地黃毛狀根的誘導(dǎo)及條件優(yōu)化

劉連旺　張永清　祁建軍等

摘要：以發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060菌株侵染地黃外植體，研究不同菌液濃度、不同侵染時(shí)間和不同共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響。結(jié)果表明，發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060菌株可成功誘導(dǎo)出地黃毛狀根，PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒rolC基因已整合到地黃基因組中并得到表達(dá)；單因素試驗(yàn)結(jié)果顯示，在地黃毛狀根的誘導(dǎo)過程中，誘導(dǎo)的最佳菌液濃度為OD600=0.6，最佳侵染時(shí)間為10 min，最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

關(guān)鍵詞：地黃；毛狀根；發(fā)根農(nóng)桿菌；誘導(dǎo)率

中圖分類號(hào)：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2015）01-0047-04

Abstract Agrobacterium rhizogenes Accc10060 was used to infect the explants of Rehmannia glutinosa， then the influences of different bacterial concentrations， infection times and different co-culture times on hairy root induction rate were researched. The results showed that the hairy roots of R. glutinosa could be induced by A. rhizogenes Accc10060， and PCR detection results indicated that the rolC gene in Ri plasmid of A. rhizogenes had integrated into the genome of R. glutinosa and been expressed. The results of single factor experiment showed that the best induction conditions of hairy roots were OD600 as 0.6， infecting for 10 minutes and co-culturing for 4 days.

Key words Rehmannia glutinosa Libosch； Hairy root； Agrobacterium rhizogenes； Induction rate

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）為玄參科多年生草本植物，以新鮮或干燥塊根入藥[1]，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘性寒，具有滋陰養(yǎng)血、清熱涼血、補(bǔ)腎生津止渴等功效[2]。地黃是我國(guó)常用的大宗中藥材，其有效成分梓醇具有瀉下、保肝、強(qiáng)心、利尿和降血脂等作用。生產(chǎn)中地黃主要采用營(yíng)養(yǎng)繁殖，傳統(tǒng)的栽培模式存在連作障礙，致使其種質(zhì)退化，主要表現(xiàn)為根莖變細(xì)，產(chǎn)量下降，質(zhì)量變差，嚴(yán)重影響地黃的產(chǎn)量和品質(zhì)[3]。近年來利用生物基因工程手段生產(chǎn)藥用植物成為一條可行途徑，利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染植株形成的毛狀根體系生長(zhǎng)快、易于培養(yǎng)、遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)、合成次生代謝物質(zhì)能力突出[4]，發(fā)展?jié)摿薮蟆?jù)統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)外已對(duì)26科92種藥用植物進(jìn)行了毛狀根的誘導(dǎo)研究，如丹參[5]、人參[6]、甘草[7]和石斛[8]等，但對(duì)地黃毛狀根的研究才剛剛起步。本試驗(yàn)利用發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060感染地黃外植體誘導(dǎo)其產(chǎn)生毛狀根，PCR技術(shù)鑒定毛狀根，在此基礎(chǔ)上研究不同因素對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響，初步優(yōu)化了毛狀根的誘導(dǎo)條件，以期為地黃毛狀根大量培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地黃植株為本實(shí)驗(yàn)室自培育的85-5地黃無菌苗，發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所祁建軍老師提供。

rolC引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，Premix PrimeSTAR HS購(gòu)自TaKaRa公司，植物組織常規(guī)提取試劑盒購(gòu)自Tiangen公司，質(zhì)粒提取試劑盒E.Z.N.A. Plasmid Mini Kit Ⅰ購(gòu)自O(shè)MEGA公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)與活化 取低溫保存的Accc10060菌株，無菌條件下接種于固體培養(yǎng)基（YEB+100 mg/L Rif）上，28℃暗培養(yǎng)48 h。挑取單菌落于YEB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600為0.6左右。5 000 r/min離心10 min，收集菌體，并用等體積的MS液體培養(yǎng)基（無蔗糖）重懸，供侵染使用。

1.2.2 地黃毛狀根的誘導(dǎo)與繼代培養(yǎng) 挑選幼嫩、生長(zhǎng)旺盛的地黃無菌苗葉片，將其剪成0.5 cm2的小塊，接種于無激素的MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2～3 d。將上述預(yù)培養(yǎng)后的外植體浸于制備的菌液中， 28℃，120 r/min振蕩侵染10 min。侵染后用無菌濾紙吸干外植體表面多余菌液，轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上黑暗條件下共培養(yǎng)。3～4 d后將共培養(yǎng)后的外植體置于液體培養(yǎng)基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，120 r/min、15 min清洗2次，以洗去外植體表面殘留的農(nóng)桿菌，轉(zhuǎn)入到除菌培養(yǎng)基（1/2MS+600 mg/L AMP）中，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)根，每7 d轉(zhuǎn)接1次，連續(xù)除菌4～5次，直至無菌斑出現(xiàn)。待地黃外植體產(chǎn)生的毛狀根長(zhǎng)至2～3 cm時(shí)，挑選生長(zhǎng)迅速、分化旺盛的根段轉(zhuǎn)接于無激素的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行毛狀根的繼代培養(yǎng)。

1.2.3 地黃毛狀根PCR檢測(cè) 取完全除菌后的毛狀根約1 g，用常規(guī)植物組織DNA提取試劑盒提取毛狀根DNA，借助質(zhì)粒提取試劑盒從5 mL過夜培養(yǎng)的菌液中提取質(zhì)粒DNA，作為陽性對(duì)照，同時(shí)以非轉(zhuǎn)化根的DNA作為陰性對(duì)照。根據(jù)文獻(xiàn)[9]，合成rolC上游引物：5′-ATGGCGGAATTTGACCTATG-3′；下游引物： 5′-TTAGTTCCATCTGCCCATCC-3′。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括Premix PrimeSTAR HS 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 40 ng，ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min；98℃10 s，56℃ 退火15 s，72℃延伸 1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，紫外成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶并拍照。endprint

1.2.4 不同因素對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響 通過單因素試驗(yàn)，研究不同因素對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響，以篩選最佳的誘導(dǎo)條件。

菌液濃度的篩選：將菌液濃度OD600設(shè)為0.2、0.4、0.6、0.8，侵染時(shí)間為10 min，共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

侵染時(shí)間的篩選：將侵染時(shí)間設(shè)為0、5、10、15、20 min，菌液濃度OD600為0.6，共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

共培養(yǎng)時(shí)間的篩選：將共培養(yǎng)時(shí)間設(shè)為0、2、4、6 d，菌液濃度OD600為0.6，侵染時(shí)間為10 min。

10 d后統(tǒng)計(jì)毛狀根誘導(dǎo)率，計(jì)算公式如下：

誘導(dǎo)率（%）=產(chǎn)生毛狀根的外植體總數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 地黃毛狀根的誘導(dǎo)和培養(yǎng)

發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060侵染后的地黃葉片可成功誘導(dǎo)出毛狀根。外植體經(jīng)除菌培養(yǎng)10 d后，出現(xiàn)生根現(xiàn)象，每個(gè)葉片基部一般可誘導(dǎo)出一條或幾條毛狀根。經(jīng)繼代除菌培養(yǎng)后的毛狀根，接種于無激素的1/2MS培養(yǎng)基數(shù)天后，生長(zhǎng)加快產(chǎn)生許多側(cè)根，生長(zhǎng)狀況良好。

2.2 地黃毛狀根的鑒定

以地黃毛狀根的基因組DNA為模板，利用rolC基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果顯示，從轉(zhuǎn)化的地黃毛狀根總DNA中擴(kuò)增出特異性片段，該片段與Accc10060質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增結(jié)果一致，而從未轉(zhuǎn)化的地黃根中則未擴(kuò)增出此片段（見圖1），說明含有rolC基因的發(fā)根農(nóng)桿菌Ri 質(zhì)粒T-DNA部分片段已整合到地黃基因組中，并獲得表達(dá)。

2.3 不同因素對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響

2.3.1 不同濃度菌液對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響 菌液濃度直接影響著農(nóng)桿菌侵染效率，在一定范圍內(nèi)，菌液濃度越高，菌體在植物細(xì)胞上的附著率越高，越有利于毛狀根的轉(zhuǎn)化，但濃度過高會(huì)增加對(duì)外植體的傷害，導(dǎo)致其褐化死亡，轉(zhuǎn)化效果不佳。由表1可知，當(dāng)菌液濃度為OD600=0.6左右時(shí)，地黃毛狀根誘導(dǎo)率達(dá)最高，菌液濃度過低或過高均不利于其誘導(dǎo)。

2.3.2 不同侵染時(shí)間對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響 適宜的侵染時(shí)間有助于發(fā)根農(nóng)桿菌對(duì)寄主植物的附著和轉(zhuǎn)化，從而提高誘導(dǎo)率。侵染時(shí)間過短，農(nóng)桿菌不能對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行充分附著；侵染時(shí)間過長(zhǎng)，發(fā)根農(nóng)桿菌易對(duì)外植體細(xì)胞造成傷害，且不利于后期的除菌培養(yǎng)。由表2可知，侵染10 min時(shí)地黃毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳，之后隨著侵染時(shí)間的增加，誘導(dǎo)率逐漸下降。侵染時(shí)間為20 min時(shí)，后期除菌培養(yǎng)困難，外植體逐漸褐化，直至最終死亡。

2.3.3 共培養(yǎng)時(shí)間對(duì)地黃毛狀根誘導(dǎo)率的影響 共培養(yǎng)時(shí)間通常是發(fā)根農(nóng)桿菌將T-DNA轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞內(nèi)的時(shí)間，適當(dāng)?shù)墓才囵B(yǎng)時(shí)間是農(nóng)桿菌成功轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。由表3可知，共培養(yǎng)時(shí)間在0～4 d 時(shí)，隨著共培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，地黃毛狀根的誘導(dǎo)率逐漸升高；當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間為6 d時(shí)，誘導(dǎo)率為0，菌株大量增殖，幾乎覆蓋了外植體的表面，外植體褐化程度較高，不利于毛狀根的誘導(dǎo)。

3 結(jié)論與討論

本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌Accc10060菌株侵染地黃的葉片，可成功誘導(dǎo)出毛狀根，且大多數(shù)毛狀根的發(fā)根部位集中在形態(tài)學(xué)下端的葉脈切口表面，這與丹參[10]、何首烏[11]的毛狀根誘導(dǎo)結(jié)果一致，分析可能與生長(zhǎng)激素的極性運(yùn)輸與分布有關(guān)。結(jié)合PCR 檢測(cè)技術(shù)，從地黃毛狀根基因組中擴(kuò)增出與rolC基因一致的特異性條帶，表明發(fā)根農(nóng)桿菌 Ri質(zhì)粒的T-DNA已整合到地黃基因組中。

同時(shí)，通過對(duì)菌液濃度、侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間3個(gè)影響因素的試驗(yàn)，優(yōu)化了地黃毛狀根的誘導(dǎo)條件。李景濱等[12]研究發(fā)現(xiàn)，菌液OD600在0.8左右時(shí)，金鐵鎖毛狀根的誘導(dǎo)效果最佳，本試驗(yàn)結(jié)果表明，地黃毛狀根誘導(dǎo)的最佳侵染菌液濃度為OD600=0.6，說明不同植物對(duì)發(fā)根農(nóng)桿菌的敏感性有所差異，選擇合適的菌液濃度有助于提高轉(zhuǎn)化率。農(nóng)桿菌對(duì)外植體的侵染時(shí)間是遺傳轉(zhuǎn)化中的重要因素，侵染時(shí)間的長(zhǎng)短與誘導(dǎo)率的高低有著直接關(guān)系。孫晶等[13]研究表明，北柴胡毛狀根誘導(dǎo)的最佳侵染時(shí)間為20 min，本試驗(yàn)中適于地黃毛狀根誘導(dǎo)的最佳侵染時(shí)間為10 min，兩試驗(yàn)均表明，隨著侵染時(shí)間的延長(zhǎng)，后續(xù)除菌困難， 外植體褐化嚴(yán)重，不利于毛狀根的誘導(dǎo)。共培養(yǎng)時(shí)間的長(zhǎng)短與轉(zhuǎn)化效率密切相關(guān)。共培養(yǎng)時(shí)間過短則不能完成T-DNA的轉(zhuǎn)移與整合，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率很低；共培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)，農(nóng)桿菌的過度增殖會(huì)毒害外植體，導(dǎo)致植物材料的壞死，也不利于毛狀根的誘導(dǎo)。楊蕊等[14]研究發(fā)現(xiàn)，共培養(yǎng)3 d時(shí)，杜仲毛狀根誘導(dǎo)率最高，為73%，當(dāng)共培養(yǎng)時(shí)間增長(zhǎng)至 5 d時(shí)，誘導(dǎo)率明顯下降。本研究表明，適于地黃毛狀根誘導(dǎo)的最佳共培養(yǎng)時(shí)間為4 d。

此外，在毛狀根誘導(dǎo)過程中發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)添加外源激素和乙酰丁香酮，有助于毛狀根誘導(dǎo)率的提高。郭生虎等[15]研究發(fā)現(xiàn)，添加100 μmol/L乙酰丁香酮較未添加的對(duì)照組毛狀根誘導(dǎo)率明顯提高。周倩耘等[16]認(rèn)為適宜濃度的IAA、IBA、NAA、2，4-D，均可不同程度地促進(jìn)人參毛狀根的生長(zhǎng)以及皂甙的積累。

本研究初步建立了地黃毛狀根的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系，但由于發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生毛狀根的過程較為復(fù)雜，影響因素眾多，因此，更為詳細(xì)的誘導(dǎo)條件有待進(jìn)一步篩選優(yōu)化。

參 考 文 獻(xiàn)：

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