吡那地爾對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用及對Bcl-2和Caspase3表達(dá)的影響

袁晶晶,鄭輯英,李光來,薛村水,薛國芳,張曉敏

吡那地爾對癲癇持續(xù)狀態(tài)大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用及對Bcl-2和Caspase3表達(dá)的影響

袁晶晶1,鄭輯英2,李光來2,薛村水2,薛國芳2,張曉敏2

目的研究吡那地爾對癲癇持續(xù)狀態(tài)(SE)大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法隨機(jī)將96只大鼠分成N組、SE組、Pin組、Gli組,每組按SE后12 h、24 h、72 h、5 d分為4亞組,用LiCl-PILO法進(jìn)行SE動物造模,采用SABC檢測Bcl-2、Caspase-3,TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞。結(jié)果N組TUNEL陽性細(xì)胞、Bcl-2及Caspase-3均有基礎(chǔ)表達(dá)。SE組、Pin組、Gli組TUNEL陽性細(xì)胞均在72 h達(dá)峰值、Caspase-3均在24 h達(dá)峰值。同時(shí)間點(diǎn)比較,SE組、Pin組、Gli組較N組均明顯增多(P<0.05); Pin組較SE組、Gli組均明顯減少(P<0.05);SE組與Gli組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。SE組、Pin組、Gli組Bcl-2均在12 h達(dá)高峰。同時(shí)間點(diǎn)比較,SE組、Pin組、Gli組較N組均明顯增多(P<0.05);Pin組較SE、Gli組均明顯減低(P<0.05);SE組與Gli組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論吡那地爾可上調(diào)Bcl-2表達(dá),抑制Caspase-3釋放,對SE大鼠有腦保護(hù)作用,格列吡嗪拮抗吡那地爾此作用。

癲癇持續(xù)狀態(tài);吡那地爾;Bcl-2;Caspase-3

癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus,SE)為神經(jīng)科常見急癥之一,指癲癇連續(xù)發(fā)作間意識未完全恢復(fù)又頻繁發(fā)作,或發(fā)作時(shí)間持續(xù)30 min以上不能自行停止。反復(fù)癲癇發(fā)作或SE會造成腦損傷[1,2],凋亡在這種腦損傷中起重要作用[3,4]。近年來,ATP敏感性鉀通道(ATP sensitive K+channels,KATP)開放劑對癲癇的腦保護(hù)作用成為研究熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)通過吡那地爾(pinacidil)及格列吡嗪(glipizide)干預(yù)SE大鼠,觀察TUNEL陽性細(xì)胞、Bcl-2及Caspase-3指標(biāo),探討pinacidil對SE大鼠海馬神經(jīng)元保護(hù)作用,為臨床治療癲癇提供理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 材料 雄性健康Wistar大鼠96只(體重190g～250g、鼠齡3個(gè)月～4個(gè)月)由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供;氯化鋰(LiCl)由中國醫(yī)藥集團(tuán)公司提供;匹羅卡品(PILO)、吡那地爾、格列吡嗪由美國Sigma公司提供;TUNEL、SABC試劑盒、Bcl-2及Caspase-3抗體、DAB顯色劑由武漢博士德試劑公司提供;余試劑均為市售分析純品。

1.2 動物造模及分組 隨機(jī)將96只大鼠分成對照組(N組)、癲癇組(SE組)、吡那地爾組(Pin組)、格列吡嗪組(Gli組),每組按SE后12 h、24 h、72 h、5 d分為4個(gè)亞組,每組6只大鼠。所有大鼠腹腔注射LiCl 125 mg/kg,SE組大鼠20 h后腹腔注射PILO 30 mg/kg; Pin組于注射PILO前30 min腹腔注射吡那地爾(10 nmol/5μL)10μL;Gli組于注射PILO前50 min腹腔注射格列吡嗪(1μmol/5μL)10μL,隔20 min后予吡那地爾(10 nmol/5μL)10μL腹腔注射;N組、SE組、Pin組于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)腹腔注射等量生理鹽水。觀察大鼠行為變化,依據(jù)Racine評分標(biāo)準(zhǔn)判定癲癇發(fā)作級別,達(dá)Ⅳ級～Ⅴ級發(fā)作歸于實(shí)驗(yàn)組,不符合模型或死亡者應(yīng)剔除并補(bǔ)充相應(yīng)數(shù)目大鼠保證樣本量。癲癇發(fā)作持續(xù)30 min以上者為SE發(fā)作,SE達(dá)1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg終止發(fā)作。

1.3 標(biāo)本處理 實(shí)驗(yàn)組大鼠用10%水合氯醛(100 mg/kg)深度麻醉,斷頭取出腦組織置于4%多聚甲醛液中固定,經(jīng)脫水、透明、浸蠟及包埋后,在視交叉后海馬區(qū)連續(xù)冠狀切片(厚約5μm),隔15張連續(xù)取4張片,做4套分別行HE染色及三項(xiàng)指標(biāo)檢測。

1.4 凋亡細(xì)胞檢測 按TUNEL試劑盒說明書操作,觀察到凋亡細(xì)胞的胞核中含棕黃色顆粒物。

1.5 Bcl-2、Caspase-3檢測 按試劑盒操作,用SABC法(鏈酶親和素-生物素過氧化酶連接法)、DAB染色,胞漿或者核膜著色呈現(xiàn)棕黃色為Bcl-2陽性細(xì)胞;胞漿或胞核內(nèi)含有棕黃色沉淀物為Caspase-3陽性細(xì)胞。

1.6 結(jié)果處理 平均每張切片取5個(gè)視野,算出每個(gè)視野的Bcl-2、Caspase-3、TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)并計(jì)算其平均數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件行析因方差分析,P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 SE大鼠行為學(xué)觀察 除N組無癲癇發(fā)作外,其他實(shí)驗(yàn)組大鼠在腹腔注射PILO 15 min～30 min后均出現(xiàn)咀嚼、流涎、節(jié)律點(diǎn)頭等動作,之后出現(xiàn)單側(cè)前肢抽搐、陣攣、直立到雙側(cè)前肢抽搐、陣攣、身體立起,最后出現(xiàn)強(qiáng)直-陣攣全面發(fā)作,后跌倒,SE發(fā)作程度達(dá)Ⅳ級～Ⅴ級,Pin組較SE組發(fā)作程度輕,多在Ⅲ級～Ⅳ級,Gli組與SE組程度基本一致。

2.2 HE染色結(jié)果 N組神經(jīng)元基本緊密排列,胞核為卵圓形、圓形,染色質(zhì)分布均勻、胞漿透明,核仁清晰;SE組、Gli組細(xì)胞排列紊亂,胞漿紅染、嗜酸性,胞體縮小,核固縮;Pin組細(xì)胞尚排列整齊,形態(tài)尚正常,偶有嗜酸性染色細(xì)胞。

2.3 TUNEL陽性細(xì)胞檢測 觀察大鼠海馬CA1及CA3區(qū),N組少量TUNEL陽性細(xì)胞,SE組、Pin組、Gli組均在12 h出現(xiàn)TUNEL陽性細(xì)胞,24 h逐漸增多,72 h達(dá)峰值,持續(xù)至5 d。同時(shí)間點(diǎn)比較,SE組、Pin組、Gli組較N組明顯增多(P<0.05);Pin組較SE組和Gli組明顯減少(P<0.05);SE組與Gli組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

表1 各組TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

組別12 h24 h72 h5 d N組4.33±0.544.28±0.534.20±0.704.11±0.55 SE組19.20±0.521)39.40±0.941)66.73±1.561)61.27±1.721)Pin組 9.58±0.881)2)3)20.80±1.661)2)3)31.87±0.991)2)3)28.22±0.881)2)3)Gli組19.04±0.701)38.97±1.201)65.67±1.141)60.78±1.141)與N組同時(shí)間點(diǎn)比較,1)P<0.05;與SE組同時(shí)間點(diǎn)比較,2)P<0.05;與Gli組同時(shí)間點(diǎn)比較,3)P<0.05。

2.4 Bcl-2檢測 SE組大鼠海馬CA 1及CA 3區(qū)Bcl-2表達(dá)較N組有明顯升高(P<0.05);SE組、Pin組、Gli組均在12 h時(shí)Bcl-2表達(dá)到達(dá)高峰,24 h下降,72 h持續(xù)減低至5 d。同時(shí)間點(diǎn)比較,SE組、Pin組、Gli組較N組均明顯增多(P<0.05);Pin組較SE組、Gli組均明顯增高(P<0.05);SE組與Gli組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

表2 各組Bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

組別12 h24 h72 h5 d N組9.91±0.87 9.99±0.96 10.00±0.95 10.25±0.78 SE組36.84±1.211)30.87±1.331)18.95±0.881)14.30±0.861)Pin組 48.34±0.881)2)3)40.62±1.331)2)3)35.12±1.341)2)3)21.10±1.431)2)3)Gli組36.02±1.151)29.89±0.951)18.76±0.491)14.29±0.701)與N組同時(shí)間點(diǎn)比較,1)P<0.05;與SE組同時(shí)間點(diǎn)比較,2)P<0.05;與Gli組同時(shí)間點(diǎn)比較,3)P<0.05。

2.5 Caspase-3陽性細(xì)胞檢測 觀察大鼠海馬CA1及CA3區(qū),N組Caspase-3少量表達(dá);SE組、Pin組、Gli組均在12 h可見Caspase-3表達(dá),24 h達(dá)高峰, 72 h逐漸下降持續(xù)至5 d。同時(shí)間點(diǎn)比較,SE組、Pin組、Gli組較N組均明顯增多(P<0.05);Pin組較SE組、Gli組均明顯減低(P<0.05);SE組與Gli組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

表3 各組Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)(±s)

組別12 h24 h72 h5 d N組2.21±0.21 2.46±0.30 2.41±0.36 2.35±0.29 SE組19.63±1.021)35.64±1.201)29.78±1.241)26.55±1.221)Pin組 8.36±0.741)2)3)22.12±0.521)2)3)17.20±0.801)2)3)13.93±1.301)2)3)Gli組18.58±0.961)34.63±0.581)29.48±1.081)25.86±1.021)與N組同時(shí)間點(diǎn)比較,1)P<0.05;與SE組同時(shí)間點(diǎn)比較,2)P<0.05;與Gli組同時(shí)間點(diǎn)比較,3)P<0.05。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)癲癇發(fā)作或SE可引起腦損傷,凋亡在這種腦損傷及神經(jīng)元丟失中起重要作用[3,4],它使神經(jīng)元內(nèi)多種與凋亡有關(guān)的基因或蛋白酶激活。其中,凋亡抑制基因Bcl-2屬于Bcl-2基因家族,Jerry等[5]發(fā)現(xiàn)Bcl-2可抑制線粒體膜電位降低、細(xì)胞色素C(Cyt-C)和凋亡誘導(dǎo)因子的釋放及Caspase的激活,最終阻止細(xì)胞凋亡。另外,Caspase(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)家族是一類直接引起凋亡細(xì)胞解體的蛋白酶系統(tǒng),其活化是凋亡執(zhí)行階段的重要環(huán)節(jié)。該家族成員Caspase-3是哺乳動物細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶,處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的核心位置[6]。KATP是一個(gè)異源八聚體蛋白復(fù)合物(SUR/Kir6.X)4,由4個(gè)內(nèi)向整流K+通道(Kir)亞基和4個(gè)磺脲類受體(SUR)蛋白調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成[7]。根據(jù)分布位置差異,分線粒體KATP(mitochondria KATP,mitoKATP)和細(xì)胞膜KATP(surface KATP,sKATP)。目前發(fā)現(xiàn)KATP廣泛分布于腦內(nèi),在黑質(zhì)、海馬、大腦皮質(zhì)及紋狀體最多,其次是小腦、下丘腦。KATP既能被KATP開放劑激活,又能被磺酰脲復(fù)合物抑制。近年來認(rèn)為KATP開放劑是一類新型腦保護(hù)藥物,而本實(shí)驗(yàn)的吡那地爾是sKATP開放劑,格列吡嗪是磺酰脲類藥物,為KATP拮抗劑。研究發(fā)現(xiàn)吡那地爾對心肌及大鼠大腦的缺血-再灌注損傷具有保護(hù)作用,它對癲癇引起腦損傷的保護(hù)作用,多數(shù)認(rèn)為其機(jī)制是特異性激活突觸前、后膜KATP,使胞內(nèi)K+外流,前膜超極化,對抗電壓依賴性Ca2+通道引起胞外Ca2+內(nèi)流,阻止谷氨酸等興奮性氨基酸釋放[8];使突觸后對谷氨酸敏感的神經(jīng)元發(fā)生超極化,抑制谷氨酸釋放過度而阻斷突觸后興奮[9]。另有發(fā)現(xiàn),還可阻止c-fos、熱休克蛋白等跟凋亡有關(guān)基因的表達(dá),減少神經(jīng)元凋亡[10]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與SE組、Gli組比較,Pin組使有抑制凋亡的Bcl-2明顯增高,使升高的TUNEL、Caspase-3明顯降低,表明吡那地爾對SE所致神經(jīng)元損傷有一定保護(hù)作用,吡那地爾此作用可被格列吡嗪阻斷,以上結(jié)果為臨床診治癲癇提供了理論依據(jù)。

[1] Csilla G,Vera J,Réka H,et al.Status epilepticus and its treatment-update 2013[J].Ideggyogy Sz,2013,66(11-12):372-382.

[2] Chapman MG,Smith M,Hirsch NP.Status epilepticus[J].Anaesthesia,2001,56:648-659.

[3] Wang Y,Qin ZH.Molecular and cellular mechanisms of excitotoxic neuronal death[J].Apoptosis,2010,15(11):1382-1402.

[4] Wang S,Wang S,Shan P,et al.μcalpain mediates hippocampal neuron death in rats after lithium-pilocarpine-induced status epilepticus[J].Brain Res Bull,2008,76(1-2):90-96.

[5] Jerry EC,Tudor M,Fabien L,et al .The Bcl-2 family reunion [J].Mol Cell,2010,37(3):299-310.

[6] Srbulescu RF,Zupanc GK.Inhibition of caspase-3-mediatedapoptosis improvesspinal cord repair in a regeneration-competent vertebrate system[J].Neuroscience,2010,171(2):599-612.

[7] Seino S.ATP-sensitive potassium channels:A model of heteromultimeric potassium channel/receptor assemblies[J].Annu Rev Physiol,1999,61:337-362.

[8] Ye GL,Leng CK,Yung WH.Pre-synaptic effect of the ATP-sensitive potassium channel opener diazoxide on rat substantianigra pars reticulate neurons[J].Brain Res,1997,753(1):1-7.

[9] Fujita H,Takizawa S,Nanri K,et al.Potassium channel opener reduces entracellular glutamate concentration in rat focal cerebral ischemia[J].Brain Res Bull,1997,43(4):365-368.

[10] Yu T,Fu XY,Liu XK,et al.Protective effects of pinacidil hyperpolarizing cardioplegia on myocardial ischemia reperfusion injury by mitochondrial KATPchannels[J].Chin Med J(Engl),2011,124 (24):4205-4210.

R742.1R259

:Adoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.02.020

:1672-1349(2015)02-0190-03

2014-07-19)

(本文編輯郭懷印)

1.山西醫(yī)科大學(xué)2011級神經(jīng)病學(xué)碩士研究生(太原030001);2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院

鄭輯英,E-mail:281156157@qq.com