviewed. The future directions as well as the prospects of taxol biosynthesis research are also discussed.

taxol； biosynthesis research； current status； the prospects

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2015.03.004

2015-01-20

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31170628，31300567），中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（RIF2014-01）

邱德有，男，研究員，研究方向：植物次生代謝，E-mail：qiudy@caf.ac.cn；張彬，男，碩士研究生，研究方向：生物領(lǐng)域?qū)＠麑彶檠芯?，E-mail：zhangbin_1@sipo.gov.cn；張彬同為本文第一作者