骨碎補不同炮制品化學(xué)成分的差異研究

陶 益，蔣妍慧，李偉東，蔡寶昌

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

骨碎補不同炮制品化學(xué)成分的差異研究

陶 益，蔣妍慧，李偉東，蔡寶昌

（南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京210023）

目的 比較骨碎補燙品、酒品、鹽品化學(xué)成分的差異。方法 按照中國藥典2010版標(biāo)準(zhǔn)，測定骨碎補不同炮制品的水分、總灰分、醇溶性浸出物，并建立HPLC方法，比較骨碎補不同炮制品主要化學(xué)成分的差異，考察方法的線性、精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性及加樣回收率，同時使用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）對骨碎補不同炮制品的主要差異化學(xué)成分進(jìn)行定性。結(jié)果 骨碎補炮制品的水分、總灰分、醇溶性浸出物測定結(jié)果均符合《中國藥典（2010年版）》的要求。運用質(zhì)譜法鑒定了8個主要差異化學(xué)成分。結(jié)論 骨碎補經(jīng)炮制后柚皮苷含量變化不大，但是其他主要成分的含量發(fā)生了較大的變化，這可能是不同炮制品臨床功效存在差異的主要原因。

骨碎補/化學(xué)； 骨碎補/生產(chǎn)和制備； 炮制/方法； 色譜法，高壓液相； 砂燙； 酒品； 鹽品

骨碎補為水龍骨科植物槲蕨[Drynaria fortunei（Kunze）J.Sm.]的干燥根莖，其主要功能為療傷止痛、補腎強骨，多用于跌撲閃挫、筋骨折傷、腎虛腰痛、筋骨萎軟、耳鳴耳聾、牙齒松動等[1-2]。目前，2010版《中國藥典》收錄 2種規(guī)格，即骨碎補和燙骨碎補。除了藥典收載的燙制法，歷代炮制文獻(xiàn)中還記載著蜜制、姜制、鹽制、酒制、炭制、蒸制等法炮制骨碎補，譬如宋代《圣濟總錄》記載：“去毛，一兩剉以鹽水半兩同炒令黃，去鹽不用?！庇秩缢未短交菝窈蛣┚址健酚涊d：“凡使，用刀刮去上黃皮毛令盡，細(xì)剉，用酒拌蒸一日，取出曬干用”[3]。骨碎補歷代炮制方法繁多，目前尚鮮有炮制前后系統(tǒng)性的研究報道。本研究按照2010版《中國藥典》附錄ⅡD炮制通則項下要求，分別炮制得到骨碎補燙品、鹽品和酒品，并根據(jù)藥典中的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，比較骨碎補不同炮制品各項質(zhì)控指標(biāo)的差異，同時采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-Q-TOF/MS）對骨碎補不同炮制品中差異成分進(jìn)行定性分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 Agilent1100高效液相色譜儀包括Agilent1100色譜工作站、紫外-可見光二極管陣列檢測器和自動進(jìn)樣器（安捷倫公司）；Shimadzu色譜系統(tǒng)，QTOF 5600-plus質(zhì)譜儀（AB Sciex公司），Ultra Pure純水儀（上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司）；扁形稱量瓶，蒸發(fā)皿，BT125型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），Buchi R-205型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士Buchi公司），打粉機，DHG-9023A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。柚皮苷對照品（四川維克奇生物技術(shù)有限公司，批號：140721），純度大于或等于98%。甲酸為分析純。骨碎補藥材在四川省收集，經(jīng)蔡寶昌教授鑒定為水龍骨科植物槲蕨的干燥根莖。食鹽購于江蘇省鹽業(yè)集團有限責(zé)任公司，黃酒購于紹興女兒紅釀酒有限公司。

1.2 方法

1.2.1 飲片制備 燙骨碎補：取凈骨碎補或片，用砂燙至鼓起，撞去毛，得燙骨碎補備用；酒骨碎補：取凈骨碎補或片，加黃酒拌勻，每100千克待炮制品用黃酒20 kg悶透，置炒制容器內(nèi)，用文火炒至鼓起，取出，放涼，得酒骨碎補備用；鹽骨碎補：取凈骨碎補或片，加鹽水拌勻，每100千克待炮制品用食鹽2 kg悶透，置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，炒至鼓起，取出，放涼，得鹽骨碎補。

1.2.2 樣品溶液制備 精密稱取柚皮苷對照品0.5 mg，加甲醇1 mL，配制成濃度為0.5 g/L溶液，依次稀釋成濃度為 0.250 00、0.125 00、0.062 50、0.031 25 g/L的對照品溶液，備用。按照《中國藥典（2010版）》規(guī)定，藥材粉碎后，取本品粉末0.25 g，精密稱定，置錐形瓶中，加甲醇30mL，加熱回流3 h，放冷，濾過，濾液置50 mL量瓶中，用少量甲醇分?jǐn)?shù)次洗滌容器，洗液濾入同一量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

1.2.3 藥典項目檢查 采用烘干法對骨碎補生品、燙品、鹽品、酒品中的水分進(jìn)行檢查，采用總灰分測定法對骨碎補生品和不同炮制品的總灰分進(jìn)行檢查，采用醇溶性浸出物測定法項下的熱浸法測定骨碎補生品和不同炮制品的浸出物。柚皮苷定量的液相色譜條件：Xbridge C18色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5μm）；流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；流速1.0 mL/min；柚皮苷和炮制品提取物的液相分析條件：0 min，5%B；35 min，65%B；檢測波長283 nm；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.2.4 液質(zhì)聯(lián)用分析 UHPLC-Q-TOF/MS條件：Kromasil C18column（150.0 mm×4.6mm，5 μm，流動相：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈；梯度：0min，5%乙腈；5min，10%乙腈；10 min，20%乙腈；20 min，50%乙腈；分析時間：30 min，流速：0.6 mL/min，柱溫：30℃，進(jìn)樣體積：5 μL。質(zhì)譜條件：掃描模式為負(fù)離子模式，毛細(xì)管溫度為325℃，離子源電壓為-4.5 kV，噴霧氣壓為55 psi（1 psi=6.895kPa），去簇電壓為-60 V，加熱氣壓為55 psi，離子源溫度為550℃，一級質(zhì)譜掃描范圍為質(zhì)荷比（m/z）100～1 500，二級質(zhì)譜激活類型為碰撞誘導(dǎo)解離（CID）。

1.2.5 方法學(xué)考察

1.2.5.1 線性關(guān)系考察 精密吸取10 μL不同濃度的柚皮苷對照品溶液進(jìn)樣，記錄色譜峰，以柚皮苷對照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

1.2.5.2 精密度試驗 取柚皮苷對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰峰面積，計算其峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密稱取骨碎補粉末，共6份，每份0.25 g，按1.2.2方法制備供試品溶液，再按前述色譜條件試驗，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，計算柚皮苷峰面積RSD值。

1.2.5.4 重復(fù)性試驗 精密稱取骨碎補粉末，共6份，每份0.25 g，按1.2.2方法制備供試品溶液，再按前述色譜條件試驗，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，計算柚皮苷峰面積RSD值。

1.2.5.5 回收率試驗 采取加樣回收法，取6份已知含量的同一批次樣品約0.25 g，精密稱定，分別按照1∶1精密加入柚皮苷對照品，按1.2.2方法制備供試品溶液，精密吸取上述供試品溶液10 μL，注入色譜儀，依法測定回收率，計算RSD值。

1.2.5.6 含量測定 精密吸取骨碎補生品和不同炮制品供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，按前述色譜的條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。記錄每個色譜峰的峰面積，采用面積歸一化法計算供試品中柚皮苷（圖1峰8）含量，得出骨碎補和燙骨碎補中柚皮苷含量（2010版藥典要求為大于0.50%）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 藥典檢查項目結(jié)果比較 根據(jù)藥典要求生品水分不得超過15%，燙品水分不得過14%，生品灰分不得超過8%，燙品灰分不得超過7%，生品和燙品醇溶物含量均應(yīng)超過16%，骨碎補生品和燙品檢查結(jié)果符合藥典要求（骨碎補鹽品和酒品目前未被藥典收載，也無統(tǒng)一的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)）。與生品比較，鹽品的水分含量較高，而酒品的水分含量較低；鹽品和酒品的總灰分遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生品；酒品和鹽品的醇溶性浸出物顯著高于生品。見表1、圖1。

表1 骨碎補不同炮制品藥典指標(biāo)比較（±s表，%，n=3）

表1 骨碎補不同炮制品藥典指標(biāo)比較（±s表，%，n=3）

樣品生品燙品鹽品酒品水分 總灰分 醇溶性浸出物10.29±0.95 6.24±0.29 13.20±0.10 7.87±0.06 7.11±0.12 4.57±0.14 4.82±0.07 4.27±0.07 37.00±8.88 49.17±0.14 49.02±0.21 59.68±9.20

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 線性關(guān)系考察 回歸方程Y=19 089X+24.166（R2= 0.999 5，n=6），結(jié)果表明，柚皮苷在0.031 25～0.500 00 g/L呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 精密度試驗 連續(xù)進(jìn)樣6次，柚皮苷色譜峰峰面積RSD值為1.69%。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 柚皮苷峰面積RSD值為1.72%，表明重復(fù)性良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗 柚皮苷峰面積RSD值為1.72%，表明重復(fù)性良好。

2.2.5 回收率試驗 回收率為100.29%，RSD值為2.44%。

2.2.6 含量測定 骨碎補和燙骨碎補中柚皮苷含量分別為1.57%和1.63%，符合《中國藥典（2010年版）》要求（＞0.50%）。雖然骨碎補鹽品和酒品無藥典標(biāo)準(zhǔn)，但二者柚皮苷含量分別為1.78%和2.05%，均達(dá)到藥典要求。

圖1 藥骨碎補不同炮制品化學(xué)成分比較

2.3 差異化學(xué)成分的高分辨質(zhì)譜表征 骨峰1的[M-H]-為341.0889，分子式為C15H18O9，主要二級碎片為m/z 179和m/z 135，前者為化合物1失去一個相對分子質(zhì)量為162的六碳糖基所產(chǎn)生，通過與文獻(xiàn)[4]比較，推斷化合物1為1-咖啡酰葡萄糖苷。峰2的[M-H]-為305.064 2，分子式為C15H14O7，主要二級碎片為m/z 167和m/z 125，通過與文獻(xiàn)[5]比較，推斷化合物2為表沒食子兒茶素。峰3的[M-H]-為239.056 9，分子式為C11H12O6，主要二級碎片為m/z 177和m/z 149，通過與文獻(xiàn)[5]比較，推斷化合物3為4-乙?；?3，5-二甲氧基苯甲酸。峰4的[M-H]-為449.1092，分子式為C21H22O11，主要二級碎片為m/z287，是化合物4失去1個相對分子質(zhì)量為162的六碳糖基產(chǎn)生的，通過與文獻(xiàn)[6]比較，推斷化合物4為北美圣草素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。峰5的[M-H]-為595.167 0，分子式為C27H32O15，主要二級碎片為m/z 459.114 6，通過與文獻(xiàn)[7]比較，推斷化合物5為新北美圣草苷。化合物6和化合物5的一級和二級質(zhì)譜一致，保留時間也相近，2個化合物可能是同分異構(gòu)體，通過與文獻(xiàn)[7]比較，推斷化合物6為圣草次苷。峰7的[M-H]-為625.156 9，分子式為C31H30O14，主要二級碎片為m/z 353和m/z191，通過與文獻(xiàn)[8]比較，推斷化合物7為北美圣草素-7-O-[6′′-（3′′′-羥基-4′′′-甲氧基肉桂酰）-β-D-吡喃葡萄糖苷?；衔?的[M-H]-為579.172 6，分子式為C27H32O14，通過與對照品及文獻(xiàn)[5]比較，確定為柚皮苷。骨碎補的高分辨質(zhì)譜總離子流圖見圖3。

圖3 骨碎補的質(zhì)譜總離子流圖

3 討 論

骨碎補的主要化學(xué)成分為酚酸和黃酮類成分，柚皮苷是藥典規(guī)定的主要質(zhì)控指標(biāo)，能夠促進(jìn)骨質(zhì)修復(fù)愈合[9-11]。骨碎補經(jīng)炮制后柚皮苷含量變化不大，但是其他主要化學(xué)成分如1-咖啡酰葡萄糖苷、表沒食子兒茶素、新北美圣草苷和圣草次苷等含量發(fā)生了較大變化，這些可能是骨碎補不同炮制品臨床功效存在差異的主要原因。與生品比較，燙品和鹽品中的1-咖啡酰葡萄糖苷和表沒食子兒茶素均顯著降低，這可能和這2種化合物在高溫條件下不穩(wěn)定，容易發(fā)生降解有關(guān)。3種炮制品中的新北美圣草苷含量顯著降低，而圣草次苷含量顯著升高，這可能與新北美圣草苷和圣草次苷存在互變異構(gòu)有關(guān)。此外，本研究所建立的HPLC方法具有良好的線性、精密度、準(zhǔn)確度，回收率也符合要求，可以應(yīng)用于骨碎補不同炮制品中主要成分的質(zhì)控。

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Investigation on differences in chemical constituents of different processed products of Drynaria fortunei

Tao Yi，Jiang Yanhui，Li Weidong，Cai Baochang
（College of Pharmacy，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing，Jiangsu 210023，China）

Objective To compare the differences in chemical components of scalding product，wine product and salt product of Drynaria fortunei.Methods The water content，total ash，alcohol-soluble extract of different processed products of Drynaria fortunei were detected according to the criteria in the Chinese Pharmacopoeia 2010 version.The HPLC method was established to compare the differences in the major chemical constituents of different processed products of Drynaria fortunei.The linearity，precision，stability，repeatability and recovery rate of the method were investigated.Meanwhile，ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flightmass spectrometry（UHPLC-QTOF-MS/MS）was also employed to qualitatively identify the major different chemical constituents of different Drynaria fortunei processed products.Results The detection results of water content，total ash，alcohol-soluble extract of Drynaria fortunei processed products were in line with the requirements of the Chinese Pharmacopoeia（2010 edition）.Meanwhile the mass spectrographic method was used to identify 8 main different chemical constituents.Conclusion After processing，the content of naringin in Drynaria fortunei has little change，while the content of other majorconstituentsarechangedsignificantly，whichmayberesponsibleforthedifferentclinicalefficacyofdifferentprocessedproducts.

Drynaria fortunei/chemistry； Drynaria fortunei/Sheng chan he zhi bei； Processing（TCD）/methods；Chromatography，high pressure liquid； Heated with sand； Wine-processed； Salt-processed

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.008

A

1009-5519（2015）23-3549-03

2015-10-02）

江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項目（BK20140963）；科技部國家科技重大專項資助項目（2012ZX09304005）。

陶益（1985-），男，浙江臺州人，助理研究員，主要從事中藥炮制學(xué)的研究；E-mail：taoyi1985812@126.com。