一株還原制備納米銀的細菌菌株zxw01 的分離鑒定

張杰，熊文，張映，王嬌，楊洪一*，王濱松

(1.東北林業(yè)大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱150040；2.黑龍江大學化學化工與材料學院，黑龍江 哈爾濱150080)

納米銀具有催化、抗菌、非線性光學及導熱、導電等特性，在無機催化材料、抗菌劑、導電漿料等領域有著廣闊的應用前景[1–4]。目前，納米銀制備多采用物理和化學方法，尋找簡單環(huán)保的適合大規(guī)模制備的均一性好、穩(wěn)定性好的納米銀制備方法，仍然是廣大納米材料研究者面臨的富有挑戰(zhàn)性的課題。相對于化學方法，生物方法合成具有條件溫和、操作簡單、環(huán)境友好等特點。藻類[5]、細菌[6–8]、真菌[9–11]等許多微生物與硝酸銀作用都能制備納米銀粒子。細菌生長繁殖快，生長周期短，可大規(guī)模制備納米銀，是一種極具潛力的微生物材料。目前，關于制備納米銀優(yōu)良菌株篩選的報道較少。筆者擬篩選出納米銀高產(chǎn)率化制備的優(yōu)良菌株，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品來源

于東北林業(yè)大學林場取土壤樣品，共設6個樣點，于距地面深20 cm處取樣。將樣品混合后組成代表樣，裝入無菌封口塑料袋內(nèi)，于4℃冰箱保存，備用。

1.2 培養(yǎng)基

Luria–Bertani(LB)培養(yǎng)基的制備：將胰蛋白胨10g、酵母提取物 5g、NaCl 10g 混合，加蒸餾水定容至1 000mL，pH 調(diào)至7.4。

改良Luria–Bertani(LB)培養(yǎng)基(不加NaCl，防止生成氯化銀沉淀)的制備：將胰蛋白胨 10g 和酵母提取物 5g 混合，加蒸餾水定容至1 000mL，調(diào)pH 至7.4。

1.3 主要儀器與試劑

主要儀器：HZQ–F160A 型高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)；GeneAmp9700 型PCR 擴增儀(美國應用生物系統(tǒng)中國公司)；himacCF16RX 型高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)；TECNAI G2 型透射電子顯微鏡(荷蘭Philips– FEI 公司)；Bruker D8 型X–射線衍射儀(德國Bruker 公司)；熱重分析儀(TGA/ DSC2)。

主要試劑：DNA 提取試劑盒和凝膠回收試劑盒(北京莊盟國際生物基因科技有限公司)；E.coli JM109 感受態(tài)細胞(BioDev 公司)；pMD18–T Vector、PCR 反應用的試劑(大連TaKaRa 公司)；Tryptone、Yeast Extract 和NaCl(Oxied 公司)；細菌微量生化反應管(杭州天和微生物試劑有限公司)；氨芐青霉素(哈爾濱制藥總廠)；其他常規(guī)試劑均為分析純。

1.4 菌種的篩選

稱取土壤樣品5g，加入到裝有5mL 蒸餾水的三角瓶中，制成土壤懸浮液。取1mL 懸浮液接種于改良的LB 液體培養(yǎng)基中，150 r/min 振蕩，富集培養(yǎng)18 h 后，向富集培養(yǎng)液中加入硝酸銀溶液，使硝酸銀終濃度為0.1 mmol/L，避光馴化48 h，分別逐級提高硝酸銀的濃度至0.2、0.3、0.5、0.7、1.0 mmol/L。進行多次富集與馴化后，取1.0 mmol/L的菌液，在LB 固體培養(yǎng)基上進行濃度梯度稀釋劃線分離，得到能在含1 mmol/L 硝酸銀的改良LB 培養(yǎng)基上存活的菌株，于4℃冰箱中保存，備用。

1.5 菌株的鑒定

1.5.1 常規(guī)鑒定

用透射電子顯微鏡觀察所獲得菌株的形態(tài)和大小，進行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色[12]。采用細菌微量生化反應管對細菌的伏普(V–P)反應、硝酸鹽培養(yǎng)基生長、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原和酪素分解[13–18]等生理生化試驗進行鑒定。

1.5.2 16SrDNA 序列分析

菌株基因組采用細菌DNA 提取試劑盒提取，以細菌總DNA 為模板，利用細菌通用引物(27 F(5'–AGAGTTTGATCCTGGCTCAG–3')和1492 R (5'–GGTTACCTGTTACGT–3')進行PCR 擴增。

PCR 反應體系：將10×PCR Buffer 5 μL、10 mmol/L 的dNTPs 1 μL、2.5 μmol/L 的上游和下游引物各4 μL、5 U/μLTaq 酶0.5 μL，DNA1 μL 模板混合，加去離子水至總體積50 μL。

PCR 反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸2min，30個循環(huán)；72℃保溫10min。4℃保存。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物的大小和特異性。PCR 產(chǎn)物純化后，用膠回收試劑盒回收目的片段，并與PMD18–T 連接，轉化E.coli JM109，然后在含有氨芐霉素(AMP)的培養(yǎng)基中挑取白色單菌落(陽性轉化子)進行PCR 擴增。將陽性克隆子送至上海生物工程公司進行測序，測序所獲序列信息提交GenBank 核酸數(shù)據(jù)庫，用BLAST 程序進行比對，搜索同源性較高的相關序列，采用MEGA5.2軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構建系統(tǒng)進化樹。進化樹分支穩(wěn)定性用 Bootstrap 分析，重復1 000次。

1.6 納米銀的合成及表征方法

刮取固體平板菌種一環(huán)，接入LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床上150 r/min 培養(yǎng)18 h，進行菌種活化。取5mL 活化好的菌株接入300mL 改良的LB 液體培養(yǎng)基中，于37℃恒溫搖床150 r/min 振蕩培養(yǎng)24 h。取198mL 細菌培養(yǎng)液，加入2mL 0.1 mol/L 的AgNO3溶液，使其Ag+終濃度為1 mmol/L，避光培養(yǎng)3 d。將培養(yǎng)液于14 000 r/min 離心10min，用蒸餾水洗沉淀3次，自然風干，得到納米銀顆粒。納米銀顆粒用X–射線衍射儀(XRD)進行表征，工作電壓40 kV，掃描速度為10o/min；利用透射電子顯微鏡(TEM)在80 kV 電壓下觀察納米銀的形貌及納米銀的大?。徊捎脽嶂胤治鰞x(TGA)對離心得到的納米銀顆粒沉淀物進行分析。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選結果

通過逐級提高硝酸銀的濃度，富集和馴化，篩選出了1 株能在含1 mmol/L 硝酸銀改良液體LB 培養(yǎng)基中存活的菌株，將其命名為zxw01。加入AgNO3避光培養(yǎng)后，圖1–c 中菌株的顏色由土黃色變?yōu)榧t棕色，而圖1–a 和圖1–b 中菌株的顏色無變化。這種明顯的顏色變化與金屬粒子的表面等離子體共振效應(SPR 效應)有關，據(jù)此，可初步判定菌株zxw01 有合成納米銀的能力。

圖1 添加硝酸銀前后菌株zxw01 的顏色變化 Fig.1 Color change of the zxw01 bacteria before and after AgNO3 added

2.2 菌株鑒定結果

2.2.1 菌落的形態(tài)及其生理、生化特征

由圖2 可以看出，菌體呈桿狀，大小為(1.23～1.78) μm ×(0.36～0.85) μm。

圖2 菌株zxw01 的電鏡照片 Fig.2 TEM image of zxw01

菌株zxw01 在LB 固體培養(yǎng)基上生長的菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，呈黃色，細菌革蘭氏染色為陽性，芽孢染色可見卵圓形芽孢，孢囊膨大，中生或近中生，鞭毛染色可觀察到菌株的鞭毛，光學顯微鏡暗視野中可觀察到該細菌能運動。

從表1 可知，該菌株不能利用D–木糖、乳糖、L–阿拉伯糖、蜜二糖、山醇、甘糖、肌醇、甘露醇、鼠李糖、山梨醇和乳糖，可以利用檸檬酸、葡萄糖、果糖、尿素、馬尿酸、麥芽糖和蔗糖，明膠液化、淀粉水解、過氧化氫酶、伏普(V–P )和硝酸鹽還原試驗結果均呈陽性，苯丙氨酸脫氨酶試驗結果呈陰性。參照《伯杰細菌手冊》和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》，可初步鑒定該菌為解淀粉酶芽孢桿菌。

表1 菌株zxw01 的生理生化試驗結果 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain zxw01

2.2.2 zxw01 的分子生物學鑒定結果

以菌株基因組DNA 為模板，以細菌16 SrDNA的通用引物進行RCR 擴增，對菌株的16 SrDNA 進行測序，得到1 514 bp 序列。將測序結果提交到GenBank，登錄號為KF 700242。用BLAST 程序將獲得的16 SrDNA 序列與GenBank 中的所有序列進行核苷酸同源性對比，采用MEGA5.2 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用自展法(Bootstrap)檢驗系統(tǒng)發(fā)育樹的可靠性，自展1 000次得到菌株zxw01 的系統(tǒng)進化樹(圖3)。由圖3 可見，菌株zxw01 與解淀粉酶芽孢桿菌屬形成一個族群，且同源性達99%以上。結合形態(tài)學、生理生化特征以及16 SrDNA 分析，最終將zxw01 鑒定為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )。

圖3 基于16SrDNA 序列同源性構建的系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.3 Phylogenetic tree of the bacteria strain based on 16 SrDNA sequenceshomology

2.3 納米銀的XRD 分析結果

由圖4 可以看出，在2θ 斜角為38.23°、44.56°、64.87°和77.48°處出現(xiàn)了明顯的特征性衍射峰，與JCPDS 卡 04–0783 上的數(shù)據(jù)(2θ 為 38.096°、44.257°、64.406°和77.452°)吻合，分別對應于立方晶系銀的(111)、(200)、(220)和(311)，說明該細菌在添加硝酸銀后合成了面心立方結構的納米銀顆粒，并且納米銀是無雜質的。

圖4 利用zxw01 培養(yǎng)液合成的納米銀XRD 衍射圖譜 Fig.4 XRD pattern of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.4 納米銀的TEM 分析結果

由圖5 可清楚地觀察到銀納米粒子的形態(tài)和粒徑大小，大部分為球形或近球形，粒徑大小為2～18 nm，平均粒徑為12.6 nm，粒徑分布窄且較均勻，具有較好的分散性，幾乎沒有團聚現(xiàn)象。

圖5 zxw01 培養(yǎng)液合成納米銀的TEM 圖譜 Fig.5 TEM image of AgNPs synthesized by the bacteria strain of zxw01

2.5 納米銀顆粒的熱重分析結果

Ag+終濃度為1 mmol/L 的培養(yǎng)液200mL 制備納米銀，最終離心后可獲得0.03g 的納米銀顆粒沉淀物。對沉淀物進行熱重分析的結果(圖6)表明，隨著加熱溫度的升高，納米銀顆粒的質量逐漸減少，當溫度上升到580℃時達到熱穩(wěn)定狀態(tài)，不再有質量損失。其原因在于離心后得到的納米銀顆粒沉淀中含有的水和有機物，這些水和有機物在加熱過程中不斷釋放，最后達到穩(wěn)定。熱穩(wěn)定狀態(tài)時得到的納米銀質量為納米銀顆粒沉淀物質量的58%，由此可知，納米銀的實際產(chǎn)量為0.017 4g(0.03×58%)，又知納米銀的理論產(chǎn)量為0.021 6g(0.2 (L)×1×10－3(mol/L)×108(g/mol))，因此，納米銀產(chǎn)率為80.6%(實際產(chǎn)量/理論產(chǎn)量)。

圖6 納米銀的熱重分析 Fig.6 Thermogravimetric analysis of silver nanoparticles

3 結論與討論

逐漸加大硝酸銀濃度進行富集與馴化，篩選得到1 株能還原制備納米銀的菌株zxw01。該菌株能在含1 mmol/L 硝酸銀的改良LB 液體培養(yǎng)基中存活，并且能使得添加硝酸銀的菌株培養(yǎng)液由土黃色變?yōu)樽丶t色，合成的納米銀是分散的，呈球形或近球形，粒徑為2～18 nm，納米銀產(chǎn)率為80.6%。經(jīng)個體形態(tài)特征鑒定、生理生化特征鑒定和16 SrDNA 序列分析，將該菌鑒定為解淀粉酶芽孢桿菌(Bacillus amyqueciens)。

目前，在同類研究中，用細菌制備納米銀比用真菌更具優(yōu)勢。細菌繁殖快，生長周期短，且關于細菌的發(fā)酵和遺傳改造經(jīng)驗比關于真菌的更為豐富，這有利于基因工程操作，可以利用基因工程技術，使特定的具有還原作用的酶以及起穩(wěn)定作用的蛋白大量表達，從而實現(xiàn)納米粒子的大規(guī)模制備，所以，細菌在納米銀合成領域具有發(fā)展?jié)摿?，有待進一步研究。

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