整合素αvβ3抑制劑RGDfv對人骨肉瘤F5M2細胞系增殖及凋亡的影響

王民，馬照雨，王瑩，劉建新，韓學哲

·臨床論著·

整合素αvβ3抑制劑RGDfv對人骨肉瘤F5M2細胞系增殖及凋亡的影響

王民，馬照雨，王瑩，劉建新，韓學哲

（西安交通大學第一附屬醫(yī)院骨外科，西安，710061）

目的 研究整合素αvβ3抑制劑RGDfv對骨肉瘤細胞增殖及凋亡的影響。方法 通過MTT法檢測不同濃度RGDfv序列肽對F5M2細胞生長增殖的抑制作用；通過Western blot方法觀察經RGDfv誘導48 h的F5M2細胞中凋亡蛋白cleaved Caspase-3的表達。結果 MTT法檢測結果顯示經不同濃度RGDfv序列肽處理的F5M2細胞增殖受到抑制，OD值明顯減少，并且呈濃度及時間依賴性（P<0.05 or 0.01）；RGDfv處理后的F5M2細胞中，隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達量也較對照組明顯增加（P<0.05）。結論 RGDfv序列肽能抑制F5M2細胞的增殖，并通過依賴于Caspase-3的通路誘導骨肉瘤F5M2細胞凋亡。

骨肉瘤，整合素，細胞增殖，細胞凋亡

整合素是一類細胞膜表面的糖蛋白受體家族分子，介導腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移以及腫瘤血管的形成[1]。整合素αvβ3在骨肉瘤中高表達，而在良性骨腫瘤及正常骨組織中不表達，抑制整合素αvβ3能否影響骨肉瘤細胞的增殖和凋亡還不清楚。

本試驗研究整合素αvβ3抑制劑RGDfv序列肽對F5M2細胞生長增殖的抑制作用，并探索對骨肉瘤細胞中凋亡因子caspase-3的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞系 成骨肉瘤細胞系F5M2由第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院全軍骨科中心暨全軍骨腫瘤研究所提供。

1.2 主要試劑及藥物 整合素αvβ3抑制劑RGDfv購自Enzo life science公司；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清購自杭州四季青生物制品公司；胰蛋白酶購自Hyclone公司；Western blot試劑盒購自西安晶彩生物科技有限公司；Caspase-3免抗人多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司。其它生化試劑：青鏈霉素混合液、Tris堿、疊氮鈉、二甲苯、瓊脂、瓊脂糖、甲醇及異丙醇等為進口或國產分裝試劑。

1.4 MTT實驗 接種細胞：取指數生長期的F5M2細胞，經胰酶消化并計數，調整細胞密度為2.5×104個/ ml。接種于96孔板，每孔200 ul（約5×103個細胞）。待細胞完全貼壁后，更換含有不同濃度RGDfv的培養(yǎng)液，實驗分5組：RGDfv組，加200 ul含不同濃度RGDfv的培養(yǎng)液（20 ug/ml、30 ug/ml、40 ug/ml、50 ug/ml）；空白對照組，在200 ul DMEM培養(yǎng)液加入10 ul的PBS。每組5復孔。細胞分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，加入20 ul的MTT（5 mg/ml），繼續(xù)培養(yǎng)4 h后吸取培養(yǎng)液，每孔加入150 ul DMSO溶解結晶，充分振蕩10 min，用酶標儀測定各孔在490 nm的光吸收值（OD值）。

1.5 Western blot檢測 caspase-3的表達 選擇RGDfv培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后的細胞進行Western blot實驗。用細胞裂解液裂解細胞后，取30 ug細胞總蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，按濕轉法將電泳產物轉移到NC膜，5%脫脂奶粉4℃封閉2 h，滴加一抗（1：200）4℃過夜，選擇Tubulin作為內參。TTBS洗膜10 min×4次，滴加二抗（1：3000）37℃孵育2 h，按試劑盒說明進行顯色，凝膠成像儀采集圖像，并運用Image J圖像軟件計算灰度。

1.6 統(tǒng)計學方法 計量數據采用均數±標準差記錄，采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采t檢驗。

2 實驗結果

2.1 不同濃度的RGDfv對F5M2細胞生長的抑制作用 與對照組相比較，RGDfv對F5M2細胞具有抑制作用（P<0.05 or 0.01），而且其抑制作用呈濃度和時間依賴性。不同濃度和不同時間的RGDfv處理對F5M2細胞OD值影響見圖1。

2.2 Western blot檢測F5M2細胞caspase-3的表達不同濃度RGDfv組的骨肉瘤細胞F5M2中，均有caspase-3的表達（圖2.A），且隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達量也隨之增加（圖2. B）（P<0.05）。

圖1 不同濃度和不同時間的RGDfv處理對F5M2細胞生長的抑制作用 P<0.05，*P<0.01

圖2 Western blot檢測不同濃度RGDfv對F5M2細胞cleaved Caspase-3的表達的影響A：cleaved Caspase-3表達條帶，B：cleaved Caspase-3表達量統(tǒng)計柱形圖。

3 討論

整合素是一類細胞膜表面的糖蛋白受體家族分子。對細胞和細胞外基質，細胞與細胞之間的粘附起介導作用。整合素所介導的粘附作用可調節(jié)多種細胞功能，包含細胞凋亡、細胞粘附與遷移、細胞增殖和淋巴細胞歸巢等。

整合素αvβ3在組織內的分布具有時相性和特異性，在腫瘤新生血管及炎癥組織的血管新生內皮細胞，整合素αvβ3有高水平表達；一些浸潤性腫瘤細胞，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌、膀胱癌等也有整合素αvβ3的表達。早期的大量體外研究表明，整合素αvβ3對腫瘤新生血管具有促進作用，通過抑制整合素功能可以明顯減少腫瘤新生血管的產生[2，3]。并且通過抑制整合素還對腫瘤細胞的侵襲能力產生明顯的抑制。因此以整合素為靶點的腫瘤治療方法，成為了研究熱點。但是隨著整合素抑制劑逐步的進入臨床試驗后，研究者們發(fā)現，整合素抑制劑除了對少部分腫瘤起抑制作用（如對神經膠質瘤有明顯抑制作用[4-6]），目前沒用明確的證據表明其他類型的腫瘤也同樣有效[7-10]。因此以整合素αvβ3為靶點的治療方案還需進一步的研究。整合素αvβ3在骨肉瘤中的研究主要集中在其對腫瘤血管的作用及其對腫瘤侵襲性的研究，而整合素αvβ3對腫瘤細胞凋亡影響的研究較少，因此本部分試驗主要研究整合素αvβ3抑制劑對骨肉瘤細胞凋亡的影響。

本研究的MTT結果提示，用RGDfv抑制整合素αvβ3可以抑制膠質瘤細胞的增殖。在凋亡過程中，Caspase-3是關鍵的效應分子。Caspase-3平時是以pro-Caspases-3這種未活化態(tài)的形式存在于細胞中，當凋亡通路激活，pro-Caspases-3可被切割形成cleaved caspase-3（17kD）活化形態(tài)。實驗中通過采用Western blot方法，檢測RGDfv處理48 h后細胞cleaved Caspase-3的表達，發(fā)現在不同濃度RGDfv組的骨肉瘤細胞F5M2中，均有cleaved Caspase-3的表達，且在一定濃度條件下隨著RGDfv濃度的升高，cleaved Caspase-3的表達量也隨之增加。這些結果表明整合素αvβ3 RGDfv序列肽能抑制骨肉瘤細胞的增殖，并通過依賴于Caspase-3的通路誘導骨肉瘤F5M2細胞凋亡。

[1] Ginsberg MH，Partridge A，Shattil SJ.Integrin regulation[J].Curr Opin Cell Biol，2005，17（5）：509-516.

[2] Rhee SH,Han I,Lee MR,et al.Role of integrin-linked kinase in osteosarcoma progression[J].J Orthop Res，2013，31（10）:1668-1675.

[3] Tsagaraki I，Tsilibary EC，Tzinia AK.TIMP-1 interaction with αvβ3 integrin confers resistance to human osteosarcoma cell line MG-63 against TNF-α-induced apoptosis[J].Cell Tissue Res，2010，342（1）: 87-96.

[4] Reynolds AR，Hart IR，Watson AR，et al.Stimulation of tumor growth and angiogenesis by low concentrations of RGD-mimetic integrin inhibitors[J].Nat Med，2009，15（4）:392-400.

[5] Chatterjee S，Matsumura A，Schradermeier J，et al.Human malignant glioma therapy using anti-alpha（v）beta3 integrin agents[J]. J Neurooncol，2000，46（2）:135-144.

[6] Tome Y，Sugimoto N，Yano S，et al.Real-time imaging of αv integrin molecular dynamics in osteosarcoma cells invitro and in vivo[J].Anticancer Res，2013，33（8）:3021-3025.

[7]Eskens FA，Dumez H，Hoekstra R，et al.Phase I and pharmacokinetic study of continuous twice weekly intravenous administration of Cilengitide（EMD 121974），a novel inhibitor of the integrins alphavbeta3 and alphavbeta5 in patients with advanced solid tumours[J].Eur J Cancer，2003，39（7）：917-926.

[8] Friess H，Langrehr JM，Oettle H，et al.A randomized multicenter phase II trial of the angiogenesis inhibitor Cilengitide （EMD 121974）and gemcitabine compared with gemcitabine alone in advanced unresectable pancreatic cancer[J].BMC Cancer，2006，6:285.

[9] Hariharan S，Gustafson D，Holden S，et al.Assessment of the biological and pharmacological effects of the alpha nu beta3 and alpha nu beta5 integrin receptor antagonist，cilengitide（EMD 121974），in patients with advanced solid tumors[J].Ann Oncol，2007，18（8）:1400-1407.

[10]Uehara F1,Tome Y,Yano S,et al.A color-coded imaging model of the interaction of αv integrin-GFP expressed in osteosarcoma cells and RFP expressing blood vessels in Gelfoam vascularized in vivo[J].Anticancer Res，2013，33（4）:1361-1366.

The effects of RGDfv-an inhibitor of integrin αvβ3 on proliferation and apoptosis of human osteosarcoma cell line F5M2

WANG Min，MA Zhao-yu，WANG-Ying，et al
（Department of Bone Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University College of Medicine，Xi'an,Shanxi 710061，China）

Objective To study the effects of RGDfv peptide，an inhibitor of integrinαvβ3，on proliferation and apoptosis of osteosarcoma cells.Methods MTT method was used to explore the inhibitory effect of RGDfv on proliferation of osteosarcoma cells by comparing the OD values，and Western blot technology was used to detect the expression changes of cleaved Caspase-3 induced by RGDfv peptide with different concentrations.Results A concentration and temporal -dependent decreases of OD values in experimental cells with RGDfv peptide were demonstrated compared with control cells.（P<0.05 or 0.01）When compared with control，the expression of cleaved Caspase-3 increased significantly in cells with different concentrations of iRGDfv peptide （P<0.05）.Conclusion iRGDfv peptide could inhibit the proliferation of F5M2cells，and induce the apoptosis of F5M2cells by a Caspase-3 dependent pathway.

osteosarcoma；integrin；cell proliferation；apoptosis

R738

A

1005-7234（2015）05-0357-03

10.3969/j.jssn.1005-7234.2015.05.003

2014-12-01;

2015-02-09

陜西省自然科學基金(2012K13-02-25)

王民（1956-），男，陜西籍，主任醫(yī)師，教授

研究方向：骨關節(jié)病，骨腫瘤

韓學哲

電 話：13991117171

電子信箱:hanjianran@163.com