瓜菜類病原細(xì)菌耐藥外排泵RND研究進(jìn)展

王 真，趙廷昌，楊玉文，關(guān) 巍 ，胡 俊

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 呼和浩特 010019； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所·植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100193）

瓜菜細(xì)菌性病害的防治手段單一，造成了大多數(shù)病原細(xì)菌對抗生素及銅制劑產(chǎn)生耐藥性。早在1962年美國佛羅里達(dá)州就發(fā)現(xiàn)了番茄瘡痂病菌的田間鏈霉素耐藥菌株[1]，之后有關(guān)植物病原細(xì)菌耐藥性的報道屢見不鮮。向平安等檢測了7株不同來源（中國）的辣椒瘡痂病菌（Xanthomonas vesicatoria），發(fā)現(xiàn)4株辣椒瘡痂病菌具有較高的鏈霉素耐受性[2]。Shenge等調(diào)查了來自坦桑尼亞番茄產(chǎn)區(qū)的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌（Xanthomonas campestrispv.vesicatoria），發(fā)現(xiàn)所有菌株對銅制劑均有較高的耐受性[3]。

病原細(xì)菌對抗生素或銅制劑較強(qiáng)的適應(yīng)性和耐受性，為瓜菜類致病細(xì)菌的防治帶來挑戰(zhàn)。病原細(xì)菌的耐藥機(jī)制多種多樣，而外排泵的發(fā)現(xiàn)，開啟了人類認(rèn)識病原細(xì)菌的新篇章。依賴于能量的外排泵最早在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)[4]。1983年George和Levy首次報道了細(xì)菌的外排泵可以增強(qiáng)其多耐抗生素的能力[5]。之后在Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa中發(fā)現(xiàn)的以耐藥結(jié)節(jié)分化家族（resistance-nodulation-division family，RND）為代表的多耐藥外排泵[6-10]成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。RND多耐藥外排泵對革蘭氏陰性細(xì)菌耐藥性貢獻(xiàn)很大，生物信息學(xué)分析表明RND外排泵廣泛存在于瓜菜作物病原細(xì)菌中。瓜菜作物RND外排泵不僅可以外排抗生素、抗菌素等有害物質(zhì)，還可以被逆境激活，參與細(xì)菌侵染植物的整個過程[11-13]。但相關(guān)研究較少，具體機(jī)制還不明確。鑒于此，筆者綜述了病原細(xì)菌RND外排泵的結(jié)構(gòu)與功能、細(xì)菌/植物互作過程中外排泵的作用及抑制劑等方面的研究進(jìn)展，以期為瓜菜作物病原細(xì)菌耐藥性的研究提供參考。

1 RND外排泵家族的結(jié)構(gòu)與功能

RND家族是一類三聚體外排泵，包含有內(nèi)膜蛋白（IMP），位于周質(zhì)的膜融合蛋白（MFP）和外膜蛋白（OMP）[14]。這3類蛋白貫穿于細(xì)菌的2層膜，協(xié)同完成細(xì)菌內(nèi)有害物質(zhì)的外排（圖1）?？筛鶕?jù)其外排底物的不同將RND外排泵家族分為兩類，一類是疏水性或者兩親性的外排泵（HAE-RND）[15]；另一類是重金屬外排泵（HME-RND）。HAE-RND家族包括 AcrAB、MexAB-OprM、MexEF-OprN、MdtAB和MdtEF等系統(tǒng)，HME-RND家族目前報道的僅有CusCFBA系統(tǒng)[16]。這2類外排泵廣泛存在于瓜類和蔬菜病原細(xì)菌中，筆者以AcrAB和CusCFBA為代表介紹外排泵的結(jié)構(gòu)與功能。

1.1 AcrAB-TolC外排系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)與功能

E.coli的Acr外排家族系統(tǒng)是RND外排泵研究的模型系統(tǒng)。Acr外排家族系統(tǒng)包括外膜通道TolC、膜內(nèi)的次級轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AcrB以及位于周質(zhì)連接內(nèi)外膜的通道蛋白AcrA。AcrB-AcrA-TolC外排泵可轉(zhuǎn)運(yùn)多種結(jié)構(gòu)不同的抗生素，賦予了細(xì)菌廣譜的抗生素耐藥性。

圖1 AcrABZ-TolC外排泵模型[16]

在E.coli中，位于周質(zhì)的AcrA與細(xì)胞內(nèi)膜通過氨基端脂質(zhì)修飾連接在一起，其結(jié)構(gòu)域包括周質(zhì)膜區(qū)域、β桶狀區(qū)域、硫辛酰區(qū)域和α發(fā)夾區(qū)域[17]。其中α發(fā)夾區(qū)域與內(nèi)膜的TolC蛋白結(jié)合，其他的區(qū)域可能與AcrB互作[18-21]。

AcrB貫穿于跨膜結(jié)構(gòu)域和周質(zhì)結(jié)構(gòu)域[22]，包括3個非對稱的晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)具有可旋轉(zhuǎn)性，可通過松散（L）、緊湊（T）、開放（O）型 3個結(jié)構(gòu)的變化，實(shí)現(xiàn)底物的向外運(yùn)輸功能[23-25]（圖1）。TolC外膜通道是由3個TolC單體組成的炮筒狀結(jié)構(gòu)[26]，這個通道連接周質(zhì)穿過細(xì)胞外膜一直通向細(xì)胞表面[27]。

1.2 CusCFBA外排系統(tǒng)

CusCFBA外排系統(tǒng)是瓜類和蔬菜作物病原細(xì)菌重要的銅外排系統(tǒng)，在植物病原細(xì)菌銅制劑耐受性方面具有重要的作用。CusCFBA外排系統(tǒng)（圖2）也是最具有代表性的一個HME-RND外排系統(tǒng)。它可以外排重金屬Ag+和Cu+，同時還可能參與磷霉素、二硝基苯酚、硝基苯與乙硫異煙胺的外排[28-29]，該外排泵有助于細(xì)胞內(nèi)Cu+平衡的維持[30]。

圖2 CusBA復(fù)合結(jié)構(gòu)[31]

CusCFBA外排系統(tǒng)由位于內(nèi)膜的CusA，位于周質(zhì)膜的CusB和位于外膜的CusC組成。這與AcrABC結(jié)構(gòu)極為相似，其化學(xué)計量學(xué)分析結(jié)果表明 CusA∶CusB∶CusC 為 3∶6∶3[31-32]。

CusB系統(tǒng)包含4個亞結(jié)構(gòu)域：3個β螺旋結(jié)構(gòu)域和1個α螺旋結(jié)構(gòu)域[33]。CusA包含12個跨膜α螺旋。CusB識別并結(jié)合Cu+和Ag+，之后將Cu+和Ag+傳遞給位于周質(zhì)膜裂縫處CusA的M573、M623和M672等保守氨基酸殘基（圖3）。接收到重金屬離子的CusA構(gòu)象會迅速改變，使得這些重金屬離子進(jìn)入外排泵的周質(zhì)區(qū)域中，或者直接通向細(xì)胞外[34]。另外，CusF與CusB相互作用，可能促進(jìn)周質(zhì)膜裂縫的打開；CusC自身的螺旋結(jié)構(gòu)與CusB的α螺旋結(jié)構(gòu)相互作用，構(gòu)建了重金屬離子的外排通道[33]。

圖3 底物與CusA結(jié)合示意圖[34]

2 RND耐藥外排泵和病原細(xì)菌/作物互作的關(guān)系

如今植物基因組學(xué)和高通量測序等新技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于植物病原細(xì)菌毒力、病原細(xì)菌/植物互作以及病原細(xì)菌耐藥性分析，植物病原細(xì)菌Xanthomonas axonopodispv.citri，Xanthomonas campestrispv.campestris，Ralstonia solanacearum，Pseudomonas syringaepv.tomatoDC3000，Erwinia carotovorasubsp.atroseptica和Xanthomonas oryzaepv.oryzae等的測序工作相繼完成[35-39]。測序結(jié)果顯示植物病原細(xì)菌基因組中含有大量的RND外排泵相關(guān)基因。RND外排泵不僅在細(xì)菌耐藥性方面具有重要作用，而且與細(xì)菌的致病性密切相關(guān)。另外，病原細(xì)菌的RND耐藥外排泵還參與細(xì)菌體代謝副產(chǎn)物的分泌，如RND外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ToxGHI幫助Burkholderia glumaeBGR1外排毒黃素[40]。

Palumbo等最早發(fā)現(xiàn)Agrobacterium tumefaciens中的外排泵IfeAB運(yùn)載體可以外排植物分泌的抑菌性物質(zhì)異黃酮，并且在細(xì)菌定殖寄主作物過程中有著不可替代的作用[41]。在豆類作物病原細(xì)菌P.syringaepv.phaseolicola1448A、P.syringaepv.syringaeB728a和番茄病原細(xì)菌P.syringaepv.tomatoDC3000中，RND轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體MexAB-OprM對化合物（如抗生素、植物源抗菌素、洗滌劑和染料等）有著非常高的耐受力。該蛋白復(fù)合體還參與細(xì)菌在植物體內(nèi)的繁殖過程[42]。P.syringaepv.syringae染色體基因編碼的PseABC家族是其合成丁香毒素和丁香肽等毒素不可缺少的，pseC基因的缺失會減少植物毒素的合成和分泌量[43]。Vargas P等研究發(fā)現(xiàn)，番茄植株分泌的黃酮類物質(zhì)可誘導(dǎo)丁香假單胞番茄致病變種P.syringaepv.tomato菌株P(guān)meR蛋白的過表達(dá)，過表達(dá)的PmeR可抑制Mex-AB-OprM外排系統(tǒng)。PmeR和MexAB-OprM構(gòu)成的互作系統(tǒng)，與菌株P(guān).syringaepv.tomato在番茄植株上的定殖密切相關(guān)[44]。對丁香假單胞煙草致病變種P.syringaepv.tabaci鞭毛蛋白FliC的研究表明，ΔfliC較野生型菌株致病力和運(yùn)動性都顯著降低，但是mexEFoprN（RND外排系統(tǒng)編碼基因）基因的表達(dá)量急劇上升。IV型菌毛（T4P）缺陷型突變體ΔpilA，其菌株富集能力及對煙草的致病力明顯減弱，參與其多耐藥外排泵MEX的相關(guān)基因mexABoprM的表達(dá)量明顯上升[45]?？梢奟ND外排泵不僅在逆境適應(yīng)、有害物質(zhì)外排等方面有重要的作用，而且在P.syringae中與細(xì)菌的侵染力也密切相關(guān)。

E.chrysanthemi具有2個AcrAB外排系統(tǒng)，它們不僅可以幫助細(xì)菌抵抗菊苣分泌的抗菌肽硫素，而且輔助細(xì)菌定殖菊苣葉片，引起病害[46]。有研究認(rèn)為E.chrysanthemi侵染植物，導(dǎo)致寄主植物水楊酸等抗菌物質(zhì)分泌增多，而這些有毒的抗菌物質(zhì)正好激活了細(xì)菌多耐藥外排泵編碼基因的表達(dá)，提高了細(xì)菌的侵染成活率[47]。該菌株中tolC編碼51kDa的蛋白與E.coli中TolC蛋白同源性高達(dá)70%。tolC基因缺失突變體不能外排鹽酸小檗堿；突變體在寄主植物內(nèi)可以存活，但生長較慢，不足以造成病害[11]。Brown等通過對青枯菌（R.solanacearum）多耐藥外排泵相關(guān)基因acrA和dinF的功能研究發(fā)現(xiàn)缺失突變株對抗生素、植物毒素和洗滌劑的耐受性明顯低于野生菌株；對番茄植株侵染力相對較弱。這一結(jié)果也證實(shí)了RND外排泵在瓜菜病原細(xì)菌中具有雙重作用[48]。

梨火疫病菌（E.amylovora）主要侵染薔薇科作物。在侵染初期，病原細(xì)菌會暴露在植物體表面，并被植物分泌的大量抗菌素包圍。染料木黃酮是豆科作物或者非豆科作物分泌的異黃酮類抗菌素[49-50]，是植物抗毒素Phytoalexins和Phytoanticipins路徑合成抗菌素的前體[51-52]。Burse A等發(fā)現(xiàn)薔薇科分泌的異黃酮類抗菌素可誘導(dǎo)E.amylovora中外排泵編碼基因acrAB的大量表達(dá)。acrB缺失突變株致病力降低，對于果樹分泌的抗菌素變得敏感[53]。這與Al-Karablieh N等的研究結(jié)果不符。Al-Karablieh N等發(fā)現(xiàn)，E.amylovora基因tolC和acrB/tolC的缺失突變體對植物分泌的抗菌素及一些合成的抗菌劑較野生型敏感，而acrB缺失突變株對相關(guān)抗生素并不敏感。另外tolC和acrB/tolC缺失突變株的毒力并沒有降低，TolC可能通過與AcrAB的互作來保持植物體表面毒素的平衡，以輔助E.amylovora突破植物表層保護(hù)組織[54]。在AcrB外排泵缺失的突變株中，過表達(dá)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白MdtABC和MdtUVW，可以使E.amylovora對黃酮類、梭鏈孢酸和新生霉素產(chǎn)生耐受性。MdtABC介導(dǎo)E.amylovora對膽鹽、硝酸鹽的抗性，其表達(dá)受雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)BaeSR的調(diào)節(jié)；MdtUVW介導(dǎo)其對克霉唑的耐受性。MdtABC和MdtUVW的缺失也會阻礙細(xì)菌對寄主植物的侵染[55]。他們還證明了外排蛋白NorM在E.amylovora侵染植株花器官時，可以與花柱上寄生的分泌抗菌素類物質(zhì)的泛菌屬競爭空間和營養(yǎng)，幫助E.amylovora完成侵染。而norM基因缺失突變株的毒力并沒有降低，自然條件下致病力卻下降[56]。

有關(guān)植物病原細(xì)菌銅制劑耐受性的研究較多，但是大都集中在對Cop系統(tǒng)的研究，有關(guān)Cus系統(tǒng)的研究相對較少[57-60]。Gutiérrez-Barranquero等通過對P.syringae全基因組信息的分析發(fā)現(xiàn)P.syringae的銅耐受性是由CopG、CusCBA和CopABCD操縱子協(xié)同作用完成的[61]。另外，劉星等驗(yàn)證了Acidovorax citrulliRND外排泵相關(guān)基因cusB與Acidovorax citrulli菌株的銅耐受性密切相關(guān)。cusB缺失突變株較野生型對銅制劑更加敏感，但不影響致病力[62]。

3 外排泵抑制劑的開發(fā)

外排泵抑制劑（EPIs）是一類抑制細(xì)菌外排泵功能的藥物。利用它可使低濃度的抗生素起到較高的抗菌效果，同時減少細(xì)菌耐藥性的發(fā)生。它還可以抑制生物膜的形成，降低病原菌的毒力。EPIs的研究與應(yīng)用對于瓜菜細(xì)菌性病害的防治意義重大，但是相關(guān)研究難度較大。在實(shí)驗(yàn)室條件下，有效的EPIs已經(jīng)有不少報道，但是目前還沒有可以應(yīng)用于實(shí)踐的EPIs。

3.1 RND EPIs選取原則

實(shí)驗(yàn)應(yīng)用中EPIs必須具備以下幾個特點(diǎn)：第一，能促進(jìn)細(xì)菌外排泵相關(guān)基因的表達(dá)；第二，藥劑本身對細(xì)胞無損害；第三，在其發(fā)揮作用的同時不影響質(zhì)子的跨膜運(yùn)輸；第四，不能增加非外排抗生素的活性；第五，不能影響抗生素的活性。這些限制因素使得實(shí)際篩選EPIs時困難重重。例如，對細(xì)菌能量平衡影響較大的羰基氰氯苯腙（CCCP）可作為一種抑制細(xì)菌外排泵的化合物。然而，該類化合物嚴(yán)重消耗了細(xì)菌膜質(zhì)子動力，從而導(dǎo)致了細(xì)菌的死亡[63]。再如，外排泵調(diào)控基因有很多，而且調(diào)控功能多且復(fù)雜，很難通過對一種或者一類調(diào)控基因的抑制作用深入解析其抑制外排泵的分子機(jī)制，同時，在理論研究上，對于大部分調(diào)控基因的作用機(jī)制尚不明確，加大了研究難度。

3.2 研究較多的EPIs

目前研究較多的2類EPIs包括肽類EPIs和吡啶并嘧啶類EPIs，它們也是最具代表性的2類EPIs。

3.2.1 肽類EPIs PAβN（苯丙氨酸-精氨酸-氨酸萘酰胺，起初稱為MC-207，110），英文全稱phenylalanyl arginyl β-naphthylamide，是研究最早最有價值的一種EPI[64]，其結(jié)構(gòu)如圖4。Renau等通過對Pseudomonas aeruginosa中 MexAB、MexCD 和 Mex-EF基因過表達(dá)，從200 000個可增強(qiáng)P.aeruginosa菌株敏感性的小分子EPIs中篩選得到了該化合物[65]。PAβN作為外排泵的結(jié)合底物，與抗生素競爭結(jié)合區(qū)域[66]，提高細(xì)胞內(nèi)抗生素濃度，從而達(dá)到抑制抗生素外排的作用。作為一種廣譜性的EPIs，它還可以使結(jié)構(gòu)不同的抗生素如氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、惡唑烷酮類、氯霉素和利福平等抗生素恢復(fù)生物活性，但不能恢復(fù)β內(nèi)酰胺以及氨基糖苷類抗生素活性[64]。這類化合物最突出的優(yōu)點(diǎn)在于，它很難使細(xì)菌對其產(chǎn)生耐藥性。但是該類化合物的親和力較差，必須當(dāng)?shù)孜餄舛确e累到一定程度才能發(fā)揮作用[67]。此類化合物會阻礙細(xì)胞膜的功能，對細(xì)胞具有一定的毒性[68]，這限制了其應(yīng)用前景。然而PAβN衍生物如MC-04，124，在細(xì)胞液中的穩(wěn)定性高，且毒性很小，同時不會使外排泵的調(diào)控基因表達(dá)過高[69]。

圖4 兩類抗生素的分子式[64]

3.2.2 吡啶并嘧啶類 EPIs-ABI-PP（D13-9001）D13-9001（圖4）是與RND外排泵作用過程研究最清楚的一類EPIs。其作用機(jī)制是D13-9001與AcrB、MexB的疏水端結(jié)合，影響AcrB/MexB的空間結(jié)構(gòu)的改變，破壞底物與AcrB/MexB末端的運(yùn)輸通道造成外排泵功能故障，藥物在細(xì)菌體內(nèi)積累，進(jìn)而達(dá)到抑制外排的效果[70]。D13-9001的親水端存在于細(xì)菌外排泵的通道，可能阻礙底物與外排泵在這一區(qū)域的結(jié)合。

與肽類 EPIs-PAβN相比，吡啶并嘧啶類EPIs-ABI-PP安全低毒或無毒、水溶性好、藥效突出[71]，具有較大的應(yīng)用前景。它可以特異性地抑制AcrAB-TolC和MexAB-OprM外排泵，但是對MexXY-OprM外排泵沒有抑制效果[72]，這也是它沒能應(yīng)用于實(shí)踐中的主要原因。

4 展望

外排泵廣泛存在于瓜類和蔬菜作物病原細(xì)菌中，在細(xì)菌抵抗外界脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。目前有關(guān)RND外排泵結(jié)構(gòu)與功能、外排抑制劑等的研究已取得很大的進(jìn)展。植物病原細(xì)菌P.syringae，A.tumefaciens，Rhizobium etli和Bradyrhizobium japonicum中相關(guān)多耐藥RND外排泵的研究已見報道，但相關(guān)機(jī)制并不清楚[73-75]。

RND多耐藥外排泵是細(xì)胞代謝的外排結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞代謝中具有重要作用。在正常的細(xì)菌體內(nèi)，RND外排泵相關(guān)基因的表達(dá)應(yīng)該有特定的生理調(diào)節(jié)方式，對這一調(diào)控體系的研究有助于我們了解細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制。另外，有關(guān)植物分泌物對病原細(xì)菌的吸引導(dǎo)致病害發(fā)生的研究甚多[76]。然而，病原細(xì)菌RND多耐藥外排泵對植物分泌物的響應(yīng)機(jī)制的研究，可以說還是一個未開發(fā)的領(lǐng)域。已經(jīng)有研究證明，細(xì)菌RND外排泵直接參與細(xì)菌有毒物質(zhì)的外排[77]，植物分泌的抗菌素類外排底物或許可以作為生物源藥劑，通過化學(xué)合成其類似物并用于對細(xì)菌的防治。針對RND多耐藥外排泵在病原細(xì)菌/植物互作中的重要作用的研究，也將給我們對細(xì)菌致病機(jī)制、入侵手段、植物防御特點(diǎn)等的研究提供思路。

綜上所述，系統(tǒng)研究植物病原細(xì)菌RND多耐藥外排泵對病原細(xì)菌的科學(xué)防治具有重大意義。相信隨著分子生物學(xué)、生物信息學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的發(fā)展，對于外排泵的研究會更加的深入，這也將會給瓜菜細(xì)菌性病害的防治提供新的更好的措施。