歐鰻脾和腎中黑色素巨噬細(xì)胞中心的形態(tài)學(xué) 與細(xì)胞化學(xué)研究

羅小春，梅景良，王全溪，鄧紅玉，溫亞萍

(福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350002)

黑色素巨噬細(xì)胞中心(melano-macrophage centers，MMCs)又稱為巨噬細(xì)胞聚集體(macrophage aggregates)或黑色素巨噬細(xì)胞聚集體(melanoma- crophage aggregations)，是含色素細(xì)胞的不連續(xù)聚集，主要存在于硬骨魚(yú)的造血組織和肝組織中[1–2]。黑色素巨噬細(xì)胞中心含有的不同色素，如鐵血黃素、黑色素、脂褐質(zhì)(或蠟樣色素)等，經(jīng)蘇木精–伊紅染色后可呈現(xiàn)金黃色、棕色、黑色等不同顏色[3–4]。這些特征性的色素使得MMCs 易于與其他細(xì)胞聚集體相區(qū)別[1]。MMCs 所含的各種色素可以通過(guò)普魯士藍(lán)染色法等組織化學(xué)染色進(jìn)行鑒別[5–6]。國(guó)外關(guān)于黑色素巨噬細(xì)胞中心的來(lái)源、結(jié)構(gòu)、功能和分布等方面的研究已有較多報(bào)道[7–12]，國(guó)內(nèi)這方面的報(bào)道相對(duì)較少[13–14]。鑒于目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)有關(guān)歐鰻黑色素巨噬細(xì)胞中心方面的研究報(bào)道，筆者對(duì)歐鰻脾臟、腎臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的組織化學(xué)和形態(tài)學(xué)進(jìn)行了探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

歐鰻于2014年4月購(gòu)自福州某歐鰻養(yǎng)殖場(chǎng)，雌雄兼有，其體表健康無(wú)病，個(gè)體大小接近，體重為(452.50±44.36)g，體長(zhǎng)為( 52.80±3.19) cm。

1.2 方法

迅速解剖歐鰻，取出脾臟、體腎組織，在相同部位取小塊組織，用多聚甲醛固定液固定24 h 后，用流水沖洗1 d，逐級(jí)乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成厚5 μm 的片。分別進(jìn)行HE 染色(蘇木精–伊紅染色)、Perls 法染色(普魯士藍(lán)染色，核固紅法)、Long Ziehl–Neelsen 法染色、Masson–Fontana法染色，干燥后用中性樹(shù)膠封片，Motic BA210 數(shù)碼顯微鏡進(jìn)行觀察。同時(shí)取小塊脾臟組織參照文獻(xiàn)[13]中的方法制作電鏡切片，用JEM–1010 透射電鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 歐鰻脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的顯微觀察結(jié)果

歐鰻脾臟表面覆蓋著一層極薄的纖維結(jié)締組織性被膜，被膜向脾實(shí)質(zhì)內(nèi)延伸，形成的脾小梁不明顯。脾髓中紅髓、白髓相混合，二者間無(wú)明顯分界。白髓主要由密集的淋巴細(xì)胞聚集而成，未見(jiàn)脾小結(jié)、動(dòng)脈周?chē)馨颓省＜t髓由脾索和脾竇構(gòu)成，歐鰻脾索不發(fā)達(dá)，基本不形成條索狀。

經(jīng)HE染色后，脾臟組織中聚集成團(tuán)的MMCs呈棕黃色或淡黃色，其中散在分布一些棕褐色斑塊。MMCs大小不一，形狀為圓形、橢圓形或不規(guī)則形，常位于血管周?chē)?，也有少?shù)分布于紅髓(圖1–A)?？梢?jiàn)部分MMCs直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞相聯(lián)系。MMCs周?chē)匆?jiàn)扁平細(xì)胞層包裹。高倍鏡下可見(jiàn)MMCs包含有衰老退化的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，其中的細(xì)胞有的是結(jié)構(gòu)較為完整的紅細(xì)胞或淋巴細(xì)胞，有的細(xì)胞的結(jié)構(gòu)則模糊不清。在高倍鏡下尚可見(jiàn)MMCs中分布有黑色或褐色的斑塊狀物質(zhì)。這些斑塊狀物質(zhì)密度不同，有些比較厚密，有些則比較稀薄透亮。

用Perls法染色后，脾臟組織中的MMCs有的可見(jiàn)大量的藍(lán)色斑塊、黑色斑塊和較少量的黃褐色斑塊，有的則以黑色斑塊和黃褐色斑塊為主，藍(lán)色斑塊少見(jiàn)。脾臟組織中尚可見(jiàn)大量散在分布的單個(gè)黑色素巨噬細(xì)胞，絕大多數(shù)呈藍(lán)色，極個(gè)別為黃褐色(圖1–B)。

經(jīng)Long Ziehl–Neelsen法染色后，MMCs的顏色主要呈褐色或棕褐色，脾臟組織其他基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核大多呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡藍(lán)色(圖1–C)。此外，脾臟組織可見(jiàn)個(gè)別單個(gè)黑色素巨噬細(xì)胞，高倍鏡下呈現(xiàn)為一到兩塊棕褐色斑塊。

經(jīng)Masson–Fontana法染色后，MMCs呈大小不一的黑色斑塊，有的連續(xù)分布，有的彌散分布；脾臟組織的其他細(xì)胞則被染成為紅色(圖1–D)。高倍鏡下可見(jiàn)散在分布的黑色素巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)為大小不同的黑色斑塊。

2.2 歐鰻腎臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的顯微觀察結(jié)果

歐鰻體腎主要由腎單位和擬淋巴組織構(gòu)成。腎單位由腎小體和腎小管組成；擬淋巴組織分布于腎單位間，主要由淋巴細(xì)胞和粒細(xì)胞構(gòu)成。

體腎組織中MMCs的形狀主要為圓形或橢圓形，HE染色后呈棕褐色(圖1–E)。MMCs大小不一，其周?chē)话銦o(wú)扁平細(xì)胞層包裹，極少數(shù)情況下可見(jiàn)被扁平細(xì)胞層部分包裹。MMCs主要分布在腎臟擬淋巴組織之間。腎臟邊緣面積較大的擬淋巴組織中MMCs分布尤為密集，但體積相對(duì)較小。高倍鏡下可見(jiàn)MMCs含有大量的色素斑塊沉著和少量衰老、退化的淋巴細(xì)胞。

經(jīng)Perls 法染色后，有的MMCs 中黑色斑塊豐富且大小不一，黃褐色斑塊和藍(lán)色斑塊較少(圖1–F)；有的MMCs 中黃色、棕褐色斑塊較多，藍(lán)色斑塊未見(jiàn)或極少見(jiàn)；有的MMCs 包含有豐富的深褐色斑塊和黑色斑塊，還有少量的灰黃色斑塊和藍(lán)色斑塊。腎臟組織中單個(gè)散在的黑色素巨噬細(xì)胞呈藍(lán)色，但極少見(jiàn)。

圖1 歐鰻脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的顯微觀察結(jié)果 Fig.1 Micrographs from the melano-macrophage centers of Anguilla anguilla

Long Ziehl–Neelsen 法染色時(shí)，MMCs 呈現(xiàn)為褐色、棕褐色的色素斑塊，其他腎臟組織細(xì)胞的細(xì)胞核染為藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)呈淡紅紫色(圖2–A)。高倍鏡下可見(jiàn)個(gè)別單個(gè)散在的黑色素巨噬細(xì)胞呈深褐色斑塊。

經(jīng)Masson–Fontana 法染色后，MMCs 呈大小不一的黑色色素沉著斑塊，有的聚集成團(tuán)分布，有的為不連續(xù)的的彌散分布。腎臟組織細(xì)胞核為紅色(圖2–B)。高倍鏡下單個(gè)黑色素巨噬細(xì)胞呈黑色斑塊。

圖2 歐鰻腎臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的顯微觀察結(jié)果 Fig.2 Micrographs and ultramicrographs from the melano-macrophage centers of Anguilla anguilla

未經(jīng)染色的脾臟和腎臟組織切片亦均可觀察到暗棕色的MMCs，但2 種組織中MMCs 所含色素斑塊的結(jié)構(gòu)不一樣，脾臟MMCs 中色素斑塊較為松散，大部分顏色較淡，少部分顏色較暗，而腎臟MMCs 中的色素斑塊結(jié)構(gòu)較為密實(shí)，顏色較深。在脾臟組織中尚可見(jiàn)散在分布的單個(gè)淡棕色黑色素巨噬細(xì)胞，腎臟中極少見(jiàn)。2 種組織的其他基質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)有色素沉著(圖2–C，D)。

2.3 歐鰻脾臟黑色素巨噬細(xì)胞中心的超微結(jié)構(gòu)

在電鏡下觀察，歐鰻脾臟中單個(gè)散在黑色素巨噬細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)與MMCs 中黑色素巨噬細(xì)胞的基本相似，胞體均較大，呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形；胞核大多偏位，呈橢圓形或不規(guī)則形狀，有的胞核因受到嗜染顆粒的擠壓而呈鋸齒狀，異染色質(zhì)主要沿核膜內(nèi)側(cè)周邊分布，核中央的異染色質(zhì)呈斑塊狀分布，未見(jiàn)核仁；胞質(zhì)淡染，胞質(zhì)中圓形或不規(guī)則形的大型溶酶體較多，且在這些溶酶體中可見(jiàn)各種處于不同降解階段的細(xì)胞碎片。此外，在胞質(zhì)中尚可見(jiàn)2 種不同類型的嗜染顆粒，一種顆?；|(zhì)電子濃密，個(gè)體大小不一，呈圓形或長(zhǎng)橢圓形，數(shù)量較少(圖2–E)；另一種顆粒極度濃染，個(gè)體大小較均一，呈圓形或橢圓形，數(shù)量較多，往往可充斥整個(gè)細(xì)胞胞質(zhì)(圖2–F)。胞質(zhì)中還分布有少量線粒體，其他細(xì)胞器少見(jiàn)。

3 結(jié)論與討論

MMCs主要存在于變溫脊椎動(dòng)物的脾、腎和肝組織中，在鰓、腦和性腺組織中也有發(fā)現(xiàn)[15]。關(guān)于一些硬骨魚(yú)的MMCs已有較多研究[1–4,16]。HE染色時(shí)，MMCs呈棕黃色。MMCs的形態(tài)結(jié)構(gòu)主要有2種類型：一種是結(jié)構(gòu)較為松散，分布面積較大，包含的細(xì)胞數(shù)量多少不一；另一種是結(jié)構(gòu)較為密實(shí)，細(xì)胞常聚集成團(tuán)分布，其外形多呈球形，其中央是一些已衰老退化的細(xì)胞，細(xì)胞輪廓較模糊，有的細(xì)胞核已降解[17]。普遍認(rèn)為MMCs在體內(nèi)各種外源性和內(nèi)源性物質(zhì)的降解和再循環(huán)中發(fā)揮重要作用，如吸收性腺中的閉鎖卵泡細(xì)胞、退化精子和非特異性組織[9]，儲(chǔ)藏來(lái)自細(xì)胞本身的磷脂，吞噬紅細(xì)胞作用所產(chǎn)生的鐵[18–20]，免疫反應(yīng)遞呈抗原[1]及作為生發(fā)中心的進(jìn)化前體物[21]等。MMCs的數(shù)量、大小、分布因魚(yú)種類[5]、器官[22]、年齡[23]或者營(yíng)養(yǎng)及健康狀態(tài)[24]不同而不同。水體環(huán)境的改變, 尤其是水體中甲基汞[25]、銅[26]、鎳和鉻[27]、鎘[28–29]、除草劑特丁津[30]、汞[31]等的含量增加，也可導(dǎo)致MMCs數(shù)量和大小發(fā)生變化，因此，魚(yú)體MMCs的變化，不僅可作為魚(yú)體本身健康狀況的良好指標(biāo)，也可作為水域環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)的敏感指標(biāo)[11,32]。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，歐鰻肝臟中MMCs 的分布極少，故本研究中僅針對(duì)脾臟和腎臟中MMCs 的形態(tài)學(xué)和組織化學(xué)進(jìn)行初步研究。研究中發(fā)現(xiàn)歐鰻MMCs 的形態(tài)結(jié)構(gòu)主要有2 種類型：一種是結(jié)構(gòu)較為松散；另一種是結(jié)構(gòu)較為密實(shí)、緊湊，呈圓形或橢圓形。歐鰻脾臟中的MMCs 較常分布在血管旁，而體腎中的MMCs 很少靠近血管分布，這一現(xiàn)象表明，脾臟MMCs 的形成及其清除異物功能的發(fā)揮很可能與它們和血管系統(tǒng)在空間上的聯(lián)系密切相關(guān)，而體腎MMCs 則與外來(lái)物質(zhì)的捕獲和遷移似乎沒(méi)有直接關(guān)系[1,7–9]。脾臟的MMCs 周?chē)匆?jiàn)被膜層包裹，這與 Leknes[8]報(bào)道的劍尾魚(yú)脾臟MMCs 周?chē)鷽](méi)有細(xì)胞層包裹相似。腎臟MMCs 多為聚集成團(tuán)分布，有的MMCs 則為不連續(xù)的彌散性分布，其周?chē)话銦o(wú)扁平細(xì)胞層包裹，極少數(shù)情況下可見(jiàn)被扁平細(xì)胞層部分包裹。該現(xiàn)象與Leknes[8]報(bào)道的劍尾魚(yú)腎臟MMCs 周?chē)鷽](méi)有細(xì)胞層包裹不一樣，但與Meseguer 等[7]的研究結(jié)果一致。

歐鰻脾臟和腎臟MMCs中所含色素在未經(jīng)任何染色處理時(shí)呈現(xiàn)為暗棕色，這與Meseguer等[7]的報(bào)道相符，且他們認(rèn)為這種暗棕色物質(zhì)是黑色素，因?yàn)楫?dāng)他們用過(guò)氧化氫處理這種物質(zhì)后發(fā)現(xiàn)褪色。MMCs中所含各種色素經(jīng)Perls法普魯士藍(lán)染色后，含鐵血黃素呈現(xiàn)亮藍(lán)色，黑色素為黑色，脂褐質(zhì)則為棕黃色[5–6,33]；Long Ziehl–Neelsen法僅對(duì)脂褐質(zhì)和蠟樣色素進(jìn)行特異性染色[15]，使其呈現(xiàn)棕黑色；Masson–Fontana法僅對(duì)黑色素進(jìn)行染色[7,15]，使其呈現(xiàn)為黑色，因此，通過(guò)Perls染色法再輔以其他特殊組織化學(xué)方法，可以較好地對(duì)MMCs中存在的各種色素進(jìn)行鑒別。本研究中對(duì)歐鰻脾臟和腎臟的組織切片分別進(jìn)行如上3種組織化學(xué)方法的染色，從顯色結(jié)果可知，歐鰻脾臟和腎臟MMCs均含有血鐵黃素、黑色素和脂褐質(zhì)，但在不同的MMCs中，這些色素的含量是不同的。脾臟MMCs所含色素成分可分為2種情況，即絕大部分MMCs含有大量的血鐵黃素、中等量的黑色素和少量的脂褐質(zhì)，少數(shù)MMCs的黑色素和脂褐質(zhì)含量較多，血鐵黃素含量較少。同時(shí)，在脾臟觀察到的大量散在分布的單個(gè)黑色素巨噬細(xì)胞的主要成分是血鐵黃素，極個(gè)別為脂褐質(zhì)。腎臟MMCs中所含色素成分可分為3種情況：第1種是MMCs含有大量的黑色素，而含血鐵黃素和脂褐質(zhì)較少；第2種是MMCs主要含有脂褐質(zhì)，而含血鐵黃素和黑色素極少；第3種情況是MMCs含有大量的脂褐質(zhì)、中等量的黑色素和少量的血鐵黃素。

綜合分析后可知，歐鰻脾臟MMCs所含色素成分以血鐵黃素為主，同時(shí)也含有黑色素和脂褐質(zhì)；腎臟MMCs則以含黑色素和脂褐質(zhì)為主。脾臟和腎臟MMCs中各種色素的分布特點(diǎn)不同，表明這2種臟器中MMCs的功能很可能是相異的。歐鰻肝臟MMCs的數(shù)量極少，而脾臟MMCs的數(shù)量較多，且黑色素巨噬細(xì)胞不論是聚集形成MMCs還是單個(gè)散在，其所含色素均以血鐵黃素為主，表明歐鰻脾臟MMCs在鐵代謝過(guò)程中發(fā)揮了主要作用。結(jié)合歐鰻脾臟MMCs的電鏡觀察結(jié)果可以推測(cè)，脾臟MMCs也參與了衰老細(xì)胞降解產(chǎn)物的處理過(guò)程。因?yàn)镸MCs中的黑色素與魚(yú)體有氧呼吸期間NADPH的氧化有關(guān)，并且在轉(zhuǎn)化成H2O2的過(guò)程中對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，脂褐質(zhì)則與組織細(xì)胞降解有關(guān)，因此，由歐鰻腎臟MMCs所含色素以黑色素和脂褐質(zhì)為主可推測(cè)，歐鰻腎臟MMCs的功能是有異于脾臟MMCs 的功能的。

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