奧扎格雷細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立

李大亮，呂文博黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院

奧扎格雷細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法建立

李大亮，呂文博
黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院

采用經(jīng)過(guò)靈敏度復(fù)核合格的鱟試劑，對(duì)奧扎格雷進(jìn)行干擾初篩試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)驗(yàn)證，從而建立奧扎格雷的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。

奧扎格雷；結(jié)晶性粉末；細(xì)菌內(nèi)毒素；凝膠法；干擾試驗(yàn)

奧扎格雷為白色或類(lèi)白色結(jié)晶性粉末，用于治療急性血栓性腦梗死和腦梗死所伴隨的運(yùn)動(dòng)障礙，是注射用奧扎格雷鈉和奧扎格雷注射液的原料藥。建立其細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法，可以確保藥品質(zhì)量，保障用藥安全。采用凝膠限度法，通過(guò)細(xì)菌內(nèi)毒素限度確定、干擾初篩試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)建立奧扎格雷的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法。

1.實(shí)驗(yàn)材料

靈敏度為0.25EU/m l的鱟試劑，廠(chǎng)家為湛江安度斯生物有限公司；細(xì)菌內(nèi)毒素國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（NSE）：中國(guó)藥品生物制品鑒定所；細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（W）：湛江安度斯生物有限公司；無(wú)熱源空安瓿：規(guī)格：2m l/支；奧扎格雷廠(chǎng)家：海南中和藥業(yè)有限公司

檢驗(yàn)儀器：TAL-40型試管恒溫儀，廠(chǎng)家湛江安度斯生物有限公司

2.細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)限度確定

奧扎格雷鈉注射液的細(xì)菌內(nèi)毒素限度為每1mg奧扎格雷鈉內(nèi)毒素限值應(yīng)小于1.0EU，奧扎格雷為奧扎格雷鈉注射液的原料藥，其內(nèi)毒素限值不得大于1.0EU/mg。采用鱟試劑凝膠法對(duì)奧扎格雷的內(nèi)毒素進(jìn)行限度測(cè)定，通過(guò)初篩試驗(yàn)和干擾試驗(yàn)確定奧扎格雷的有效稀釋倍數(shù)。

3.鱟試劑靈敏度復(fù)核

取規(guī)格為0.1m l/支的鱟試劑18支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用安瓿小護(hù)士在瓶頸輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1m l檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡。

制備標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，每次稀釋漩渦混合30S

加樣：將已充分溶解的待復(fù)核鱟試劑18支（管）放在安瓿架上，排成5列，其中4列4支（管），1列2支（管）。4支（管）4列每列每支分別加入0.1m l2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液；另2支（管）加入0.1m l檢查用水。

加樣結(jié)束后，將鱟試劑用封口膜封口，輕輕振動(dòng)混勻，避免產(chǎn)生氣泡，垂直放入37±1℃的恒溫器中，保溫60min±2min。

計(jì)算結(jié)果：鱟試劑的靈敏度0.5λ<0.25EU/m l<2λ，本批鱟試劑的靈敏度符合要求。

4.樣品最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）的計(jì)算

取10mg奧扎格雷加1m l內(nèi)毒素檢查用水溶解MVD=CL/λ= 10×1.0/0.25=40倍，靈敏度0.25、0.125、0.06、0.03 EU/m l對(duì)應(yīng)的MVD為40、80、160、320。

5.初篩試驗(yàn)

內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品C的制備見(jiàn)藥典方法：每次稀釋漩渦混合至少30S，E0.5即為內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品溶液C。供試品溶液A的制備：取10mg奧扎格雷加1ml內(nèi)毒素檢查用水溶解為S。稀釋方法，0.2mlS+1.8mlW→2.0mlS10，1.0mlS10+1.0mlW→2.0mlS20，1.0mlS20+ 1.0m lW→2.0m lS40，，1.0m lS40+1.0mlW→2.0m lS80，10m lS80+1.0m lW→2.0m lS160，1.0m lS160+1.0m lW→2.0m lS320。內(nèi)毒素供試品溶液B的制備0.5mlS20+0.5m lE1→1.0m lS40E0.5，0.5mlS40+0.5m lE1→1.0m lS80E0.5，0.5m lS80+0.5m lE1→1.0m lS160E0.5，0.5m lS160+0.5m lE1→1.0mlS320E0.5

陰性對(duì)照溶液D：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（W）

檢查法：取的鱟試劑20支，輕彈瓶壁使粉末落入瓶底，用安瓿小護(hù)士在瓶頸輕輕劃痕，75%乙醇棉球擦拭后啟開(kāi)備用，防止玻璃屑落入瓶?jī)?nèi)。每支加入0.1m l檢查用水溶解，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)瓶壁，使內(nèi)容物充分溶解，避免產(chǎn)生氣泡，分別加0.1m l的A、B、C、D溶液放入37±1℃的試管恒溫儀中，保溫60min±2min。

結(jié)果：A、D溶液均為陰性；C溶液為陽(yáng)性，試驗(yàn)有效；B溶液中第一個(gè)出現(xiàn)陽(yáng)性者的濃度初步判定為樣品的無(wú)干擾濃度，即樣品稀釋40倍細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)無(wú)干擾。

6.干擾驗(yàn)證試驗(yàn)

供試品溶液A的制備：取10mg奧扎格雷加1m l內(nèi)毒素檢查用水溶解為S，S40為供試品溶液A。0.2mlS+1.8m lW→2.0m lS10，0.8m lS10+2.4m lW→3.2m lS40，0.5mlS40+0.5m lW→1.0m lS80。內(nèi)毒素供試品B制備：取三批樣品分別按此法制備，0.5m lS40+0.5m lE1→1.0m lS80E0.5，0.5m lS40+0.5m lE0.5→1.0mlS80E0.25，0.5m lS40+0.5m lE0.25→1.0mlS80E0.125，0.5mlS40+0.5mlE0.125→1.0mlS80E0.06。內(nèi)毒素溶液C制備：同初篩試驗(yàn)。陰性對(duì)照溶液D：細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（W）

結(jié)論

3批樣品兩組最大濃度2λ管均為陽(yáng)性，最低濃度0.25λ均為陰性，陰性對(duì)照4管均為陰性，Es在0.5λ～2λ之間，且0.5Es

[1]奧扎格雷說(shuō)明書(shū)海南中和藥業(yè)有限公司

[2]《中國(guó)藥典》2010版二部附錄XIE

[3]奧扎格雷鈉注射液國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS1-(X-095)-2005Z

李大亮，黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，講師，碩士學(xué)位，研究方向:中藥提取；

呂文博，黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院，講師，碩士學(xué)位，研究方向：中藥制藥。