萃取-水相乙基化衍生結(jié)合GC-CVAFS法測(cè)定大米和魚(yú)樣品中的甲基汞

劉沛明

（廣西壯族自治區(qū)合浦縣疾病預(yù)防控制中心，廣西合浦536100）

萃取-水相乙基化衍生結(jié)合GC-CVAFS法測(cè)定大米和魚(yú)樣品中的甲基汞

劉沛明

（廣西壯族自治區(qū)合浦縣疾病預(yù)防控制中心，廣西合浦536100）

建立萃取-水相乙基化衍生結(jié)合GC-CVAFS測(cè)定大米和魚(yú)樣品中甲基汞的方法。應(yīng)用堿消解和有機(jī)溶劑CH2Cl2萃取技術(shù)，將樣品中的甲基汞萃取出來(lái)并預(yù)富集至水相，而后進(jìn)行乙基化反應(yīng)，最后用GC-CVAFS聯(lián)用系統(tǒng)分離測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：方法檢出限0.001 2ng/g，萃取前后標(biāo)準(zhǔn)樣品回收率分別為97%和95%，精密度RSD均小于5.8%。該方法快速、精密度高、檢測(cè)限低，能用于環(huán)境中痕量甲基汞的檢測(cè)與分析。

大米；魚(yú)；甲基汞；氣相色譜-冷原子熒光法

研究認(rèn)為，國(guó)外和我國(guó)沿海地區(qū)，甲基汞主要通過(guò)食用海產(chǎn)品和魚(yú)類(lèi)攝入，而在中國(guó)內(nèi)地，食用大米是甲基汞暴露的主要途徑[9]。因此，本文以大米作為植物樣品，魚(yú)作為動(dòng)物樣品，經(jīng)過(guò)堿消解后，大米樣品用CH2Cl2萃取分離，魚(yú)樣經(jīng)過(guò)水相乙基化-Tenax管富集，最后經(jīng)氣相色譜和冷原子熒光法（GC-CVAFS）進(jìn)行測(cè)定，此實(shí)驗(yàn)前處理方便，樣品的測(cè)定精密度高。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

主要儀器：冷原子熒光儀（CVAFS）（Brooks Rand III，美國(guó)）；石英玻璃管（填充石英棉）、鎳鉻絲電熱線圈；150mL高硼硅酸玻璃氣泡瓶；高速離心機(jī)（3 500 r/min）；樣品振蕩機(jī)；Tenax-TA（Alltech，20/35目）富集管（Tenax，100mg）；數(shù)據(jù)處理軟件（Mercury Guru 4）；配有超級(jí)恒溫儀的氣相色譜柱（15%OV-3，Chromosorb W-AW80/100，內(nèi)徑0.5 cm，長(zhǎng)75 cm，美國(guó)Brooks Rand）；變壓器（0～220V）。

主要試劑：250 g/L KOH甲醇溶液；二氯甲烷（CH2Cl2，分析純）；去離子水；2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（136g乙酸鈉和59mL冰乙酸溶于去離子水中，定容至0.5L）；10g/L乙基化試劑（NaBEt4）（1.0g NaBEt4溶于100mL 20g/L KOH溶液，搖勻，冷凍避光保存）；干燥管（用顆粒狀的蘇打填充）；氯化甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液（1μg/mL，Brooks Rand Ltd，美國(guó)）；標(biāo)準(zhǔn)樣品（Tort-2）。

1.2 樣品處理

1.2.1 堿消解

準(zhǔn)確稱取0.1～0.2g干生物樣品（濕重：0.5～0.8g，m0），置于50mL特氟龍消解罐中。加入5mL預(yù)先配置的KOH甲醇溶液，用水浴消解或烘箱消解3h，消解溫度約75～80℃（用水浴鍋更安全，烘箱不穩(wěn)定易使消解罐變形）。消解過(guò)程中，每隔30min搖晃一次，使消解液與樣品充分接觸。消解完成后在常溫下冷卻至室溫，再加入濃HCl約3mL，同時(shí)作試劑空白試驗(yàn)。

1.2.2 萃取和反萃取

將10mL CH2Cl2加入到消解液中并稱其質(zhì)量（m1），加入到消解的大米和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品Tort-2的離心管中，密封振蕩30min，再放入離心機(jī)中以3500 r/min離心25min，分層后抽掉上層消解液，轉(zhuǎn)移底部CH2Cl2至50mL的特氟龍瓶中，并稱其質(zhì)量（m2），超純水定容至45mL。魚(yú)樣品和部分Tort-2不進(jìn)行有機(jī)萃取，直接進(jìn)行樣品測(cè)定。

1.2.3 反萃取到水相富集

將特氟龍瓶放在水浴鍋中，開(kāi)始水溫控制在45～50℃下氣化可見(jiàn)CH2Cl2，然后再將溫度升高到80℃，以100～200mL/min的流速用N2吹脫約5min，以趕盡殘余的有機(jī)相，最后用去離子水定容待測(cè)。有機(jī)相中的甲基汞經(jīng)過(guò)反萃取試驗(yàn)后又被富集到水相中。

1.3 樣品測(cè)定

1.3.1 實(shí)驗(yàn)操作流程

實(shí)驗(yàn)操作流程如圖1、圖2所示。具體實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

1）乙基化反應(yīng)

在氣泡瓶中準(zhǔn)確加入定量樣品，并添加超純水稀釋到50mL左右，加入200μL緩沖溶液（HAc-NaAc），隨后迅速加入100μL乙基化反應(yīng)試劑（NaBEt4），迅速蓋上氣泡瓶瓶蓋，搖勻后放置15min讓其充分反應(yīng)。經(jīng)乙基化后反應(yīng)產(chǎn)物為易揮發(fā)的甲基乙基汞（甲基汞和NaBEt4反應(yīng)生成）和二乙基汞（Hg2+和NaBEt4反應(yīng)生成）。

2）Tenax管富集有機(jī)汞

水相乙基反應(yīng)完成后，通高純氮?dú)?，?00～300mL/min的速度吹脫15min，使氣泡瓶中的乙基化產(chǎn)物富集在Tenax上（見(jiàn)圖1）。

圖1 乙基化反應(yīng)和Tenax富集裝置

3）GC-CVAFS檢測(cè)

以50mL/min的氬氣為載氣通過(guò)Tenax管并連接到氣象色譜儀上，再將Tenax在20s內(nèi)迅速升溫到80～120℃，使各種形態(tài)的汞釋放后隨著載氣進(jìn)入到色譜柱（GC）中，由于分離系數(shù)不同的，甲基乙基汞和二乙基汞通過(guò)700～900℃的石英沙管，分解成單質(zhì)汞進(jìn)入到冷原子熒光檢測(cè)儀中（見(jiàn)圖2）。出峰包含3個(gè)峰，依次代表：Hg0、甲基汞和Hg2+。甲基汞標(biāo)準(zhǔn)和大米樣品色譜圖如圖3所示。

圖2 GC-CVAFS分離測(cè)定流程示意圖

圖3 甲基汞標(biāo)準(zhǔn)和大米樣品色譜圖

1.3.2 樣品濃度計(jì)算

分析樣品中的甲基汞含量以峰面積計(jì)算，公式如下：

式中：As——分析樣品甲基汞峰面積；

Ab——空白甲基汞峰面積；

SF——標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率（見(jiàn)圖4）；

m0——稱取樣品的質(zhì)量，g；

V0——樣品定容體積；

圖4 甲基汞的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

V1——加入到氣泡瓶中樣品體積，L；

m1——CH2Cl2初始加入量，g；

m2——萃取后轉(zhuǎn)移出來(lái)剩余CH2Cl2量，g。

式（1）用來(lái)計(jì)算經(jīng)過(guò)萃取和反萃取樣品的濃度（大米和Tort-2），式（2）用來(lái)計(jì)算直接測(cè)定樣品的濃度（魚(yú)、頭發(fā)、血液和Tort-2）。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)參數(shù)優(yōu)化

在加入CH2Cl2后振蕩時(shí)，要使振蕩器的振蕩方向與離心管長(zhǎng)度方向保持一致，且強(qiáng)度要大，保證消解液和CH2Cl2充分混合[10]。定容后加樣體積根據(jù)生物樣品甲基汞含量確定，無(wú)污染地區(qū)的大米、淡水魚(yú)加20mL足以檢測(cè)出，如海魚(yú)和一些污染地區(qū)的樣品，則加樣量應(yīng)相應(yīng)減少。氮?dú)獯得摃r(shí)間達(dá)到15min，流速達(dá)到250mL/min時(shí)，水相中甲基汞可以全部被吹脫富集到Tenax管上；若吹脫速度加大，會(huì)降低Tenax的捕捉效率，速度降低，則需要加長(zhǎng)氮?dú)獾拇得摃r(shí)間，所以流量一般設(shè)在250mL/min左右。實(shí)驗(yàn)還表明，GC溫高，載氣速度快，出峰速度就越快，但可能造成峰分離不開(kāi)；反之，則分離好，但可能造成峰型拖尾，出峰速度慢，所以需根據(jù)峰的分離情況調(diào)節(jié)柱溫和氣流速度。

研究表明，1mL 250g/L KOH甲醇溶液可以完全釋放0.25g干重生物樣品中的甲基汞[11]。本實(shí)驗(yàn)中魚(yú)樣甲基汞含量較高，不需進(jìn)行有機(jī)提取就可直接測(cè)定，如果含量較低的生物樣品，需萃取后才能測(cè)定，避免基質(zhì)的干擾。研究還表明在乙基化反應(yīng)過(guò)程中，pH在1～2左右，且二氯甲烷和氫氧化鉀/甲醇消解液體積比為3∶1時(shí)，經(jīng)萃取和反萃取后的甲基汞回收率接近100%[11]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用1.0μL/mL甲基汞標(biāo)準(zhǔn)溶液配制1 ng/L的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0，50，100，150，200μL于氣泡瓶，按照樣品測(cè)定的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理。以汞的絕對(duì)量（pg）為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的積分面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖4所示。該測(cè)定系統(tǒng)的絕對(duì)最低檢測(cè)限為0.60pg，如稱0.50g樣品，將富集到水相的樣品全部加入到反應(yīng)瓶中按上述步驟測(cè)定，則該方法的檢出限為0.0012ng/g。

2.3 方法的精密度和準(zhǔn)確度

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品測(cè)定值結(jié)果見(jiàn)表1，所有平行樣品測(cè)定5次，空白值均低于檢測(cè)限。萃取測(cè)定的Tort-2樣品標(biāo)準(zhǔn)平均回收率為95%，精密度為5.8%。堿消解后直接測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品Tort-2平均回收率為97%，精密度為5.0%。

表1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品測(cè)定值

同時(shí)對(duì)已知甲基汞含量的大米和魚(yú)樣品加入已知量的甲基汞汞標(biāo)，按照消解和萃取的實(shí)驗(yàn)操作步驟分別對(duì)大米樣品和魚(yú)樣品做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，4組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，加標(biāo)回收率在94%～110%，平均回收率為101%。以上標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果表明，此方法準(zhǔn)確可行。

2.4 大米和魚(yú)樣品的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)樣品中的魚(yú)樣和大米樣品采自超市（n=6），大米來(lái)自6個(gè)品牌，魚(yú)的種類(lèi)包括鯽魚(yú)、草魚(yú)、大黃魚(yú)和沙帶魚(yú)。大米中甲基汞含量范圍為0.11～2.3ng/g，平均值為2.1ng/g；魚(yú)體中甲基汞的測(cè)定顯示其含量范圍在5.8～70ng/g之間，平均含量為51 ng/g。部分大米和魚(yú)樣品平行測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 大米和魚(yú)樣品中甲基汞加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)測(cè)定結(jié)果

表3 大米和魚(yú)樣品中甲基汞的含量

3 結(jié)束語(yǔ)

隨著人們對(duì)環(huán)境樣品中甲基汞含量檢測(cè)限和準(zhǔn)確性要求的提高，高效、準(zhǔn)確地測(cè)定甲基汞顯得尤為重要。本文采用堿消解、二氯甲烷萃取、水相乙基化、最后通過(guò)氣相色譜-冷原子熒光（GC-CVAFS）法來(lái)檢測(cè)大米和魚(yú)樣中的痕量甲基汞。該方法具有對(duì)樣品的選擇性小、步驟簡(jiǎn)潔、快速和絕對(duì)檢測(cè)限低、精密度高等優(yōu)點(diǎn)，能滿足對(duì)環(huán)境中甲基汞檢測(cè)快速、準(zhǔn)確的要求。

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Determ ination of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapor atom ic fluorescence spectrometry and solvent extraction-aqueous phase ethylation

LIU Peiming
（The Guangxi Zhuang Autonomous Region Center for Disease Control and prevention in Hepu County，Hepu 536100，China）

This paper stablished a determination method of methylmercury in rice and fish by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence（GC-CVAFS）with solvent extraction after aqueous phase ethylation.An alkaline digestion and an organic solvent（CH2Cl2）extraction technique were developed to extract the methylmercury in rice and fish.The extracted methylmercury samples were then pre-concentrated for aqueous phase ethylation.The last step was to determine the samples by gas chromatography-cold vapour atomic fluorescence.The experimental results have shows:the absolute detection limit is 0.001 2 ng/g；the average recovery of standard materials of extraction and nonextraction are 95%and 97%，respectively；and the relative standard deviation（RSD）is less than 5.8%.Thismethod can be also used to extract trace amounts ofmethylmercury contents in enviroment.

rice；fish；methylmercury；gas chromatographic-cold vapor atomic fluorescence spectrometric method

A文章編號(hào)：1674-5124（2015）06-0056-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2015.06.013

0 引言

汞是一種高毒性污染物，能通過(guò)大氣長(zhǎng)距離遷移造成全球性的污染，被我國(guó)列為優(yōu)先污染物。自然界中的汞以有無(wú)機(jī)態(tài)和有機(jī)態(tài)儲(chǔ)存在生物圈的各介質(zhì)中。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于測(cè)定生物樣品中甲基汞的方法較多，有苯萃取-氣相色譜電子捕獲法[1-2]、液相色譜-原子熒光法（HPLC-AFS）[3]、萃取-液相色譜法[4]、甲苯萃取-原子熒光法（AFS）[5]、氣相色譜-原子吸收法（GC-AAS）[6-8]等。這些方法存在靈敏度低、精密度差、取樣量大、對(duì)樣品的要求較高，樣品前處理過(guò)程較繁瑣或所用試劑對(duì)人體健康有潛在危害等問(wèn)題，很難準(zhǔn)確快速地測(cè)定出環(huán)境生物樣品中的痕量甲基汞，所以，國(guó)外多采用萃取結(jié)合乙基化法，此方法精密度高。本文旨在簡(jiǎn)化和優(yōu)化國(guó)內(nèi)對(duì)植物和生物樣品中的甲基汞測(cè)定方法。

2014-11-28；

2015-01-09

劉沛明（1974-），男，主管技師，主要從事衛(wèi)生檢驗(yàn)工作。