Annexin A5、FOXP3基因與中國(guó)漢族女性卵巢早衰的相關(guān)性分析

陳蓓麗，周思睿，胡 平，王 晶，鄒薇薇，王彬彬，曹云霞

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽合肥230022；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081）

Annexin A5、FOXP3基因與中國(guó)漢族女性卵巢早衰的相關(guān)性分析

陳蓓麗1，周思睿2，胡 平1，王 晶2，鄒薇薇1，王彬彬2，曹云霞1

（1.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，安徽合肥230022；2.國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委科學(xué)技術(shù)研究所，北京100081）

目的 探討中國(guó)漢族女性中膜聯(lián)蛋白A5（Annexin A5）基因、叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子3（FOXP3）基因多態(tài)性與卵巢早衰（POF）之間的關(guān)系。方法 在2007年12月至2014年12月來(lái)該院就診的中國(guó)漢族女性人群中選取POF患者100例（觀察組）和健康女性140例（對(duì)照組），挑選能夠覆蓋Annexin A5全基因的4個(gè)標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（Tag SNPs）（rs2306420、rs6857766、rs2306415、rs1383232），F(xiàn)OXP3基因的2個(gè)Tag SNPs（rs3761548、rs3761549）作為檢測(cè)指標(biāo)，采用對(duì)照研究方法，利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）檢測(cè)Annexin A5、FOXP3基因型和等位基因在兩組人群中的分布情況。結(jié)果 Annexin A5基因的4個(gè)Tag SNPs及FOXP3的2個(gè)Tag SNPs基因型和等位基因在POF觀察組及對(duì)照組的頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且Annexin A5基因各位點(diǎn)所能構(gòu)成的單體型，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。FOXP3基因rs3761548、rs3761549所構(gòu)成的單體型中AC單體型在觀察組和對(duì)照組中的分布情況比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 該研究排除了Annexin A5基因作為中國(guó)漢族女性POF易感基因的可能性，而FOXP3基因AC單體型（rs3761548、rs3761549）人群POF的發(fā)生率可能會(huì)升高。

膜聯(lián)蛋白A5； 基因型； 漢族； 卵巢； 等位基因； 多態(tài)性，單核苷酸

卵巢是具有獨(dú)特發(fā)育周期的內(nèi)分泌結(jié)構(gòu)，卵泡周期性的更新?lián)Q代保證和維持了女性的生殖健康和生活質(zhì)量。原始卵泡池內(nèi)的卵泡數(shù)量生成減少，凋亡閉鎖增加均會(huì)引起卵巢功能不全進(jìn)而發(fā)生卵巢早衰（premature premature ovarian failure，POF），即婦女40歲前發(fā)生過(guò)早絕經(jīng)的現(xiàn)象。膜聯(lián)蛋白A5（Annexin A5）是一種鈣磷脂結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白家族廣泛存在于組織細(xì)胞中，參與炎性反應(yīng)、信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架活動(dòng)，以及腫瘤細(xì)胞增殖、分化與凋亡。近年來(lái)，對(duì)Annexin A5基因與婦科腫瘤如宮頸癌[1]、子宮內(nèi)膜癌及婦科內(nèi)分泌疾病如多囊卵巢綜合征的研究逐漸增多。叉頭樣轉(zhuǎn)錄因子（FOXP3）是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，在維持自身免疫耐受、預(yù)防自身免疫疾病方面扮演著重要角色。FOXP3基因的失活突變會(huì)引起免疫功能失調(diào)、多發(fā)內(nèi)分泌病及腸病等一系列征候群[2]。免疫功能的異常也有可能引起POF的發(fā)生。因此，本研究試圖通過(guò)檢測(cè)基因多態(tài)性來(lái)探討中國(guó)漢族女性中AnnexinA5基因、FOXP3基因與POF之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 選取2007年12月至2014年12月在本院生殖中心就診的100例POF女性患者作為觀察組，年齡16～40歲，平均（30.40±6.51）歲；月經(jīng)初潮平均年齡（14.50±1.98）歲，閉經(jīng)時(shí)平均年齡（25.9±6.90）歲。選擇同期在本院就診的月經(jīng)周期規(guī)則、性激素檢查在正常范圍內(nèi)、無(wú)卵巢相關(guān)疾病的健康女性140例作為對(duì)照組，年齡21～44歲，平均（31.20±4.50）歲。兩組年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象對(duì)本研究知情同意，并簽訂知情同意書，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理道德委員會(huì)審查批準(zhǔn)。

1.1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡40歲以下的中國(guó)漢族女性原發(fā)或繼發(fā)性閉經(jīng)3～6個(gè)月以上；（2）激素檢測(cè)：于月經(jīng)第3～5天檢測(cè)血清促卵泡生成素（folliclestimulating hormone，F(xiàn)SH），至少間隔1個(gè)月重復(fù)測(cè)量大于30 U/L[3]。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）染色體異常；（2）通過(guò)詳細(xì)的病史詢問(wèn)、婦科檢查、體格檢查及超聲檢測(cè)等排除盆腔創(chuàng)傷史、手術(shù)史、放化療史及其他婦科內(nèi)分泌疾病史等。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 采集符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的POF患者及對(duì)照人群血樣標(biāo)本約5 mL，置于乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝管內(nèi)，分裝后立即于-80℃冰箱內(nèi)冷凍保存。

1.2.2 DNA提取 使用血液基因組提取試劑盒（天根生化科技有限公司），采用可以特異性結(jié)合DNA的離心吸附柱和獨(dú)特的緩沖液系統(tǒng)進(jìn)行DNA抽提。提取后的DNA樣本經(jīng)NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)質(zhì)控，調(diào)整所有樣品的DNA濃度至5～10 ng/μL。

1.2.3 標(biāo)簽單核苷酸多態(tài)性（Tag SNPs）的選擇 使用HapMap Database/Haploview軟件，根據(jù)Pair-wise方法查找Annexin A5、FOXP3基因的Tag SNPs（以代表整個(gè)基因全部SNP），查詢?cè)揝NP位點(diǎn)前后各150 bp的序列信息，利用Sequenom網(wǎng)站（http：//www.sequenom.com/iplex）確定各SNP相關(guān)性，以及是否各相對(duì)分子質(zhì)量能夠被設(shè)計(jì)進(jìn)同一孔中。Annexin A5的4個(gè)Tag SNPs為rs2306420、 rs6857766、rs2306415、rs1383232；FOXP3的2個(gè) Tag SNPs為rs3761548、rs3761549。

1.2.4 PCR引物及反應(yīng)體系設(shè)計(jì) 利用 Sequenom MassARRAY?相對(duì)分子質(zhì)量陣列平臺(tái)的iPLEX GOLD技術(shù)，根據(jù)待測(cè)SNP位點(diǎn)的信息設(shè)計(jì)PCR引物和反應(yīng)體系。引物包括1對(duì)PCR擴(kuò)增引物及1條延伸引物。Annexin-a5、FOXP3基因的引物設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2.5 基因多態(tài)性檢測(cè) 采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)（MALDI-TOF MS）對(duì)挑選的6個(gè)Tag SNPs進(jìn)行檢測(cè)，最終數(shù)據(jù)由MassARRAY軟件系統(tǒng)實(shí)時(shí)收集并統(tǒng)計(jì)基因型和等位基因的頻率分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)（理論頻數(shù)小于1時(shí)使用Fisher精確檢驗(yàn)法）；利用SHEsis在線軟件（http：//analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php）進(jìn)行基因內(nèi)Tag SNPs的單體型分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 Annexin A5、FOXP3基因Tag SNPs的PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié) 果

2.1 基因型和等位基因的頻率分布 收集數(shù)據(jù)并進(jìn)行整理，結(jié)果顯示6個(gè)Tag SNPs均滿足Hardy-Weinberg平衡。

2.1.1 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布 覆蓋Annexin A5基因的4個(gè)Tag SNPs結(jié)果如下：rs2306420（C/T）有3種基因型，其頻率分別為：CC（73.7%）、TT（1.0%）、CT（25.3%）；rs6857766（A/G）有3種基因型，其頻率分別為：AA（0.0%）、GG（77.0%）、AG（23.0%）；rs2306415（C/G）有3種基因型，其頻率分別為：CC（66.3%）、GG（3.1%）、CG（30.6%）；rs1383232（A/G）有3種基因型，其頻率分別為：AA（4.2%）、GG（55.2%）、AG（40.6%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，其基因型及等位基因在POF觀察組及對(duì)照組的頻率分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2。

2.1.2 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布 覆蓋FOXP3基因的2個(gè)Tag SNPs結(jié)果如下：rs3761548（A/C）有3種基因型，其頻率分別為：AA（7.1%）、CC（58.2%）、AC（34.7%）；rs3761549（C/T）有 3種基因型，其頻率分別為：CC（71.9%）、TT（0）、CT（28.1%）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，其基因型及等位基因在POF觀察組及對(duì)照組的頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3。

2.2 AnnexinA5基因形成的單體型關(guān)系 經(jīng)分析，Annexin A5基因的 4個(gè) Tag SNPs中 rs2306420和rs2306415不在同一個(gè)block中，由另外2個(gè)位點(diǎn)rs1383232和rs6857766所構(gòu)成的單體型共有3種，但是兩組各單體型分布比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表2 Annexin A5基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布（%）

表3 FOXP3基因的Tag SNPs其基因型及等位基因的頻率分布（%）

表4 Annexin A5基因形成的單體型關(guān)系（%）

2.3 FOXP3基因形成的單體型關(guān)系 FOXP3基因的rs3761548、rs3761549所構(gòu)成的單體型共有4種，AC單體型在觀察組和對(duì)照組中的分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），會(huì)增加POF的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。見(jiàn)表5。

表5 FOXP3基因形成的單體型關(guān)系（%）

3 討 論

POF是婦科疾病中的疑難病癥之一，嚴(yán)重影響婦女的生殖健康和生活質(zhì)量。育齡婦女POF發(fā)病率約1%～3%[4]，近年來(lái)有逐漸上升趨勢(shì)。究其病因，異質(zhì)性程度高，排除常見(jiàn)的染色體異常、免疫、手術(shù)、放療、化療、創(chuàng)傷、感染及代謝等因素外，仍有相當(dāng)大比例病因不明。有研究表明，遺傳因素是POF的一個(gè)重要原因，特發(fā)性POF主要是由多基因遺傳及環(huán)境因素共同作用引起的復(fù)雜疾病[5]。

Annexin A5基因位于人類染色體4q27，全長(zhǎng)29kb，共包含13個(gè)外顯子。既往研究提示其特殊的分子結(jié)構(gòu)酸性磷脂決定其在參與抗凝、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[6]。AnnexinA5能夠在細(xì)胞膜上形成側(cè)向聚集物，以激發(fā)其在胎盤絨毛上的防御功能，從而發(fā)揮抗凝作用[7]。復(fù)發(fā)性流產(chǎn)患者中血栓形成傾向異常，因此，AnnexinA5 M2單體型一直是該病的研究熱點(diǎn)。Demetriou等[8]研究顯示，在自發(fā)性流產(chǎn)患者中Annexin A5 M2等位基因的頻率顯著高于對(duì)照組。另有研究指出，多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS）患者循環(huán)中的AnnexinA5陽(yáng)性的血小板濃度較對(duì)照組升高，可能與PCOS的代謝異常、心血管疾病的發(fā)生相關(guān)[9]。耿薔等[10]推測(cè)，卵丘細(xì)胞表達(dá)的Annexin A5可能是一種潛在的卵母細(xì)胞成熟相關(guān)蛋白。卵丘細(xì)胞中Annexin A5的表達(dá)，隨著卵母細(xì)胞的成熟，卵丘細(xì)胞中Annexin A5的表達(dá)上調(diào)。推測(cè)Annexin A5蛋白表達(dá)水平的變化可能與體內(nèi)LH峰的作用有關(guān)，并可能與LH峰伴隨的卵丘膨脹、卵丘細(xì)胞的活躍增殖與代謝、細(xì)胞外基質(zhì)的黏附、卵丘細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度波動(dòng)等生物過(guò)程有關(guān)[10]。

POF的本質(zhì)是卵巢功能提前衰竭，卵子數(shù)量生成減少、凋亡增加、成熟障礙都可能引起卵子發(fā)育的異常，從而引起女性的生育力下降甚至缺失。推測(cè)Annexin A5基因可能通過(guò)參與抗凝或炎癥過(guò)程的調(diào)節(jié)從而引起卵巢功能的異常，通過(guò)參與調(diào)節(jié)凋亡和成熟過(guò)程而影響卵子的生長(zhǎng)發(fā)育。因此，本研究試圖探尋Annexin A5基因與POF發(fā)病之間是否存在相關(guān)性。結(jié)果顯示，覆蓋整個(gè)Annexin A5基因的Tag SNPs的基因型和等位基因在觀察組和對(duì)照組中的頻率分布比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。兩組研究對(duì)象4個(gè)Tag SNPs所構(gòu)成的單體型分布差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此，在對(duì)Annexin A5基因與POF進(jìn)行的首次關(guān)聯(lián)分析中，作者排除了Annexin A5基因作為中國(guó)漢族女性POF易感基因的可能性。

1968年，Irwine提出POF的發(fā)生可能與自身免疫系統(tǒng)功能異常相關(guān)。Silva等[11]研究表明，約20%的POF患者曾經(jīng)有自身免疫疾病的病史，如甲狀腺功能異常、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血等。FOXP3作為CD4+CD25+調(diào)節(jié)T（Treg）細(xì)胞表面的特征性標(biāo)志，是Treg細(xì)胞發(fā)育和功能維持的關(guān)鍵因素，在自身免疫疾病的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。本研究在POF人群中篩查FOXP3基因的多態(tài)性并進(jìn)行相關(guān)性分析，盡管兩組研究對(duì)象覆蓋FOXP3基因的2個(gè)Tag SNPs位點(diǎn)的等位基因頻率和基因型頻率比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但由這2個(gè)位點(diǎn)所構(gòu)成的單體型AC在觀察組中的分布明顯高于對(duì)照組，因此推測(cè)AC單體型相較于其他單體型人群POF的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增大。

綜上所述，本研究選擇標(biāo)簽SNPs作為檢測(cè)指標(biāo)，利用MALDI-TOF MS對(duì)Annexin A5、FOXP3基因的基因型和等位基因，以及Block區(qū)內(nèi)各SNP所能構(gòu)成的單體型在觀察組和對(duì)照組中的頻率分布進(jìn)行分析，并首次對(duì)這2個(gè)基因與POF之間的關(guān)聯(lián)進(jìn)行研究。排除了Annexin A5基因作為POF易感基因的可能性，提示FOXP3基因可能與POF的發(fā)生相關(guān)，但該結(jié)果仍需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并在不同的人種中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Analysis on correlation between Annexin A5，F(xiàn)OXP3 genes and idiopathic premature ovarian failure in Chinese Han females

Chen Beili，Zhou Sirui，Hu Ping，Wang Jing，Zou Weiwei，Wang Binbin，Cao Yunxia
（1.Reproductive Medicine Center，Department of Gycocolegy and Obstetrics，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China；2. Scientific and Technical Research Institute of National Health and Family Planning Commission，Beijing 100081，China）

Objective To investigate the correlation between the polymorphisms of Annexin A5 and FOXP3 genes with the premature ovarian failure（POF）in Chinese Han females.Methods Among 100 Han female cases（observation group）of POF in our hospital from December 2007 to December 2014 and 140 healthy females（control group），4 tag SNPs（rs2306420，rs6857766，rs2306415，rs1383232）covering the entire sequence of the gene Annexin A5 and 2 tag SNPs（rs3761548 and rs3761549）of gene FOXP3 were selected as the detection indicators.The case-control research method was adopted.The matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry（MALDI-TOF MS）was used to detect the distribution situation of Annexin A5 and FOXP3 genotypes and allele in the two groups.Results No statistically significant difference was found in the distributions of genotypes and alleles for 4 tag SNPs of gene Annexin A5 and 2 Tag SNPs of FOXP3 gene between the observation group and control group（P＞0.05）.Moreover the haplotype constituted by various loci of Annexin A5 gene had no statistical difference（P＞0.05）. The haplotype constituted by FOXP3 gene rs3761548 and rs3761549 in the observation group was significantly higher than that in the healthy control group，the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion This research excludes the possibility of Annexin A5 gene as the POF susceptible gene in Chines Han females，however，the occurrence rate of POF may be increased in the female group with haplotype AC（rs3761548，rs3761549）of FOXP3 gene.

Annexin A5； Genotype； Han nationality； Ovary； Alleles； Polymorphism，single nucleotide

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.23.001

A

1009-5519（2015）23-3529-03

2015-09-20）

國(guó)家“973計(jì)劃”項(xiàng)目（2014CB944704）；安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院青年基金項(xiàng)目（3101005002501）。

陳蓓麗（1985-），女，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事生殖內(nèi)分泌疾病相關(guān)研究工作；E-mail：cbl0118@126.com。

曹云霞（E-mail：caoyunxia6@126.com）。