外源性高糖對(duì)脾切除小鼠血糖的影響及其機(jī)制探討

劉慧穎，任衛(wèi)東，朱曉波

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北張家口075000；2.河北北方學(xué)院病原生物研究所，河北張家口075000）

·論著·

外源性高糖對(duì)脾切除小鼠血糖的影響及其機(jī)制探討

劉慧穎1，任衛(wèi)東1，朱曉波2

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北張家口075000；2.河北北方學(xué)院病原生物研究所，河北張家口075000）

目的探討持續(xù)外源性葡萄糖干預(yù)是否影響胰島β細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，以及脾臟是否也參與該過(guò)程。方法外科手術(shù)切除小鼠全脾。將實(shí)驗(yàn)小鼠分為8組，分別以不含葡萄糖的純水及10％、15％和20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)正常（4組）和脾切除小鼠（4組）3周。測(cè)定小鼠空腹血糖和胰島素水平，計(jì)算各組小鼠高血糖發(fā)生率；進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)、胰島組織免疫組織化學(xué)雙染色、胰腺組織活性氧簇（ROS）測(cè)定及胰島β細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體-2（GLUT-2）表達(dá)分析。結(jié)果20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組小鼠出現(xiàn)高血糖，發(fā)生率分別為60％和75％；所有高血糖小鼠胰島素釋放能力降低，出現(xiàn)胰島β細(xì)胞凋亡。脾切除組高血糖小鼠，胰島β細(xì)胞ROS水平升高，GLUT-2表達(dá)水平降低更加顯著。結(jié)論脾臟參與外源性高糖對(duì)胰島內(nèi)分泌功能損傷的保護(hù)作用涉及胰島β細(xì)胞ROS和GLUT-2表達(dá)水平的改變。

葡萄糖；脾切除；小鼠；胰島β細(xì)胞；凋亡

葡萄糖是機(jī)體的碳源和能源物質(zhì)，在物質(zhì)代謝中發(fā)揮重要作用。血液中正常的葡萄糖濃度對(duì)維持機(jī)體的能量供給及胰島β細(xì)胞的胰島素分泌至關(guān)重要。胰島素相對(duì)或絕對(duì)缺乏所致糖尿病的典型癥狀是機(jī)體糖代謝紊亂，血中葡萄糖水平異常升高。糖尿病狀態(tài)下的持續(xù)高水平葡萄糖對(duì)許多組織產(chǎn)生毒性作用，即糖毒性。對(duì)胰島β細(xì)胞的毒性作用抑制其正常分泌；對(duì)肝臟、脂肪、肌肉等組織的作用導(dǎo)致這些組織的胰島素抵抗，相關(guān)領(lǐng)域已有廣泛研究[1-3]。在正常機(jī)體，血糖受神經(jīng)、內(nèi)分泌和肝臟的嚴(yán)格調(diào)控，維持在一個(gè)狹窄的生理范圍內(nèi)。胰島是調(diào)節(jié)血糖穩(wěn)定的重要內(nèi)分泌組織。血糖增高時(shí)，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素，維持血糖的穩(wěn)定。盡管機(jī)體對(duì)血糖存在精細(xì)的調(diào)控機(jī)制，但是外源性葡萄糖的持續(xù)應(yīng)用仍然可以引起正常機(jī)體的糖代謝紊亂。2002年加拿大蒙特利爾大學(xué)MIDAOUI等[4]觀察到，給Sprague Dawley大鼠10％葡萄糖飲水3周能引起大鼠血糖的輕微升高、胰島素受體抵抗和高血壓。臨床研究發(fā)現(xiàn)，靜脈輸注10％葡萄糖可以引起新生兒高血糖[5]。外源性葡萄糖攝入是否影響胰島內(nèi)分泌功能未見(jiàn)報(bào)道。

已有臨床資料和實(shí)驗(yàn)研究顯示，脾臟與胰島內(nèi)分泌功能關(guān)系密切[6-7]。本實(shí)驗(yàn)的前期研究表明，完全脾切除導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)小鼠糖耐量異常[8]，增加部分胰腺切除后的糖尿病發(fā)生率[9]，增加實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)鏈尿佐菌素的敏感性，使不足以誘導(dǎo)糖尿病劑量的鏈尿佐菌素能夠誘導(dǎo)小鼠糖尿病[10]。本研究中，筆者探討持續(xù)外源性葡萄糖干預(yù)是否影響胰島β細(xì)胞的內(nèi)分泌功能，以及脾臟是否也參與該過(guò)程。同時(shí)通過(guò)分析小鼠胰島β細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變以及細(xì)胞內(nèi)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）濃度和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體2（glucose transporter-2，GLUT-2）的表達(dá)，探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康4周齡雄性昆明小鼠，體重（20±2）g，由首都醫(yī)科大學(xué)提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京2014-0004）。

1.1.2 主要試劑和藥物葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)自中生北控生物科技股份有限公司，胰島素測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司，ROS化學(xué)熒光法測(cè)試盒、蛋白定量考馬斯亮藍(lán)法測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，總蛋白提取試劑盒購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司，細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物有限公司，免疫組織化學(xué)染色試劑盒、二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色試劑盒、兔抗鼠一抗、兔抗鼠葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2抗體、山羊抗兔IgG-辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）多聚體二抗、兔抗β-Actin抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，預(yù)染低分子量蛋白質(zhì)Marker（14.4～97.4 kD）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2方法

1.2.1 脾切除小鼠模型的制備適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，實(shí)驗(yàn)小鼠按YIN等[11]的方法進(jìn)行完全脾切除，即實(shí)驗(yàn)小鼠以1％戊巴比妥按45 mg/kg腹腔注射麻醉、備皮，常規(guī)消毒、開(kāi)腹，結(jié)扎脾動(dòng)脈和靜脈，剝離脾臟，將脾臟切除，縫合皮膚，作為完全脾切除小鼠模型。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組脾切除2 d后，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為8組，每組20只，分別為不添加葡萄糖的單純飲水喂養(yǎng)的正常對(duì)照組和脾切除對(duì)照組；10％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組；15％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組；20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組。各實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)3周，期間自由飲水，自由進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。3周后去除葡萄糖喂養(yǎng)72 h，進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)分析。

1.2.3 觀察指標(biāo)①空腹血糖和胰島素：各實(shí)驗(yàn)組小鼠空腹8 h后，用毛細(xì)玻璃管在眼球后內(nèi)眥靜脈叢采血，1 088×g/min離心5 min制備血清，測(cè)定血糖或置于-80℃冰箱冷凍保存。血糖測(cè)定按照葡萄糖氧化酶法試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，20μl血清加3 ml酶酚混合試劑，37℃保溫15 min，以722分光光度計(jì)在505 nm測(cè)定吸光度，按公式計(jì)算血糖濃度。胰島素測(cè)定按照小鼠胰島素酶聯(lián)免疫分析試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。分為空白孔和標(biāo)準(zhǔn)孔。樣品孔加樣50 ul，37℃溫育30 min，洗滌拍干后加入酶標(biāo)液50 ul，空白孔37℃溫育30 min，洗滌拍干。每孔加入顯色劑A、B各50 ul，37℃避光顯色10 min，每孔加終止液50 ul，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度。②胰島素釋放試驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)小鼠空腹8 h后腹腔注射50％葡萄糖（2.0 g/kg，注射后0、30、60和120 min采血，1088×g/min離心5min制備血清，置于-80℃冰箱冷凍保存，用于胰島素測(cè)定。③胰腺組織ROS測(cè)定：1％戊巴比妥45 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，立即完整取出胰腺組織，稱(chēng)重，按照重量（g）∶體積（ml）=1∶20的比例加入勻漿介質(zhì)（100 mmol/L磷酸緩沖液），冰水浴條件下機(jī)械勻漿，1 000 g離心10 min，部分上清液按活性氧測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定活性氧熒光強(qiáng)度，即在190μl勻漿上清液加入1 mmol/L熒光探針10μl。對(duì)照孔加入10μl磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffer saline，PBS），充分混勻，37℃孵育30 min，熒光分光光度計(jì)以535 nm波長(zhǎng)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。部分上清用考馬斯亮蘭蛋白定量試劑盒測(cè)量蛋白含量，0.05 ml樣品加3 ml考馬斯亮藍(lán)顯色液，靜置10 min后以722分光光度儀在595 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算蛋白質(zhì)含量，結(jié)果以熒光強(qiáng)度/毫克蛋白表示。④免疫組織化學(xué)法染色胰島β細(xì)胞和凋亡細(xì)胞：1％戊巴比妥45 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠。迅速分離完整的胰腺組織，10％Bouin氏液固定24 h，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，將標(biāo)本切成4μm厚切片。切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化，0.3％雙氧水H2O2處理后進(jìn)行細(xì)胞凋亡及胰島β細(xì)胞免疫組織化學(xué)法雙染色。加入1∶100稀釋的生物素化地高辛抗體，37℃孵育30 min，加入1∶100稀釋鏈霉親和素-生物素復(fù)合物（strept avidin-biotin complex，SABC），37℃孵育30 min，加入1∶200稀釋的兔抗胰島素抗體，4℃過(guò)夜，滴加辣根酶標(biāo)記的二抗，3 min×3次，DAB顯色，水溶性封片膠封片，日本Nikon Eclipse Ti顯微鏡系統(tǒng)鏡下檢測(cè)拍照。⑤Western blot檢測(cè)GLUT-2的表達(dá)：實(shí)驗(yàn)小鼠頸椎錯(cuò)位法處死，立即分離出完整胰腺組織。按蛋白質(zhì)提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作提取樣本蛋白。稱(chēng)取胰腺組織各50 mg，剪碎后分別加入500μl細(xì)胞裂解液，高速機(jī)械勻漿器12 000 r/min破碎組織，4℃、10 000×g/min離心10 min，收集上清液作為蛋白質(zhì)樣本。樣品進(jìn)一步Western blot檢測(cè)，即以12.5％分離膠（pH=8.8）、5％濃縮膠（pH=6.8）進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝膠電泳，60 V、1.5 h濕法轉(zhuǎn)膜。兔bs-10378R多克隆抗體（1∶500）作為一抗，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）作為二抗，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色，利用一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行灰度分析，通過(guò)與相應(yīng)β-actin條帶密度進(jìn)行比較，計(jì)算出每個(gè)條帶密度的相對(duì)值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本比較用t檢驗(yàn)，多組比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組小鼠空腹血糖異常發(fā)生率和血糖濃度改變

實(shí)驗(yàn)第3周去除葡萄糖干預(yù)后，分析各組小鼠空腹血糖。血糖濃度＞7.2 mmol/L為血糖異常。不添加葡萄糖純水喂養(yǎng)的正常對(duì)照組、脾切除對(duì)照組以及10％和15％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組、脾切除組未發(fā)現(xiàn)血糖異常小鼠，血糖濃度在正常范圍，各組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組空腹血糖異常的發(fā)生率分別為60％和75％，兩組小鼠空腹血糖濃度分別為（7.78±2.19）和（10.05±4.15）mmol/L，兩組空腹血糖比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2各組小鼠空腹血清胰島素濃度變化

空腹胰島素檢測(cè)結(jié)果表明，只有20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組高血糖小鼠空腹血清胰島素水平發(fā)生改變，分別為（18.32±6.38）和（17.54±5.42）mIU/ml，兩組空腹胰島素比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠不同葡萄糖飲水濃度的空腹血糖比較（n=20，mmol/L±s）

表1 各組小鼠不同葡萄糖飲水濃度的空腹血糖比較（n=20，mmol/L±s）

注：1）與正常對(duì)照組比較（0％葡萄糖），t=8.043，P=0.011；2）與脾切除對(duì)照組（0％葡萄糖）比較，t=18.202，P=0.024

組別0％10％15％20％正常小鼠5.28±0.865.61±0.625.42±0.327.78±2.191）脾切除小鼠6.02±0.935.61±0.245.61±0.4510.05±4.152）t值2.6130.6841.9119.490P值0.1040.5910.0620.009

表2 各組小鼠不同葡萄糖飲水濃度的空腹胰島素比較（n=20，mIU/ml±s）

表2 各組小鼠不同葡萄糖飲水濃度的空腹胰島素比較（n=20，mIU/ml±s）

組別0％10％15％20％正常小鼠19.68±7.9718.97±6.7819.34±7.3418.32±6.38脾切除小鼠19.16±2.8520.12±3.2318.96±4.1217.54±5.42t值0.2720.3031.0031.431P值0.8100.8930.4010.284

2.3正常和20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)小鼠的胰島素釋放試驗(yàn)

葡萄糖飲水喂養(yǎng)3周后進(jìn)行胰島素釋放試驗(yàn)以確定小鼠的高血糖是否與胰島素分泌功能異常相關(guān)。0、30、60和120 min正常對(duì)照組胰島素水平分別為（19.68±2.08）、（33.97±3.13）、（28.78±2.29）和（21.48±2.10）mIU/ml，0、30、60和120min脾切除對(duì)照組胰島素水平分別為（19.16±2.83）、（35.24±1.85）、（27.63±1.27）和（20.72±1.81）mIU/ml，各時(shí)間胰島素水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 min時(shí)，20％葡萄糖喂養(yǎng)的正常組小鼠胰島素水平為（26.94±2.44）mIU/ml，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.660，P=0.018）；60 min時(shí)，20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組小鼠胰島素水平為（22.45±2.05）mIU/ml，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.104，P=0.049）。30 min時(shí)，20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的脾切除組小鼠胰島素水平為（24.40±1.13）mIU/ml，與脾切除對(duì)照組小鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.941，P=0.012）；60 min時(shí)，20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的脾切除組小鼠胰島素水平為（19.37±1.25）mIU/ml與脾切除對(duì)照組小鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.124，P=0.010）。20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組與脾切除組小鼠各時(shí)間的胰島素水平比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖1。

2.4胰島β細(xì)胞凋亡

對(duì)正常對(duì)照組、脾切除對(duì)照組、20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組和脾切除組小鼠進(jìn)行免疫組織化學(xué)法雙染色，確定胰島素釋放異常是否與β細(xì)胞凋亡相關(guān)。20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組與脾切除組小鼠胰島（棕色）中可見(jiàn)凋亡細(xì)胞（核染色為深色）。同時(shí)也觀察到20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的脾切除組小鼠胰島細(xì)胞損傷更明顯。見(jiàn)圖2。

2.5正常和20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的小鼠胰腺組織ROS水平

葡萄糖喂養(yǎng)增加小鼠胰腺組織ROS水平。20％葡萄糖喂養(yǎng)的正常組和脾切除組小鼠的胰腺組織ROS水平顯著升高，分別為（4.91±0.52）和（6.68±0.48）cd/mg，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.354，P=0.004）。20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的正常組與正常對(duì)照組[（3.21±0.56）cd/mg]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.161，P=0.006）；20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的脾切除組與脾切除對(duì)照組[（3.38±0.47）cd/mg]比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.972，P=0.002）。見(jiàn)圖3。

2.6正常和20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的小鼠胰島細(xì)胞GLUT-2的表達(dá)

Western blot檢測(cè)以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。20％葡萄糖喂養(yǎng)的正常組和脾切除組小鼠GLUT-2表達(dá)降低，分別為（3.02±0.27）和（2.63±0.29）。20％葡萄糖喂養(yǎng)的正常組與正常對(duì)照組小鼠GLUT-2表達(dá)水平（3.87±0.32）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.174，P=0.004）；20％葡萄糖喂養(yǎng)的脾切除組與對(duì)照組小鼠GLUT-2表達(dá)水平（3.96±0.33）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.651，P=0.003），見(jiàn)圖4。

圖1 正常及20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)小鼠胰島素釋放試驗(yàn)

圖2 胰島組織的免疫組織化學(xué)法雙染色（×10）

圖3 化學(xué)發(fā)光法測(cè)定的正常和高血糖小鼠胰腺ROS水平

圖4 Western blot測(cè)定正常和20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)的小鼠胰島β細(xì)胞GLUT-2的表達(dá)

3 討論

體內(nèi)外一系列研究表明，機(jī)體高濃度葡萄糖有毒性作用。在本研究中，20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)3周可以導(dǎo)致正常及脾切除小鼠高血糖，而10％和15％葡萄糖飲水則不引起實(shí)驗(yàn)小鼠血糖異常改變，這與MIDAOUI等[4]的研究結(jié)果不一致。MIDAOUI給予SD大鼠10％葡萄糖飲水3周，導(dǎo)致血糖升高，但發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

以往及本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，脾臟對(duì)胰島內(nèi)分泌有保護(hù)作用[6-7]。在本研究中，葡萄糖飲水引起完全脾切除小鼠血糖明顯升高，提示外源性葡萄糖干預(yù)引起的小鼠高血糖涉及胰島內(nèi)分泌功能的損傷，也提示脾臟對(duì)外源性葡萄糖所致的小鼠糖代謝紊亂具有一定的保護(hù)作用。

為確定外源性葡萄糖干預(yù)引起的小鼠高血糖是否與胰島內(nèi)分泌相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行小鼠胰島素釋放試驗(yàn)。葡萄糖干預(yù)使高血糖小鼠胰島素釋放顯著降低，表明外源性葡萄糖持續(xù)作用造成的小鼠高血糖涉及胰島內(nèi)分泌功能的降低。而脾切除小鼠胰島素分泌功能更顯著的降低表明脾切除可增加外源性葡萄糖的作用。進(jìn)一步對(duì)胰腺組織進(jìn)行的免疫組織化學(xué)法雙染色分析顯示，實(shí)驗(yàn)小鼠的胰島組織有凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，提示胰島內(nèi)分泌功能的下降與β胰島凋亡相關(guān)。本研究中，外源性葡萄糖對(duì)胰島β細(xì)胞損傷與糖尿病狀態(tài)下高濃度葡萄糖在體內(nèi)的毒性作用一致，也誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞凋亡。目前，關(guān)于糖尿病狀態(tài)下葡萄糖在體內(nèi)毒性作用的大量研究表明，其作用機(jī)制涉及對(duì)胰島β細(xì)胞內(nèi)分泌功能的毒性、胰島β細(xì)胞凋亡及引起胰島素受體的抵抗[12-13]。本研究中，外源性葡萄糖誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡與葡萄糖干預(yù)下的ROS過(guò)量產(chǎn)生相關(guān)，ROS是胰島β細(xì)胞損傷的重要機(jī)制，過(guò)量ROS可以氧化線粒體膜磷脂，損害細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)胞色素c釋放，引起胰島β細(xì)胞凋亡[14]。

本研究未探討β細(xì)胞分泌胰島素的合成、儲(chǔ)存是否異常，也未進(jìn)行與胰島素分泌相關(guān)基因的分析，但是Western blot檢測(cè)顯示，外源性葡萄糖干預(yù)引起GLUT-2的表達(dá)降低。GLUT-2是胰島β細(xì)胞膜上的血糖感受器，通過(guò)調(diào)控葡萄糖誘導(dǎo)的胰島素分泌，可以有效調(diào)節(jié)血糖濃度[15]。有研究指出，GLUT-2的表達(dá)降低，使血糖葡萄糖主動(dòng)轉(zhuǎn)入β細(xì)胞受阻，β細(xì)胞胰島素分泌功能降低[16]。本研究中，外源性葡萄糖誘導(dǎo)的高血糖小鼠也有ROS的顯著增加，芝加哥大學(xué)的WANG等[17]指出，過(guò)量ROS產(chǎn)生與胰島素基因表達(dá)降低、胰島素分泌異常密切相關(guān)。基于GLUT-2和ROS的分析，筆者認(rèn)為外源性葡萄糖干預(yù)也損害細(xì)胞的胰島素分泌過(guò)程。本研究未探討外源性葡萄糖干預(yù)是否引起胰島素受體抵抗。實(shí)驗(yàn)小鼠發(fā)生高血糖是否與胰島素抵抗有關(guān)，有待進(jìn)一步研究。

本研究進(jìn)行的各項(xiàng)分析顯示，完全脾臟切除加重外源性葡萄糖引起的小鼠糖代謝紊亂及對(duì)β細(xì)胞的損傷程度，表明脾臟對(duì)外源性葡萄糖的β細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制不明。該作用是有限的，并不能完全阻止外源性葡萄糖引起小鼠的糖代謝紊亂。盡管如此，本研究也為糖尿病的制病機(jī)制提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論基礎(chǔ)，為合理應(yīng)用葡萄糖，特別是脾切除患者合理應(yīng)用葡萄糖提供理論依據(jù)。

綜上所述，20％葡萄糖飲水喂養(yǎng)3周可以引起小鼠發(fā)生高血糖。葡萄糖通過(guò)增加胰腺組織ROS水平和降低β細(xì)胞GLUT-2表達(dá)引起胰島β細(xì)胞的凋亡，胰島素分泌能力的低下。脾臟對(duì)葡萄糖干預(yù)引起的胰島內(nèi)分泌功能降低具有一定的保護(hù)作用。

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（申海菊 編輯）

Effect of exogenous high glucose on blood glucose of splenectomy mice and its mechanism

Hui-ying LIU1,Wei-dong REN1,Xiao-bo ZHU2
(1.Department of Endocrinology,the First Affiliated Hospital,2.Institute of Pathogen Biology,North University of Hebei,Zhangjiakou,Hebei 075000,P.R.China)

【Objective】To explore the impact of exogenous glucose intervention on the endocrine function of islet β cells and the possible participation of the spleen in this process.【Methods】Splenectomy was performed in mice.The mice were divided into 8 groups including 4 normal groups and 4 splenectomy groups,which were fed with glucose-free water,10％,15％or 20％glucose drinking water respectively for 3 weeks.Fasting plasma glucose and insulin levels were determined in the mice.The incidence of hyperglycemia of each group was calculated.Insulin release test,double immunohistochemical staining of the islet tissue,analyses of reactive oxygen species(ROS)in pancreatic tissue and glucose transporter-2(GLUT-2)expression in β cells were conducted.【Results】Hyperglycemia was induced in the normal and splenectomy mice fed with 20％glucose drinking solution;the incidence was 60％and 75％respectively.The insulin release capacity significantly reduced and apoptosis of the islet β cells occurred in all the hyperglycemic mice.ROS level in the pancreas tissue and the level of GLUT-2 expression changed more significantly in the hyperglycemic mice with splenectomy.【Conclusions】The spleen is involved in protection of the islet endocrine function from damage caused by exogenous glucose intervention.This process relates to increased ROS level and decreased GLUT-2 expression in the islet β cells.

glucose;splenectomy;mouse;islet β cell;apoptosis

R335.6

A

1005-8982（2015）35-0027-06

2015-05-15

朱曉波，E-mail：zjkzxb@sohu.com；Tel：0313-4029270