間充質(zhì)干細(xì)胞在眼表疾病治療中的應(yīng)用

張暖，羅曉慧 綜述 梁凌毅 審校

(中山大學(xué)中山眼科中心角膜與眼表疾病科，眼科學(xué)國家重點(diǎn)實驗室，廣州 510060)

眼表的概念由Thoft[1]在1977年首次提出，主要包括角膜上皮、結(jié)膜上皮和淚膜3個部分。眼表直接與外界環(huán)境接觸，是眼球的首道屏障，因此對維持眼部健康和眼球內(nèi)部穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。眼表疾病是指導(dǎo)致眼表結(jié)構(gòu)異?；蚬δ苷系K的疾病，是眼科最常見的疾病之一。目前臨床的治療方法包括局部使用眼藥水、全身使用抗生素以及手術(shù)治療，然而對于一些難治性或反復(fù)性的疾病，如角膜移植排斥、干眼、角膜化學(xué)傷等，其治療效果并不理想。

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem/stromal cells，MSCs)是一類源于多種組織的，包括骨髓(bone marrow derived-，BM-)，脂肪(adipose tissue derived-，AT-)，臍帶血來源(umbilical cord derived-，UC-)、牙齦(gingival derived-)、臍帶膠質(zhì)(Wharton’s jelly mesenchymal derived-)等的、非造血的、形似成纖維細(xì)胞紡錘狀的、具有強(qiáng)大自我更新能力及在不顯著改變性能的情況下保持多次傳代的細(xì)胞[2-3]。近年來，其免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、抗新生血管、定向損傷組織遷移的特性受到廣泛關(guān)注。

1 間充質(zhì)干細(xì)胞的作用機(jī)制

1.1 作用機(jī)制

迄今為止，MSCs治療疾病的確切機(jī)制仍不清楚，以下是目前提出的幾種可能的治療機(jī)制。

1.1.1 免疫調(diào)節(jié)機(jī)制

MSCs具有免疫調(diào)節(jié)功能抑制和改善多種免疫性疾病的異常炎癥的作用[4]。MSCs可調(diào)控多種免疫細(xì)胞的成熟和功能，例如樹突狀細(xì)胞[5]、自然殺傷細(xì)胞[6]、巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞[7-8]和B淋巴細(xì)胞[9]，調(diào)節(jié)機(jī)體的先天性和獲得性免疫反應(yīng)。MSCs對免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)主要與之分泌的一系列細(xì)胞因子有關(guān)，包括轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β1，TGF-β1)、前列腺素E2、吲哚胺-2,3-雙加氧酶、白細(xì)胞介素-1(interleukin-1，IL-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、金屬基質(zhì)蛋白酶、血紅素氧合酶-1和一氧化氮等[10-11]。MSCs還高表達(dá)一系列黏附分子和趨化因子，包括細(xì)胞間黏附分子-1、血管細(xì)胞黏附分子-1和趨化因子受體3等，誘導(dǎo)免疫細(xì)胞與MSCs緊密靠近，形成具有局部免疫抑制作用的微環(huán)境[12]。此外，MSCs的免疫調(diào)節(jié)功能被認(rèn)為是可調(diào)節(jié)的，在高濃度的特異性炎癥因子，如干擾素γ(interferon-γ，IFN-γ)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)的環(huán)境中免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)被放大，但在炎癥因子缺乏的情況下功能被抑制[13-15]。

1.1.2 促修復(fù)機(jī)制

MSCs可釋放多種生長因子，包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、肝細(xì)胞生長因子、胰島素樣生長因子-1、TGF-β、成纖維細(xì)胞生長因子和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1[16]。這些營養(yǎng)因子促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和其他組織祖細(xì)胞的增殖，進(jìn)而參與組織修復(fù)和再生[17]。細(xì)胞實驗[18]結(jié)果顯示：將真皮成纖維細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞共培養(yǎng)，在沒有直接接觸的情況下，真皮成纖維細(xì)胞在劃痕試驗中出現(xiàn)增殖加快和遷移加速。此外，靜脈注射異體MSCs歸巢到角膜損傷部位，可明顯促進(jìn)角膜熱燒傷小鼠模型角膜上皮的修復(fù)[19]。

1.1.3 抗新生血管機(jī)制

不同的微環(huán)境可調(diào)節(jié)MSC的不同行為和功能。在缺血性組織，如心肌梗死的模型[20]中，MSCs通過上調(diào)VEGF刺激梗塞組織產(chǎn)生新生血管改善心臟功能。但是在炎癥性疾病，如角膜化學(xué)傷中，MSCs則下調(diào)VEGF的表達(dá)，減少角膜新生血管的面積[21]。角膜化學(xué)傷的炎癥環(huán)境可能刺激MSCs產(chǎn)生高水平的血小板反應(yīng)蛋白-1從而抑制VEGF的表達(dá)[22]。

1.1.4 細(xì)胞替代

作為多能細(xì)胞，MSCs可以分化為不同的細(xì)胞類型[23]，但MSCs能否產(chǎn)生功能性角膜細(xì)胞仍然存在爭議。在特定條件下，間充質(zhì)干能分化為角膜上皮樣細(xì)胞[24]、角膜基質(zhì)樣細(xì)胞[25]和內(nèi)皮樣細(xì)胞[26]來修復(fù)受損的角膜。有研究[27]將UC-MSCs移植到小鼠角膜基質(zhì)1個月后，這些細(xì)胞呈現(xiàn)出角膜基質(zhì)樣細(xì)胞的形態(tài)，并表達(dá)角膜基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物。但也有證據(jù)[28]表明：從MSCs衍生出來的被替換細(xì)胞并不是真正的組織細(xì)胞，MSCs可以產(chǎn)生多種調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白有助于MSCs治療疾病，但同時也可能影響了對MSCs分化潛能的評估。

1.2 不同來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的區(qū)別

MSCs的運(yùn)用應(yīng)結(jié)合MSCs的來源。雖然骨髓、臍帶血和脂肪組織來源的MSCs在形態(tài)學(xué)和表型方面無明顯差異[29]，但是彼此之間的增殖和分化能力存在差異。在增殖能力方面，UC-MSCs最強(qiáng)，而BM-MSCs最弱；在成骨分化能力方面，UCMSCs最強(qiáng)，AT-MSCs最弱[30-31]。在成脂分化能力方面，BM-MSCs強(qiáng)于UC-MSCs[30]。在成軟骨分化能力方面，AT-MSCs強(qiáng)于臍帶基質(zhì)來源的[32]。此外，不同的MSCs具有不同的免疫調(diào)節(jié)功能。與BM-MSCs相比，AT-MSC能更有效的抑制樹突狀細(xì)胞的形成，并且能分泌更高濃度的IL-6，IL-8，IL-12等細(xì)胞因子[33]。但是，BM-MSCs，UCMSCs，WJ-MSCs，AT-MSCs在抑制植物血凝素誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖方面沒有差異[34]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞在眼表疾病中的臨床前和臨床運(yùn)用

截至2020年4月，在Clinical Trial上登記的干細(xì)胞研究有994項(以“mesenchymal stem cells”“mesenchymal stromal cells”“MSCs”為關(guān)鍵詞)，其中與眼表相關(guān)的的僅有8項，3項與干眼相關(guān)(NCT03878628，NCT04213248，NCT00953485)、3項與角膜化學(xué)傷(NCT03237442，NCT03967275，NCT02325843)、1項與角膜緣干細(xì)胞缺乏(NCT01562002)、1項與圓錐角膜(NCT02932852)相關(guān)。而在PubMed上搜索所得的臨床相關(guān)文章亦很少，由此可見，雖然MSCs的研究如火如荼，但大多停留在基礎(chǔ)領(lǐng)域，特別是眼表方向，離臨床轉(zhuǎn)化運(yùn)用依舊有一條漫長的道路。

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞在眼移植物抗宿主病相關(guān)性干眼及干眼中的運(yùn)用

眼移植物抗宿主病(ocular graft versus host disease，oGVHD)是造血干細(xì)胞移植術(shù)后的一種常見的慢性并發(fā)癥，發(fā)病率為40%～80%[35]。T淋巴細(xì)胞通過攻擊宿主的淚腺、瞼板腺、結(jié)膜、角膜等眼表組織，產(chǎn)生與干眼、干燥綜合征、瞼板腺功能障礙相關(guān)的臨床病癥，主要表現(xiàn)為淚液分泌減少、淚膜不穩(wěn)定、結(jié)膜纖維化、瞼板腺丟失、角膜損傷等[36-37]，其中干眼相關(guān)癥狀是影響oGVHD患者生活質(zhì)量的主要原因[38]。免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子的失衡可能是oGVHD發(fā)生的原因之一[39]。MSCs在T細(xì)胞、B細(xì)胞的活化和增殖、抗炎因子和囊泡分泌等表現(xiàn)出的免疫調(diào)節(jié)特性[40-41]，使之成為治療oGVHD相關(guān)干眼的潛在選擇。Weng等[35]報道22例難治性oGVHD相關(guān)干眼患者，在經(jīng)歷了至少1個月的眼部人工淚液聯(lián)合標(biāo)準(zhǔn)的免疫抑制治療后癥狀均無明顯改善，但在給予1.0×106/kg MSCs靜脈輸注3個月后，54.55%(12/22)患者的臨床癥狀、眼表疾病指數(shù)評分和Schirmer試驗結(jié)果明顯改善，且無注射相關(guān)的不良反應(yīng)。此外，患者血液中的CD8+CD28–T細(xì)胞數(shù)量增加，IL-2及IFN-γ等細(xì)胞因子的水平升高，而炎性因子IL-10和IL-4較治療前降低。另一項研究[42]也發(fā)現(xiàn)18例難治性慢性GVDH患者中的14例干眼患者，在接受1.0×106/kg MSCs靜脈輸注后的第1次評估時，有2例患者得到了眼部癥狀的緩解，在隨訪的2年時間內(nèi)，有5例(35.7%)患者表現(xiàn)出臨床癥狀的改善。雖然MSCs在治療oGVHD相關(guān)性干眼方面顯示出一定的效果，但是在預(yù)防oGVHD方面效果并不理想[43]。

關(guān)于MSCs治療oGVHD相關(guān)性干眼的更多研究還處于動物實驗階段。Martínez-Carrasco等[44]在造血干細(xì)胞移植術(shù)后第10天對發(fā)生oGVHD的小鼠進(jìn)行結(jié)膜下注射人MSCs(2×105/20 μL)，18 d后處死小鼠。實驗組的小鼠眼部外觀正常，沒有發(fā)生眼瞼痙攣、眼瞼紅斑和眼周皮毛脫落；淚液滲透壓穩(wěn)定無升高；角膜中未發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞CD3+的侵襲，且角膜上皮的角質(zhì)化程度低，此外，角膜中炎性因子的表達(dá)受到明顯抑制。這些結(jié)果表明結(jié)膜下注射MSCs能有效抑制oGVHD中的免疫反應(yīng)和相關(guān)的角膜改變。另一項研究[45]通過同樣結(jié)膜下注射的方式，在移植術(shù)后15 d給予患有oGVHD的小鼠的右眼注射同樣劑量的BM-MSCs，10 d后發(fā)現(xiàn)未注射MSCs的左眼出現(xiàn)眼部外觀的改變、病理組織學(xué)見角膜萎縮、空泡化和凋亡，而注射過MSCs的右眼沒有出現(xiàn)相關(guān)改變。此外還發(fā)現(xiàn)結(jié)膜下注射的MSCs可大量遷移至角膜組織修復(fù)受損角膜，但是這一點(diǎn)在其他的研究中受到爭議[46]。除了結(jié)膜下注射，不同的施用途徑同樣對干眼起到良好的緩解作用。已有研究[47]對苯扎氯銨誘導(dǎo)的干眼模型進(jìn)行BM-MSCs混懸液(1×105/25 μL)點(diǎn)眼，治療1周后，MSCs組的平均眼淚水量和淚膜破裂時間得分顯著增加，角膜中炎癥細(xì)胞減少，同時杯狀細(xì)胞增加。Villatoro等[48]對常規(guī)治療(皮質(zhì)類固醇、他克莫司、環(huán)孢素和人工淚液)無效的12犬只進(jìn)行了眶內(nèi)腺注射脂肪來源的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，隨訪3個月即可觀察到眼表癥狀的改善，并且這種改善可持續(xù)發(fā)展至隨訪的第9個月，此外，無論是Schirmer試驗亦或是其他臨床體征，均出現(xiàn)顯著好轉(zhuǎn)。Lee等[46]使用眶內(nèi)注射伴刀豆球蛋白A誘導(dǎo)小鼠干眼模型，并向眶周注射人源和鼠源的MSCs，結(jié)果顯示：無論是哪種來源的MSCs，均可增加淚液產(chǎn)生并抑制炎癥；此外，用MSCs治療的小鼠角膜表現(xiàn)出CD4+T細(xì)胞浸潤和促炎因子表達(dá)的抑制。雖然動物實驗表明MSCs對oGVHD相關(guān)性干眼以及其他類型的干眼的治療效果良好，但是其相關(guān)發(fā)病機(jī)制和治病機(jī)理仍不明確，限制了MSCs在臨床治療運(yùn)用的轉(zhuǎn)化，因此需要進(jìn)一步開展更為深入的研究。

2.2 間充質(zhì)干細(xì)胞在角膜損傷修復(fù)中的運(yùn)用

多種原因會造成角膜損傷，包括化學(xué)傷、持續(xù)性角膜潰瘍、感染性角膜炎等[49]，嚴(yán)重的角膜損傷常伴隨角膜緣干細(xì)胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)、角膜混濁、角膜新生血管等影響視力的改變[50-52]。其中炎癥因子和細(xì)胞因子的持續(xù)侵入起關(guān)鍵作用，臨床上常用類固醇、免疫抑制劑、促修復(fù)等藥物治療，然而對于嚴(yán)重的病例效果并不理想[53]。間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)、促修復(fù)和抗新生血管的特性，使得它成為治療此類疾病的潛在可能。Calonge等[54]對17例角膜緣干細(xì)胞缺乏的患者實施了羊膜搭載的MSCs移植，在施行羊膜移植的過程中，沒有出現(xiàn)術(shù)中或術(shù)后并發(fā)癥，隨訪12個月，也未發(fā)現(xiàn)相關(guān)的免疫排斥反應(yīng)。在6個月時，細(xì)胞移植的成功率為76.5%，12個月時為85.7%。與羊膜搭載角膜緣上皮細(xì)胞移植相比，羊膜搭載的MSCs移植能顯著恢復(fù)角膜的透明性，此外，隨著隨訪時間的增加，癥狀評分、結(jié)膜充血、角膜上皮點(diǎn)狀染色、角膜潰瘍均顯著好轉(zhuǎn)，最佳矯正視力也從最初的0.06±0.08恢復(fù)到0.14±0.15。激光共聚焦顯微鏡檢查顯示：62.5%的病例在6個月的時候改善了角膜中央的上皮表型，第12個月時達(dá)71.4%。這首次證明MSCs可以與角膜緣干細(xì)胞一樣，安全且有效地恢復(fù)因LSCD受損的角膜。在此研究[54]中，失敗病例的原發(fā)病主要為角膜化學(xué)傷。雖然有3項注冊在案的關(guān)于MSCs在角膜化學(xué)傷中的運(yùn)用的臨床研究，但是目前尚沒有明確的臨床數(shù)據(jù)。

2.3 間充質(zhì)干細(xì)胞在過敏性結(jié)膜炎中的運(yùn)用

過敏性結(jié)膜炎是眼科門診最常見的疾病之一，典型癥狀包括眼癢、異物感、分泌物增加等，因其常反復(fù)發(fā)作，過敏性結(jié)膜炎可顯著影響患者的健康和生活質(zhì)量[55-58]。近年來，越來越多的研究關(guān)注了MSCs與過敏性疾病的關(guān)系。研究發(fā)現(xiàn)：使用MSCs能夠減弱過敏性疾病的癥狀[59]，包括哮喘[60]、變應(yīng)性鼻炎[57]、過敏性皮膚病[61]等。然而，MSCs治療過敏性結(jié)膜炎的研究鮮少報道，PubMed上僅有一項關(guān)于動物實驗的研究[62]。Su等[62]發(fā)現(xiàn)局部滴用TNF-α刺激的MSCs的培養(yǎng)液可較大程度地減輕豚草花粉誘導(dǎo)的小鼠過敏性結(jié)膜炎的臨床癥狀，該培養(yǎng)液可能通過降低炎癥細(xì)胞的數(shù)量和相關(guān)的分子水平、抑制IgE和組胺分泌，起到良好的抗過敏效果。雖然現(xiàn)在臨床常用的肥大細(xì)胞膜穩(wěn)定劑、抗組胺藥物和皮質(zhì)類固醇對過敏性結(jié)膜炎具有良好的控制效果，但是并不能控制過敏性結(jié)膜炎的反復(fù)發(fā)作，且存在長期滴用眼部不適，而MSCs可與免疫細(xì)胞相互作用，從而誘發(fā)免疫耐受，這可能可以發(fā)揮更長時間的抗過敏療效。因此更多關(guān)于MSCs和過敏性結(jié)膜炎的長期療效值得被關(guān)注。

2.4 間充質(zhì)干細(xì)胞在角膜移植中的運(yùn)用

角膜移植是拯救角膜疾患導(dǎo)致的失明最有效的方法，在全球范圍內(nèi)，每年進(jìn)行的角膜移植超過18萬次[63]。然而，多種因素，如原發(fā)病導(dǎo)致的新生淋巴管、血管、炎癥等，會導(dǎo)致角膜移植排斥[64-66]。與其他器官排斥類似，角膜移植排斥亦是一個免疫異常的過程[67]。因此，間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性使其有望成為治療此類疾病的方式。雖然暫時還沒有注冊和發(fā)表的臨床研究，但是已有多項臨床前研究對其治療效果進(jìn)行了探討。與其他眼表疾病不同，角膜移植術(shù)前使用MSCs治療效果更好。在其他器官移植的實驗中，術(shù)前輸注可延長移植器官的存活時間，這可能由于預(yù)輸注的同種異體來源的MSCs激活了宿主的免疫反應(yīng)，進(jìn)而產(chǎn)生了免疫耐受使得后續(xù)移植物被接受[68-69]。Oh等[70]發(fā)現(xiàn)：術(shù)前1 d增加MSCs靜脈注射比僅在術(shù)后進(jìn)行MSCs靜脈注射擁有更高的移植物存活率，并進(jìn)一步降低了角膜中樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和CD3+T細(xì)胞的數(shù)量，表現(xiàn)出更好的抗炎效果。Ko等[71]的研究結(jié)果也顯示：術(shù)前靜脈注射MSCs可以顯著延長角膜移植物的存活時間，顯著降低促炎因子IFN-γ和IL-2的表達(dá)水平顯著。然而Jia等[72]通過對比移植前連續(xù)3 d和移植后連續(xù)3 d給予大鼠靜脈輸注BM-MSCs后發(fā)現(xiàn)：術(shù)前輸注的效果與不使用MSCs的效果相似，而術(shù)后輸注的效果可以明顯延長移植物的存活時間。在角膜移植排斥的實驗中，MSCs注射的時機(jī)存在爭議。盡管如此，大部分研究[73-74]仍顯示出MSCs在角膜移植排斥中延長移植物存活的作用。

3 間充質(zhì)干細(xì)胞在眼表運(yùn)用的困難、局限及未來方向

間充質(zhì)干細(xì)胞由于其免疫調(diào)節(jié)、組織修復(fù)、抗新生血管等特性，在各種難治性疾病的治療中一直被寄予很大的期待。大部分現(xiàn)有的臨床前研究證明了其積極的治療效果，但是運(yùn)用MSCs治療仍然存在挑戰(zhàn)。首先，MSCs從臨床前研究到臨床試驗的轉(zhuǎn)化能力有待認(rèn)證。目前MSCs治療的安全性和有效性大多基于動物的臨床前研究和體外的細(xì)胞分子實驗，然而人與動物MSCs的免疫相容性、劑量、適應(yīng)性和效力可能有所不同[75]，在眼表所進(jìn)行的臨床研究也表現(xiàn)出不及動物研究的有效性，MSCs從臨床前動物研究的有效結(jié)果到臨床試驗的等效性尚有爭議。其次，由于MSCs來源不同且各研究間分離、分選、離體擴(kuò)增、純化的方法各異，這可能造成實驗結(jié)果重復(fù)性不足，引起MSCs的療效評估困難，MSCs臨床轉(zhuǎn)化與運(yùn)用更加復(fù)雜。此外，雖然MSCs在某些疾病的治療研究中已取得良好的效果，但是其作用機(jī)制尚未完全明朗，在不同的疾病中，細(xì)胞間接觸與分泌的可溶性因子有所不同，而且MSCs易受到周圍微環(huán)境的影響而分泌不同的細(xì)胞因子，因此貿(mào)然進(jìn)行人體試驗可能會帶來潛在的風(fēng)險。但不可否認(rèn)的是，現(xiàn)有的結(jié)果依舊表明MSCs是治療眼表疾病非常有前途的工具。因此，更多涉及標(biāo)準(zhǔn)化MSCs以便于臨床使用以及不同研究者進(jìn)行療效比較的研究值得期待。