雞蛋蛋清和蛋白多酶水解工藝的優(yōu)化

霍永久，劉正旭，金曉君，趙國(guó)琦

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 蘇州天馬集團(tuán)天吉生物制藥有限公司，江蘇 蘇州 215101)

雞蛋蛋清、蛋白中蛋白質(zhì)含量高達(dá)13% ～15%，富含多種對(duì)人體有益的蛋白質(zhì)。雞蛋蛋清、蛋白所含人體必需氨基酸的種類(lèi)多，配比平衡性好，是生物利用效率最高的一類(lèi)蛋白質(zhì)[1]。雞蛋蛋清、蛋白質(zhì)的黏度大，熱穩(wěn)定性差，且含有卵類(lèi)黏蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白和溶菌酶等過(guò)敏性蛋白，其應(yīng)用范圍因此而受到限制[2]。水解可以降低蛋清、蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量，減小致敏性，生成的多肽混合物更有利于人體吸收[3–4]，與原蛋白相比，其水解產(chǎn)物的黏度、溶解性及起泡性等功能特性得到了改善，且具有抗氧化、降血脂、降血壓等生理活性[5–6]。單酶水解雞蛋蛋清、蛋白存在水解度不高、蛋白殘留量高、蛋清肽得率低和易產(chǎn)生苦味肽等缺點(diǎn)，因而，研究者嘗試用多酶水解來(lái)解決上述問(wèn)題[7–8]。由于單一蛋白酶水解蛋白質(zhì)具有專(zhuān)一性，所以，蛋白酶的單一使用使底物中相應(yīng)的肽鍵斷裂，聯(lián)合使用則因?yàn)槊缸饔梦稽c(diǎn)之間產(chǎn)生互補(bǔ)而降低蛋白殘留量，提高水解度，增加蛋清、蛋白肽得率。筆者研究protamex、neutrase、flavourzyme組合和alcalase、flavourzyme組合水解蛋清、蛋白的水解物的性能，將能降低水解液苦味的端肽酶Flavourzyme作為水解蛋清、蛋白最終加入的酶，以?xún)?yōu)化多酶同時(shí)水解及分階段水解的參數(shù)，旨在為蛋清、蛋白多酶水解工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雞蛋為市售鮮雞蛋。

商業(yè)酶protamex、neutrase 0.8 L、alcalase 2.4 L FG和flavourzyme 500MG購(gòu)自諾維信公司。

所用試劑為濃硫酸、硫酸銅、無(wú)水硫酸鉀、氫氧化鈉、硼酸、鹽酸、甲基紅–溴甲酚綠指示劑、甲醛、30%過(guò)氧化氫等。

1.2 主要儀器與試劑

主要儀器：HS–4(B)型恒溫浴槽(成都儀器廠(chǎng))、722 可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海菁華科技儀器有限公司)、KDN–04B 消化爐(上海新嘉電子有限公司)、KDN–04B 定氮儀(上海新嘉電子有限公司)、SHA–C水浴恒溫振蕩器(常州國(guó)華電器有限公司)、5810R 離心機(jī)(德國(guó)艾本德(Eppendorf)股份公司)、79–2 磁力加熱攪拌器(常州國(guó)華電器有限公司)、PB–21 pH計(jì)(德國(guó)Sartorius 賽多利斯)、Waters 600 高效液相色譜儀(配備2487 紫外檢測(cè)器、Empower 工作站，美國(guó)Waters 公司)、Ag1100 安捷倫液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司)。

1.3 方法

1.3.1 水解前處理

將新鮮雞蛋洗凈，用75%的乙醇棉球擦拭蛋殼，使用漏勺分離蛋清、蛋黃，用滅菌蒸餾水將蛋清稀釋至一定濃度(濃度以V蛋清∶V水表示)，95℃加熱變性20min，用HCl 或NaOH 調(diào)節(jié)至一定pH供水解。

1.3.2 水解

在反應(yīng)溫度條件下水浴預(yù)熱后，加入所需酶，于恒溫水浴振蕩器(120 r/min)中進(jìn)行水解反應(yīng)。水解反應(yīng)期間用pH 計(jì)監(jiān)測(cè)蛋清液的pH，并通過(guò)滴加NaOH 溶液來(lái)調(diào)節(jié)pH，使pH 保持在一定值。于設(shè)置的水解時(shí)間收集蛋清、蛋白水解液，置沸水浴中滅活酶20min，使水解反應(yīng)終止。水解方式分為2 種：

1) 將最適溫度和pH 相近的蛋白酶(protamex、neutrase、flavourzyme 3 種酶，下文用“P+N+F”表示)同時(shí)加入進(jìn)行水解，水解溫度設(shè)定為55℃，酶總量設(shè)定為6%，針對(duì)水解時(shí)間、pH、酶比例和蛋清濃度4個(gè)因素進(jìn)行正交設(shè)計(jì)。

2)對(duì)于最適溫度和 pH 相差較大的蛋白酶alcalase 和flavourzym(下文用“A–F 表示”)，在alcalase 的最適溫度(55 )℃和最適pH(7.5)條件下反應(yīng)一定時(shí)間后，將反應(yīng)底物溶液調(diào)至flavourzyme 的最適溫度(55 )℃和最適pH(6.0)，再加入flavourzym進(jìn)行水解。alcalase、flavourzyme 分階段水解蛋清、蛋白的酶總用量設(shè)定為6%，針對(duì)蛋清濃度、酶比例和水解時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

1.3.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1) 水解度的測(cè)定?？偟繙y(cè)定采用凱氏定氮法，由凱式半自動(dòng)定氮儀測(cè)得[9]。氨基氮含量測(cè)定由甲醛滴定法測(cè)得[10]。

水解度=氨基氮含量/總氮含量。

蛋白殘留率=離心沉淀物的含氮量/總氮含量。

2) 蛋清、蛋白水解物相對(duì)分子質(zhì)量的測(cè)定。將蛋清、蛋白水解物溶液經(jīng)0.45 μm微孔過(guò)濾膜過(guò)濾后上TSKgel 2000色譜柱，以細(xì)胞色素C(MW12500)、抑肽酶(MW6500)、桿菌酶(MW1450)、乙氨酸–乙氨酸–酪氨酸–精氨酸(MW451)和乙氨酸–乙氨酸–乙氨酸(MW189)為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定水解物的相對(duì)分子質(zhì)量。

高效液相色譜條件：色譜柱TSKgel 2000，7.8 mm×300 mm；柱溫30℃；流速0.5mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm；流動(dòng)相乙腈、水、三氟乙酸的體積比為45.00∶55.00∶0.01。標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖(相對(duì)分子質(zhì)量流出曲線(xiàn))和GPC 校正曲線(xiàn)分別見(jiàn)圖1和圖2。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品高效液相色譜圖 Fig.1 High Performance Liquid chromatogram of standard substance

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量分布的GPC 校正曲線(xiàn) Fig.2 GPC calibration curve of molecular weight distribution from standard substance

3) 氨基酸組成分析?？偘被峤M成分析：將蛋清、蛋白水解液樣品溶解在6 mol/L鹽酸中，110℃水解24 h，蒸干鹽酸，定容得水解液。用Agilen 1100高效液相分析儀測(cè)定水解液中的氨基酸組成。

高效液相色譜條件：C18柱，4.0 mm×125 mm；柱溫40℃；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)338 nm和262 nm(Pro)；流動(dòng)相A為20 mmol/L的醋酸鈉液，流動(dòng)相B為20 mmol/L的醋酸鈉液和甲醇及乙腈，其體積比為1∶2∶2。

游離氨基酸組成分析：將蛋清、蛋白水解液樣品與10%三氯乙酸溶液等體積混合，在室溫下靜置2 h，經(jīng)雙層濾紙過(guò)濾后，取1mL于1.0×104g離心10min。用在線(xiàn)自動(dòng)衍生化用Agilent 1100高效液相分析儀測(cè)定水解液(上清液)中氨基酸組成。

2 結(jié)果與分析

2.1 P+N+F 水解雞蛋蛋清、蛋白的試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表1中的極差分析結(jié)果可知，在55℃條件下，水解時(shí)間、pH、酶比例、蛋清濃度對(duì)水解反應(yīng)的影響依次減小。3種酶同時(shí)水解雞蛋蛋清、蛋白的最優(yōu)組合為A2B2C2D3，即水解時(shí)間為6 h、pH為6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5。在此條件下的水解度達(dá)53.24%。

表1 P+N+F水解蛋清、蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 1 Orthogonal results of simultaneous hydrolyzing egg white protein using P+N+F

2.1.2 水解產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布

由圖3和表2可見(jiàn)，在55℃條件下，當(dāng)水解時(shí)間為6 h、pH為6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5時(shí)，protamex、neutrase、flavourzyme同時(shí)水解水解物的相對(duì)分子質(zhì)量大部分在500以下，即水解物主要以短肽的形式存在，其中相對(duì)分子質(zhì)量為180 ～300和300 ～500的分別為68.06%和18.65%。

圖3 P+N+F 水解蛋清、蛋白產(chǎn)物的高效液相色譜圖 Fig.3 High Performance Liquid chromatogram of enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

表2 P+N+F 水解蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布 Table 2 Distribution of relative molecular weight from enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

2.1.3 產(chǎn)物的總氨基酸組成

由表3可見(jiàn)，在2.1.1最優(yōu)水解條件下，水解物的總游離氨基酸含量為7.404 6mg/mL，占總氨基酸含量的44.02%，即水解產(chǎn)物中有將近50%的成分是以游離氨基酸的形式存在。

表3 P+N+F蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸組成 Table 3 Amino acid composition of original egg white protein and enzymolysis product of egg white protein using P+N+F

2.2 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白的試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表6極差分析可知，影響水解反應(yīng)的主次因素依次為酶比例、蛋清濃度、水解時(shí)間，最優(yōu)組合為A3B1C2，即蛋清濃度1∶5，酶比例為1∶2，水解時(shí)間各為3 h。在此條件下的水解度可達(dá)45.05%。

表4 A–F水解雞蛋蛋清、蛋白的正交試驗(yàn)結(jié)果 Table 4 Orthogonal results of staging enzymolysis of egg white protein using A–F

2.2.2 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布

A–F水解雞蛋蛋清、蛋白，在蛋清濃度1∶5、酶比例1∶2、水解時(shí)間各3 h條件下水解物的相對(duì)分子質(zhì)量分布曲線(xiàn)如圖4所示。

圖4 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的高效液相色譜圖 Fig.4 High Performance Liquid chromatogram of staging enzymolysis product of egg white protein using A–F

由表5可知，alcalase、flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量大部分集中在1 000以下，其中≤180、＞180 ～300、＞300 ～500所占的比例分別為11.89%、67.65%、16.05%。

表5 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量 Table 5 Distribution of relative molecular weight from enzymolysis product of egg white protein using A–F

2.2.3 A–F 水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的氨基酸組成

在2.2.1的最優(yōu)條件下，A–F水解物的總游離氨基酸含量為6.819 3mg/mL，占總氨基酸含量的38.01%，即水解產(chǎn)物中有近40%的成分是以游離氨基酸的形式存在。

表6 A–F 雞蛋蛋清、蛋白水解物和水解前蛋清、蛋白的氨基酸組成 Table 6 Amino acid composition of original egg white protein and enzymolysis product of egg white protein using A–F

表6 (續(xù))

3 結(jié)論與討論

蛋白水解物的苦味主要來(lái)自于水解物中的疏水性多肽[11]。如果用于水解的蛋白酶是非專(zhuān)一性的內(nèi)切酶，那么它們對(duì)蛋白原料的酶切作用是隨機(jī)的，無(wú)論采用何種水解條件都會(huì)或多或少產(chǎn)生游離氨基酸，且隨著水解度的提高，蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水性氨基酸末端大量游離出來(lái)，小肽末端的疏水性氨基酸殘基也逐漸暴露，水解產(chǎn)物的苦味越重。呈苦味的氨基酸主要有亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、色氨酸、精氨酸、苯丙氨酸。這些疏水性氨基酸殘基在水解液中的比例越高，苦味可能越大?？嚯囊彩堑扒?、蛋白水解物產(chǎn)生苦味的原因之一?？刂苹蛳鞍姿庖嚎辔兜姆椒òㄟx擇性分離法、掩蓋法、類(lèi)蛋白反應(yīng)和酶法處理。酶法水解過(guò)程易于控制，效率高，且條件溫和，不會(huì)使多肽的營(yíng)養(yǎng)成分丟失，不改變多肽的重要特性。肽鏈端解酶(端肽酶)是酶法處理中主要的酶類(lèi)。肽鏈內(nèi)切酶是酶法處理中的另一種酶類(lèi)，從肽鏈的內(nèi)部將肽鏈裂開(kāi)。flavourzyme兼具內(nèi)外肽酶的活性，將其用于水解不僅能產(chǎn)生端肽酶的外切效應(yīng)，還能產(chǎn)生美拉德反應(yīng)，生成濃香的風(fēng)味物質(zhì)，使水解液的苦味大大降低。

將flavourzyme和其他蛋白酶聯(lián)合水解不僅能促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶出，提高氮的回收率[12]，而且可有效水解苦味肽，減輕甚至消除苦味，獲得苦味值低、溶解性好的蛋白水解產(chǎn)物。吳暉等[8]發(fā)現(xiàn)，蛋清水解專(zhuān)用蛋白酶與堿性蛋白酶alcalase AF 2.4 L、堿性蛋白酶alcalase AF 2.4 L與胰蛋白酶組合水解鴨蛋蛋清、蛋白的效果較好，在水解8 h后水解度可達(dá)26.2%和26.6%，明顯優(yōu)于其單酶的水解效果。萬(wàn)麗娜等[10]發(fā)現(xiàn)flavourzyme修飾后的水解液苦味很小，接受度較高。毛善勇等[13]以牛肉為原料，先用protamex在其優(yōu)化條件下水解6 h，再用flavourzyme在其優(yōu)化條件下水解6 h，所得產(chǎn)物的水解度達(dá)24.26%，比protamex 單酶水解牛肉蛋白的水解度提高了11.69%。

本試驗(yàn)中，protamex、neutrase、flavourzyme同時(shí)水解雞蛋蛋清、蛋白的水解度達(dá)53.24%，比其單獨(dú)水解的水解度分別提高了45.84%、49.53%和14.49%；alcalase、flavourzyme分階段水解的水解度達(dá)45.05%，比其單獨(dú)水解的水解度分別提高了26.32%和6.3%。多酶(分步)水解產(chǎn)物的水解度大幅度增高，主要是因?yàn)閒lavourzyme氨基肽酶的作用，可選擇性從多肽和蛋白質(zhì)N–端水解釋放氨基酸，使水解液中氨基氮明顯上升[14]。由于不同蛋白酶的作用位點(diǎn)不同，采用多酶復(fù)合水解可產(chǎn)生互補(bǔ)效應(yīng)，能進(jìn)一步提高水解度和肽的得率。筆者發(fā)現(xiàn)protamex和neutrase單酶水解的水解度低，neutrase單酶水解的蛋白殘留率高，將二者同時(shí)與蛋清、蛋白作用能提高水解度，還能改善水解液的風(fēng)味。alcalase是內(nèi)切酶，用其水解雞蛋蛋清、蛋白所得的水解液苦味值較大，在alcalase水解一段時(shí)間后添加flavourzyme可使苦味值大大降低。Cigic等[12]發(fā)現(xiàn)alcalase和flavourzyme分階段水解有效降低了雞蛋清水解液的苦味，并提高了水解度。

本試驗(yàn)中，protamex、neutrase、flavourzyme同時(shí)水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量分布主要集中在500以下，其中相對(duì)分子質(zhì)量＞180 ～300和＞300 ～500 所占比例分別為68.06%和18.65%。alcalase、flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量主要分布在1 000以下，其中＞180 ～300和＞300 ～500所占的比例分別為67.65%、16.05%?？梢钥闯?，多酶水解蛋清、蛋白產(chǎn)物主要以短肽形式存在。短肽有利于人體吸收，致敏性更低，還可提供抗氧化、降血壓、抗菌、降血脂等生物活性，有擴(kuò)大蛋清應(yīng)用范圍的潛力[15]。protamex、neutrase、flavourzyme同時(shí)水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量為7.404 6mg/mL，占總氨基酸含量的44.02%；alcalase、flavourzyme分階段水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量為6.819 3mg/mL，占總氨基酸含量的38.01%。可見(jiàn)，多酶水解產(chǎn)物總氨基酸中，游離氨基酸所占比例較大，在3種酶同時(shí)水解的條件下所占比例約達(dá)50%。楊萬(wàn)根等[16]利用單酶alcalase 2.4 L堿性蛋白酶和protease N蛋白酶水解蛋清、蛋白，得到的總游離氨基酸含量分別為6.429、4.193mg/mL。本試驗(yàn)中多酶水解產(chǎn)物的總游離氨基酸含量與此相比均有明顯提高。另外，protamex、neutrase、flavourzyme 3種酶同時(shí)水解物總氨基酸中7種必需氨基酸的含量為43.56%，Alcalase、Flavourzyme分階段水解物總氨基酸中7種必需氨基酸的含量為42.68%，均略高于酶解前蛋清、蛋白中7種必需氨基酸的含量(42.41%)。

通過(guò)綜合分析，由本試驗(yàn)結(jié)果可得到如下結(jié)論：1) protamex、neutrase和flavourzyme同時(shí)水解雞蛋蛋清、蛋白的優(yōu)化條件為水解時(shí)間為6 h、pH 6.5、酶比例為1∶1∶2、蛋清濃度為1∶5，在此條件下水解6 h的水解度達(dá)53.24%，產(chǎn)物中相對(duì)分子質(zhì)量300以下的比例達(dá)68.06%，游離氨基酸比例達(dá)44.02%。2) alcalase和flavourzyme分階段水解雞蛋蛋清、蛋白的優(yōu)化條件為蛋清濃度1∶5、酶比例為1∶2、水解時(shí)間各3 h，在此條件下的水解度達(dá)45.05%。產(chǎn)物相對(duì)分子質(zhì)量大部分集中在500以下，≤180、＞180 ～ 300和＞300 ～500所占的比例分別為11.89%、67.65%、16.05%，游離氨基酸比例達(dá)38.01%。

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