重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子rh-β-NGF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

李景傳，薛博夫，袁媛，馬墨，朱林，Rebecca Milburn，李樂(lè)，胡沛臻，葉菁

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重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子rh-β-NGF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

李景傳1，薛博夫2，袁媛1，馬墨2，朱林2，Rebecca Milburn2，李樂(lè)1，胡沛臻1，葉菁1

1 第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部病理教研室，陜西西安 710032 2 深圳市港科深研生物科技有限公司，廣東深圳 518067

李景傳, 薛博夫, 袁媛, 等.重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子rh-β-NGF真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其在HEK293細(xì)胞中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(3): 411–420.Li JC, Xue BF, Yuan Y, et al. Construction of recombinant human nerve growth factor (rh-β-NGF) eukaryotic vector and its expression in HEK293 cells. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 411–420.

為大量制備β-NGF，構(gòu)建了一種穩(wěn)定、高效表達(dá)重組人神經(jīng)生長(zhǎng)因子(Recombinant human nerve growth factor，rh-β-NGF) 的真核表達(dá)載體及含該重組載體的HEK293細(xì)胞株。首先，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr并轉(zhuǎn)染至HEK293細(xì)胞系，用MTX加壓篩選和有限稀釋法進(jìn)行選擇，獲得高效表達(dá)rh-β-NGF的單克隆重組細(xì)胞株；隨后逐步降低血清培養(yǎng)，最終使細(xì)胞株完全適應(yīng)無(wú)血清培養(yǎng)基并穩(wěn)定表達(dá)rh-β-NGF；SDS-PAGE分析該表達(dá)產(chǎn)物，可見相對(duì)分子質(zhì)量約13 kDa的條帶，純度大于50％，經(jīng)質(zhì)譜法測(cè)定得到其肽圖譜與理論序列完全匹配，接著利用離子交換層析和分子篩層析純化rh-β-NGF；最后進(jìn)行重組細(xì)胞株表達(dá)效率和表達(dá)穩(wěn)定性檢測(cè)，表明重組細(xì)胞株可穩(wěn)定、高效表達(dá)rh-β-NGF，其分泌效率大于20 pg/(cell?d)，并能誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的分化，具有良好的生物學(xué)活性。

重組，神經(jīng)生長(zhǎng)因子，真核載體，HEK293細(xì)胞，活性鑒定

神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF) 是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)、目前研究最為透徹的一種神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子，具有神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)和促突起生長(zhǎng)雙重生物學(xué)功能，它對(duì)中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長(zhǎng)、再生和功能特性的表達(dá)均具有重要的調(diào)控作用[1]。關(guān)于NGF，已有很多的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，旨在應(yīng)用NGF作為保護(hù)和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的高效藥物。而且近年研究認(rèn)識(shí)到NGF并不僅僅局限于中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)甚至不僅局限在神經(jīng)細(xì)胞水平，還在褥瘡[2]、角膜潰瘍[3]、青光眼[4]和免疫性疾病的治療中發(fā)揮著積極的作用[5]。目前生產(chǎn)NGF的方法主要有兩種[6]：一種是從小鼠頜下腺提取的分子量約為13?14 kDa，沉降系數(shù)為2.5 S的β-NGF，此種方式所獲得的β-NGF具有如下缺點(diǎn)：1) 鼠NGF與人NGF在蛋白序列上有10%的差異[7]，使其具有免疫原性，可能誘發(fā)抗體反應(yīng)，從而降低藥效；2) 具有鼠源病毒交叉感染的安全隱患；3) 生產(chǎn)依賴活體動(dòng)物。另一種是由原核表達(dá)系統(tǒng) () 重組表達(dá)制備，此種方式的缺陷是蛋白不能進(jìn)行翻譯后修飾，所得β-NGF活性明顯低于天然β-NGF[6,8]。因此，開發(fā)一種可穩(wěn)定、高效表達(dá)天然活性β-NGF的表達(dá)系統(tǒng)具有重要的臨床意義及商業(yè)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)在人HEK293細(xì)胞中表達(dá)重組人β-NGF (Recombinant human β-NGF，rh-β-NGF)，構(gòu)建一種可穩(wěn)定、高效表達(dá)天然活性β-NGF的重組表達(dá)載體，和基于該重組表達(dá)載體的重組真核細(xì)胞株，以及基于該重組真核細(xì)胞株的生產(chǎn)人β-NGF的方法，為大量制備β-NGF提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑

人HEK293細(xì)胞、PC12細(xì)胞購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)；pCMV-MCS載體、pIRES2-EGFP質(zhì)粒購(gòu)自Addgene公司；Trizol試劑盒、MTX、Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、FreeStyle293培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen公司；DNA marker、Ⅰ和Ⅱ剪切酶、HⅠ酶和d Ⅲ酶購(gòu)自TaKaRa公司；DEME完全培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清購(gòu)自Gibco公司；蛋白marker購(gòu)自Thermo Fisher公司；注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子購(gòu)自舒泰神(北京) 生物制藥股份有限公司產(chǎn)品，即蘇肽生；引物合成和基因測(cè)序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 人基因的克隆及pCMV-β-NGF重組載體的構(gòu)建

使用Trizol試劑盒提取人胎盤細(xì)胞總RNA，所得總RNA為模板，使用Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA庫(kù)，使用特異性擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的引物，在DNA聚合酶的催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)。特異性擴(kuò)增基因全長(zhǎng)的上、下游引物序列如表1所示，引物分別包括了HⅠ和d Ⅲ的酶切位點(diǎn)，上游引物上還設(shè)計(jì)了序列 (GCCACCATGG)[9]，并且點(diǎn)突變了基因ATG啟動(dòng)密碼子后第一個(gè)堿基 (T突變成G)；下游引物上包含兩個(gè)終止碼 (TGATAA)。收集并純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，利用上、下游引物上的酶切位點(diǎn)：HⅠ和d Ⅲ將擴(kuò)增片段構(gòu)建到pCMV-MCS載體 (包含CMV啟動(dòng)子和β球蛋白基因內(nèi)含子序列) 上，得到重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF，進(jìn)行酶切電泳及測(cè)序分析。

1.3 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的構(gòu)建

1.3.1 PCR擴(kuò)增

以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，以正向引物 (包含Ⅰ酶切位點(diǎn)) 和反向融合引物 (表1) 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，得到長(zhǎng)度為612 bp的擴(kuò)增片段IRES，收集并純化。

1.3.2 PCR擴(kuò)增

以人HEK293細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以正向融合引物和反向引物 (包含Ⅱ酶切位點(diǎn)，序列如表1所示) 為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)。得到長(zhǎng)度為592 bp的擴(kuò)增片段，收集并純化。

表1 PCR引物序列

Restriction site were underlined. F: forward primer; R: reverse primer.

1.3.3 PCR融合擴(kuò)增

將以上PCR擴(kuò)增片段和為模板，以正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，5個(gè)循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，55個(gè)循環(huán)，得到與的融合片段，片段長(zhǎng)度為1 170 bp，收集并純化融合片段。

1.3.4構(gòu)建至pCMV-β-NGF

將上述融合片段用Ⅰ和Ⅱ雙酶切，所得酶切產(chǎn)物與經(jīng)Ⅰ和Ⅱ酶切處理的pCMV-β-NGF重組載體連接，即得pCMV-β-NGF-IRES-dhfr重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切電泳及測(cè)序分析。

1.4 β-NGF重組細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定篩選

使用氯化銫密度梯度離心法純化pCMV-β- NGF-IRES-dhfr質(zhì)粒，備后續(xù)步驟使用。用DEME完全培養(yǎng)基 (含10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)HEK293細(xì)胞至60%單層，用磷酸鈣共沉淀方法轉(zhuǎn)染純化后的pCMV-β-NGF-IRES-dhfr質(zhì)粒至HEK293細(xì)胞中；24 h后更換培養(yǎng)基，并加入50 nmol/L的MTX進(jìn)行篩選。當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)選擇壓力后，逐次遞增MTX濃度，依次為100、200、400、800 nmol/L。當(dāng)細(xì)胞適應(yīng)800 nmol/L的MTX后，進(jìn)一步提升MTX濃度至1 000 nmol/L，并使用有限稀釋法選擇高效表達(dá)β-NGF的單克隆細(xì)胞株，即為β-NGF重組細(xì)胞株。我們通過(guò)此方法篩選出10株可穩(wěn)定表達(dá)β-NGF的重組細(xì)胞株。

1.4.2 重組細(xì)胞株無(wú)血清培養(yǎng)基適應(yīng)及表達(dá)產(chǎn)物的電泳鑒定

重組細(xì)胞株通過(guò)逐步降低血清培養(yǎng)的方式，使其先適應(yīng)了含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，接著在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方式下，逐步用FreeStyle293無(wú)血清培養(yǎng)基替換DMEM培養(yǎng)基，最終完全替換，使其完全適應(yīng)FreeStyle293無(wú)血清培養(yǎng)基。收集適量培養(yǎng)基，取樣進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。

1.4.3 質(zhì)譜鑒定表達(dá)產(chǎn)物rh-β-NGF

實(shí)驗(yàn)采用毛細(xì)管液相色譜分離-電噴霧離子化-四級(jí)桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜法 (UPLC-ESI-Q-TOF-MS) 對(duì)β-NGF進(jìn)行肽圖譜測(cè)定：β-NGF用胰蛋白酶水解后溶于0.1% (/) 甲酸溶液，用反相納升級(jí)液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。采用BEH130毛細(xì)管液相色譜，樣品上樣10 μL至富集柱 (180 μm×20 mm, Symmetry C18 trap column) 上，用緩沖液A (即0.1%甲酸水溶液) 以10 μL/min流速脫鹽10 min，在線切換至反相C18分離柱 (75 μm×250 mm)。洗脫梯度為：體積含量為1%?5%的緩沖液B (即含0.1%甲酸的乙腈溶液) 5 min，然后在90 min內(nèi)升高至體積含量為40%的緩沖液B，之后以體積含量為99%的緩沖液B沖洗分離柱15 min，流速為200 nL/min。根據(jù)由胰蛋白酶理論水解位點(diǎn)推斷的β-NGF胰蛋白酶肽圖譜的特征碎片離子數(shù)據(jù)，對(duì)所得質(zhì)譜肽圖進(jìn)行分析。

1.4.4 rh-β-NGF的純化及純化產(chǎn)物的鑒定

收集含rh-β-NGF的培養(yǎng)上清1 200 mL，用0.45 μm濾膜微濾，隨后用超濾膜超濾濃縮約8倍。超濾液上樣于SP Sepharose FF強(qiáng)陽(yáng)離子層析介質(zhì) (機(jī)型：GE Healthcare 的AKTA Purifier 10)，平衡緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，洗脫緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、1 mol/L NaCl，pH 6.0，流速3 mL/min，用20個(gè)柱體積進(jìn)行0?100%線性洗脫，收集目標(biāo)峰，無(wú)菌分裝。另外，為檢測(cè)純化后rh-β-NGF的純度和濃度，取以上小量目標(biāo)蛋白洗脫峰，上樣于Superdex 75 10/300 GL預(yù)裝柱 (機(jī)型：Agilent公司的1260 Infinity LC)，層析緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，流速1 mL/min，收集目標(biāo)峰。在液相色譜曲線中，根據(jù)各組分的峰面積值計(jì)算出rh-β-NGF的純度，采用內(nèi)標(biāo)對(duì)比法測(cè)定蛋白的濃度。純化后rh-β-NGF進(jìn)行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色、脫色。

1.5 PC12誘導(dǎo)法檢測(cè)重組細(xì)胞株所分泌rh-β-NGF的活性

在37 ℃、5% CO2環(huán)境下用DMEM完全培養(yǎng)基 (含5%胎牛血清，12%馬血清) 培養(yǎng)PC12細(xì)胞至90%單層，胰酶消化細(xì)胞，并將消化后的細(xì)胞按每孔5×105個(gè)細(xì)胞種植于六孔板中；24 h后，清除所有培養(yǎng)基并于每孔內(nèi)加入2 mL新鮮培養(yǎng)基和系列濃度的rh-β-NGF，rh-β-NGF終濃度為0、10、25、50、100、150 ng/mL，于37 ℃、5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；以空載體pCMV-MCS轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞上清組作陰性對(duì)照組，以加入相應(yīng)等同終濃度的注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (蘇肽生) 作陽(yáng)性對(duì)照組，在相差顯微鏡下觀察PC12細(xì)胞形態(tài)。

1.6 重組細(xì)胞株分泌rh-β-NGF的效率檢測(cè)

選出6株穩(wěn)定表達(dá)β-NGF的重組細(xì)胞株置于裝有低血清培養(yǎng)基 (含1% FBS) 的搖瓶中培養(yǎng)，1?2 d后，離心收集細(xì)胞，并用新鮮培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106細(xì)胞/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，同時(shí)進(jìn)行電泳的還有系列稀釋的BSA標(biāo)準(zhǔn)品，電泳結(jié)束后將凝膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色和脫色。

1.7 重組細(xì)胞的細(xì)胞系穩(wěn)定性試驗(yàn)

重組細(xì)胞株在無(wú)MTX低血清的培養(yǎng)基 (含1% FBS) 中傳代30、40、50次和60次后，各取2×106個(gè)細(xì)胞種植在60 mm培養(yǎng)皿里，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，每泳道上樣15 μL，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán)染色和脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β-NGF的鑒定

重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β-NGF經(jīng)測(cè)序分析證實(shí)，基因片段已整合重組質(zhì)粒中，含有與GenBank (Accession No. 4803)公開的人基因全長(zhǎng)序列完全相同的序列。對(duì)pCMV-β-NGF進(jìn)行酶切鑒定，得到大小為749 bp和4 270 bp的兩條帶，結(jié)果與預(yù)期一致 (圖1)。

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的鑒定

DNA測(cè)序結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒包含CMV啟動(dòng)子、β球蛋白基因內(nèi)含子、基因全長(zhǎng)、序列和基因。用Ⅰ和Ⅱ雙酶切對(duì)pCMV-β-NGF-IRES-dhfr進(jìn)行酶切鑒定，得到大小為1 158 bp 和4 942 bp的兩條帶，結(jié)果與預(yù)期一致 (圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF瓊脂糖電泳分析

圖2 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr瓊脂糖電泳分析

2.3 重組細(xì)胞株分泌rh-β-NGF的SDS-PAGE鑒定

重組細(xì)胞株可以分泌rh-β-NGF到液態(tài)培養(yǎng)基中。我們將一株已適應(yīng)FreeStyle293無(wú)血清培養(yǎng)基的β-NGF重組細(xì)胞株按1×106/mL的起始密度置于裝有FreeStyle293無(wú)血清培養(yǎng)基的搖瓶中連續(xù)培養(yǎng)6 d，期間每天收集適量培養(yǎng)基，并更換新鮮培養(yǎng)基。對(duì)第1?6天的取樣結(jié)果進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳 (1、2、3、4、5、6分別代表第1、2、3、4、5、6 d所收集的培養(yǎng)基，每個(gè)泳道上樣量為15 μL培養(yǎng)基)，以FreeStyle293無(wú)血清培養(yǎng)基作陰性對(duì)照。經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫色 (圖3)，在大約13 kDa的位置處有明顯條帶，純度在50%以上。

2.3.1 rh-β-NGF的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

分泌所得rh-β-NGF經(jīng)質(zhì)譜鑒定，有13段與理論序列相匹配的肽段，其中有代表性的6段序列及所處位置如表2所示，部分相應(yīng)質(zhì)譜圖如圖4所示。質(zhì)譜所測(cè)得的rh-β-NGF肽段序列與理論基因翻譯蛋白序列相符。

圖3 重組細(xì)胞株表達(dá)rh-β-NGF的SDS-PAGE分析

表2 與理論序列相匹配的肽段及位置

圖4 重組細(xì)胞株所分泌rh-β-NGF的部分質(zhì)譜圖

2.3.2 純化產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

純化的rh-β-NGF經(jīng)SDS-PAGE分析，大約13 kDa的位置處有明顯條帶，經(jīng)Quantity One軟件分析，純度在95%以上，與HPLC測(cè)純度結(jié)果>91.7%相符 (圖5)。另外，HPLC測(cè)蛋白濃度結(jié)果為0.163 mg/mL，與Bradford法測(cè)蛋白濃度結(jié)果0.159 mg/mL相符。

2.4 PC12細(xì)胞經(jīng)rh-β-NGF誘導(dǎo)得到分化

PC12細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)后成簇生長(zhǎng)，細(xì)胞有纖維狀突起的細(xì)胞簇為陽(yáng)性細(xì)胞簇，所誘導(dǎo)陽(yáng)性細(xì)胞簇的比例反映了β-NGF的活性。與注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (蘇肽生) 組相似，重組細(xì)胞株分泌的rh-β-NGF組可見陽(yáng)性細(xì)胞簇，而陰性對(duì)照組則無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞簇 (圖6)；說(shuō)明重組細(xì)胞株所分泌的β-NGF具有誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的活性。

圖5 純化rh-β-NGF的SDS-PAGE分析

統(tǒng)計(jì)不同濃度rh-β-NGF組以及注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (蘇肽生) 組所誘導(dǎo)的PC12陽(yáng)性細(xì)胞簇?cái)?shù)占總細(xì)胞簇?cái)?shù)的百分比，以陽(yáng)性細(xì)胞簇百分比為縱坐標(biāo)，以β-NGF濃度為橫坐標(biāo)繪制劑量-反應(yīng)曲線。相同濃度下，重組細(xì)胞株所分泌的rh-β-NGF活性與現(xiàn)有注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (蘇肽生) 的活性相當(dāng)或更強(qiáng) (圖7)。

圖6 NGF誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化

2.5 重組細(xì)胞株高效分泌rh-β-NGF

用Quantity One軟件進(jìn)行密度掃描檢測(cè)13 kDa位置處的條帶光密度，參照BSA標(biāo)準(zhǔn)品的光密度，計(jì)算出β-NGF的含量 (圖8)。經(jīng)檢測(cè)，6株重組細(xì)胞株培養(yǎng)基中的rh-β-NGF含量為50?100 mg/L培養(yǎng)基，計(jì)算其表達(dá)效率約為20?50 pg/(cell?d)。

圖7 不同濃度rh-β-NGF組和注射用鼠神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (蘇肽生) 組誘導(dǎo)PC12陽(yáng)性細(xì)胞簇?cái)?shù)的百分比

2.6 重組細(xì)胞系經(jīng)多次傳代仍穩(wěn)定表達(dá)rh-β-NGF

細(xì)胞系經(jīng)歷30、40、50和60次傳代后仍能表達(dá)rh-β-NGF (圖9)，且表達(dá)效率穩(wěn)定，培養(yǎng)基中β-NGF含量約100 mg/L。

圖8 重組細(xì)胞株分泌rh-β-NGF的效率檢測(cè)

圖9 重組細(xì)胞株分泌rh-β-NGF的穩(wěn)定性檢測(cè)

3 討論

NGF包含α、β、γ 3個(gè)亞基，活性區(qū)是β亞基，它具有完整的NGF生物學(xué)活性，是與BDNF、NT-3和NT-4結(jié)構(gòu)相關(guān)的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子，為含有半胱氨酸結(jié) (Cysteine knot) 的穩(wěn)定二聚體結(jié)構(gòu)家族，由兩個(gè)118個(gè)氨基酸組成的單鏈通過(guò)非共價(jià)鍵結(jié)合而成[10]。β-NGF初始翻譯產(chǎn)物由信號(hào)肽、前導(dǎo)肽及成熟肽3部分組成，即pre-pro-NGF[11]，其中，信號(hào)肽負(fù)責(zé)新生肽鏈的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，前導(dǎo)肽能幫助成熟肽形成具有生物學(xué)活性的正確構(gòu)象，而成熟肽才是具有生物學(xué)活性的肽段[8,12-13]。目前，已經(jīng)有多種采用基因工程方法制備人的NGF，選擇的表達(dá)系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞及腺病毒等，其中大腸桿菌不具備蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng)[14]，酵母細(xì)胞的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾方式與高等真核生物差別較大，很難獲得具有較高生物活性的產(chǎn)物[15-16]，而其他表達(dá)系統(tǒng)也都有多種明顯的缺陷。

本實(shí)驗(yàn)選擇哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，利用基因重組技術(shù)可將表達(dá)人NGF的基因片段插入動(dòng)物細(xì)胞系的基因組里，使這些細(xì)胞持續(xù)穩(wěn)定高表達(dá)人NGF蛋白。真核細(xì)胞系統(tǒng)具有高等真核生物完整的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng)，具備有利于外源基因表達(dá)產(chǎn)物二硫鍵形成的細(xì)胞環(huán)境，擁有完備的轉(zhuǎn)錄后加工過(guò)程, 包括糖基化、羧基化，使表達(dá)的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性[17]，使得基因重組人NGF和人體自身NGF蛋白序列完全一致。此外，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組細(xì)胞株是分泌型細(xì)胞株，可以高效表達(dá)并分泌NGF蛋白到培養(yǎng)基中，此特點(diǎn)將大大降低下游蛋白純化的工藝難度和成本，避免了如細(xì)胞破碎等會(huì)增加大量宿主細(xì)胞雜質(zhì)蛋白和宿主雜質(zhì)DNA等工藝。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下可以進(jìn)一步減少外源雜質(zhì)和潛在污染源，簡(jiǎn)化純化工藝，提高回收率，并且大大降低純化成本。

本實(shí)驗(yàn)中，我們優(yōu)選地構(gòu)建出的重組表達(dá)載體主要由5部分組成：?jiǎn)?dòng)子 (CMV)、β球蛋白基因內(nèi)含子[18-19](簡(jiǎn)稱BGI，可增強(qiáng)人基因的轉(zhuǎn)錄效率，還可促進(jìn)mRNA從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng))、人基因、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)序列[20-21](簡(jiǎn)稱，可招募核糖體對(duì)mRNA進(jìn)行翻譯，以此可調(diào)控其下游篩選標(biāo)記基因的表達(dá)) 和篩選標(biāo)記基因 ()。重組表達(dá)載體采用一個(gè)啟動(dòng)子同時(shí)誘導(dǎo)基因和篩選標(biāo)記基因轉(zhuǎn)錄、并使用啟動(dòng)后者翻譯的方式，使得細(xì)胞耐藥性和表達(dá)量高度統(tǒng)一[22]。因此，當(dāng)使用該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞時(shí)，篩選出陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞株的概率較大，所得重組表達(dá)細(xì)胞株在篩選條件下可持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)β-NGF蛋白，細(xì)胞系經(jīng)多次傳代后，仍能高效表達(dá)β-NGF蛋白，其分泌效率大于 20 pg/(cell?d)，為大量制備β-NGF提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為進(jìn)一步可能的臨床應(yīng)用作出了貢獻(xiàn)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Construction of recombinant human nerve growth factor (rh-β-NGF) eukaryotic vector and its expression in HEK293 cells

Jingchuan Li1, Bofu Xue2, Yuan Yuan1, Mo Ma2, Lin Zhu2, Rebecca Milburn2, Le Li1, Peizhen Hu1, and Jing Ye1

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Human nerve growth factor (NGF) is a nerve cell growth regulation factor, which can provide nutrition for the neurons and promote the neurites outgrowth. In order to produce large-scale recombinant human nerve growth factor (rh-beta-NGF), we constructed a plasmid vector, which can stably express the rh-beta-NGF in the HEK293 cell lines. First, the plasmid of pCMV-beta-NGF-IRES-dhfr was constructed and transformed into HEK293 cells. Then MTX pressurized filter and limiting dilution methods were used to obtain monoclonal HEK293 cell lines. After stepwise reducing serum in culture media, the cells eventually adapted to serum-free medium and secreted rh-beta-NGF. SDS-PAGE analysis revealed that the expression product owned a molecular weight of about 13 kDa and a purity of more than 50%. The peptide mapping sequencing analysis demonstrated the sequences of rh-beta-NGF matched with the theoretical ones. Later we purified this protein by ion exchange and molecular sieve chromatograph. Finally, our experimental results exhibited that the recombinant cell lines can stably express rh-beta-NGF with a high efficiency of more than 20 pg/cell?day. In addition, this protein could successfully induce differentiation of PC12 cells. In summary, our recombinant HEK293 cells can express bio-active rh-beta-NGF with great efficiency and stability, which supply a valid basis to large-scale production of rh-beta-NGF.

recombinant, nerve growth factor (NGF), eukaryotic vectors, HEK293 cells, biological activities identification

May 13, 2014; Accepted:August 11, 2014

Jing Ye. Tel: +86-29-84772257; E-mail: yejing1219@gmail.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 81101711, 81101752), National Major Special Program of New Drug Research and Development (No. 2009ZX09102-226).

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 81101711，81101752)，重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng) (No. 2009ZX09102-226) 資助。