云南文山竹叢枝病的檢測及16S rDNA 片段序列分析

駱帝諭?王連春

摘 要：用植原體16S rRNA基因通用引物P1/P7和R16F2n/R16R2，對表現(xiàn)叢枝的竹子植株總DNA進行直接PCR及巢式PCR擴增，得到長1.2 kb的目的片段。經(jīng)過克隆測序比較分析，結(jié)果表明其屬于16Sr I-B亞組。

關(guān)鍵詞：云南；竹叢枝；16s rDNA

竹是禾本科竹亞科Bambusoideae植物的總稱。竹子是具有極高的觀賞性的一種經(jīng)濟作物，其形態(tài)優(yōu)美，常作為景觀觀賞、道旁植被、公園植物[1]。云南文山州地處云貴高原東南部，屬于亞熱帶氣候，該地區(qū)水熱資源較豐富，年溫差小，日溫差大，比較適合竹子的生長。

竹叢枝病又名“掃帚病”，“竹簇葉病”，在韓國、印度以及中國許多省市均有報道[2-4]。感病植株生長勢弱，出筍減少，嚴重的病竹常常會枯死，竹材質(zhì)量嚴重下降。隨著竹林面積迅速擴大，該病的危害越來越嚴重，已成為竹子上最常見的嚴重病害之一[1，5]。早期的研究認為竹叢枝病是有瘤座菌[Aciculosporium take Miyake，Balansia take（Miyake） Rlara]真菌引起的病害[6]。然而許多植物叢枝病均被證實由植原體引起，隨著分子生物學(xué)研究技術(shù)的進步，通過PCR擴增可以快速鑒定植物材料中是否含有病原，本研究采擬采用PCR技術(shù)對文山表現(xiàn)叢枝癥狀的竹子植株進行植原體分子檢測，并對擴增得到的16S rDNA片段進行克隆及測序，并與已知的竹叢枝植原體16S rDNA進行序列同源性比較，確定其植原體株系的分類地位，并初步比較其各株系間的差別。

1 材料與方法

1.1 材料來源與主要試劑

竹子材料采自云南文山州廣南縣冷水溝，海拔1200m。材料于-80℃保存?zhèn)溆?。基因組DNA提取試劑盒來自百泰克生物技術(shù)有限公司，DNA Marker、Taq酶、Amp、IPTG等試劑購自北京金式金生物科技有限公司。pMD19-T購自寶生物TaKaRa。

1.2 材料總DNA提取

取材料0.5g，剪碎放于研缽中，加入液氮，研磨3-5次，直至成細粉狀。參照植物基因組DNA提取試劑盒的方法，提取植株總DNA干燥后溶于EB buffer溶液，于-20°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 PCR擴增

選用植原體16S rDNA通常用的引物P1/P7和R16F2n/R16R2進行巢式PCR擴增：25μL體系，10 x Easy Taq Buffer 2.5μL ，dNTP 2μL，引物各0.5μL，Easy Taq Polymerase 0.25μL，DNA 模板1μL。PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性94℃ 5min，變性溫度94°C 1min，復(fù)性溫度48°C 1 min，延伸溫度72°C 2 min，總共30次循環(huán)，總延伸10min。巢式擴增程序為：預(yù)變性94℃ 5min，變性溫度94°C 1min，復(fù)性溫度55°C 1min，延伸溫度72°C 1min 30 s，總共35次循環(huán)。擴增產(chǎn)物在1﹪瓊脂糖1×TAE緩沖系統(tǒng)中電泳，每孔加樣3uL，用凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照記錄。

1.4 PCR擴增產(chǎn)物的純化、克隆、酶切鑒定以及序列測定

在紫外透射儀上切下含目的PCR產(chǎn)物瓊脂塊，用新型快速植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）（昆明碩陽科技有限公司），瓊脂塊凝膠上回收目的片段，在含有IPTG和X-gal的LB篩選平板上挑取白色菌落搖菌培養(yǎng)12小時，提取重組質(zhì)粒DNA ，經(jīng)過酶切和跑電泳檢測之后，篩選出正確的質(zhì)粒DNA經(jīng)過克隆送去上海生工生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.5 16S rDNA核酸序列同源性比較和酶切位點分析

采用DNAMAN 6.0、MEGA5.0等生物軟件，分析所測序列的含量，將測定到的序列與植原體組中各個具有代表性植原體的 16S rDNA基因序列進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 感病植株的癥狀表現(xiàn)

感病植株明顯表現(xiàn)為叢枝癥狀，枝條先端枝條簇生，簇生節(jié)間變短，分枝增多，叢生成鳥巢狀，葉片呈現(xiàn)黃化（圖1）。

圖1 感病植株叢枝癥狀圖

2.2 PCR擴增結(jié)果

感病植株通過液氮提取總DNA，經(jīng)巢式PCR 擴增，結(jié)果獲得大小約1 200 bp 的16S rDNA 片段（圖2），片段大小與預(yù)期大小相符，而健康對照未出現(xiàn)特異擴增帶。說明該叢枝樣品中確有植原體存在。

圖2 PCR 電泳檢測圖（M：Maker； 1為健康植株；2，3 為巢式PCR擴增的兩個不同重復(fù)）

2.3 16S rDNA序列分析

將擴增到的1 200 bp左右大小的特異片段經(jīng)割膠純化后，連接pMD19-T，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，涂板后挑取重組克隆，經(jīng)PCR驗證正確的克隆子送上海生工測序， 結(jié)果表明：16S rDNA 基因擴增片段含有1 246個核苷酸，G + C 的含量為47.11 % ，符合植原體基因組G + C含量。將本研究中所獲得分離物命名為bamboo witches-broom phytoplasma ，BWB-WS。從Genbank中調(diào)取竹子叢枝植原體11條序列，并選取Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A，Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078） 16S r I-B作為參照序列，Acholeplasma laidlawii（M23932）作為外群（表1），利用MEGA 5 生物軟件進行植原體16S rDNA序列進行核酸同源性比較，同源性比較結(jié)果表明該研究獲得的植原體與BWB-YA，BWB-TA 同源關(guān)系最近，為99.7%，與已報道的云南另外一個株系BWB3同源關(guān)系為99.2%。與海南的3個株系BWB-Hn1，Hn2，Hn3同源關(guān)系較遠，在 89.4～89.6%之間。經(jīng)在線工具iphyclassifier

根據(jù)16S rDNA序列建立的系統(tǒng)進化樹 （圖2）表明：BWB –WS 和已經(jīng)報道的竹叢枝韓國、楊凌、山東等8個株系聚在一簇，并且和參照序列Paulownia witches-broom phytoplasma （HM146078）聚類在一個大支，同屬16S r I-B 亞組，和參照序列Tomato big bud （BB） （AY180955 ）16S r I-A亞組的成員明顯區(qū)別開，和海南的3個株系不屬于同一個組。在地域上，除了海南3個株系屬于植原體16S r II-A 組外，本研究文山分離物和其他地區(qū)的無明顯地域差別。

圖2基于16S rDNA片段堿基序列建立的竹叢枝植原體系統(tǒng)進化樹

3 討論與結(jié)論

竹子叢枝病，在我國竹產(chǎn)區(qū)廣泛分布，且有不斷加重的趨勢。早期研究有認為瘤座菌確能引起竹類叢枝病，該竹子發(fā)病是否由真菌和植原體共同侵染引起，尚不得而知。本研究用分子生物學(xué)方面進一步證實了云南文山竹叢枝內(nèi)植原體的存在，并初步確定了其分類地位。

我國邱并生、蔡紅、劉永光等對分別采自北京、廣東、云南、山東的鳳尾竹叢枝（femleaf hedge bamboo witchesbroom，F(xiàn)HBWB）、刺竹叢枝（chinese thorny bamboo witchesbroom，BwB）等竹子材料進行了植原體16S rDNA 片段擴增及RFLP分析，結(jié)果表明它們均屬于翠菊黃化（16S r I ）組。本文對采自云南的文山的竹叢枝植原體16S rRNA基因部分序列測定及比較結(jié)果也顯示該株系屬于16S r I組，與前面研究報道結(jié)果一致，這也表明，不同來源，不同品種的竹子上均可感染該組植原體，不受地域品種的限制。經(jīng)在線分析工具iphyclassifier

該研究獲得的植原體分離物屬于16S r I-B亞組，本研究中的材料在云南文山地區(qū)尚屬首次發(fā)現(xiàn)。

參考文獻

[1] 梁惠凌，黃仕訓(xùn)，蔣能等.廣西竹子主要病蟲害的發(fā)生和綜合防治對策[C].//第六屆生物多樣性保護與利用高新科學(xué)技術(shù)國際研討會論文集.2006.

[2] JUNG H Y，CHANG M U，LEE J T，et a1.Detection of “Candidatus phytoplasma asteris”associated with henon bamboo witchesbroom in Korea[J].J Gen Plant Pathol，2006，72（4）：261-263.

[3] 莊啟國，劉應(yīng)高，潘欣等.四川斑竹叢枝病植原體檢測及16S rDNA片斷序列分析[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2005，23（4）：417-419，431.

[4] 劉永光.山東省桑萎縮、棗瘋病、竹叢枝及三種新植原體病害分子檢測與鑒定[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2009.

[5] 楊永剛，吳小芹.竹叢枝病病原研究進展[J].浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報， 2011，28（1）：144-148.

[6] 朱熙樵，黃煥華.竹叢枝病的研究I癥狀、病菌分離和接種試驗[J].林業(yè)科學(xué)，1988，24（4）：483-487.

作者簡介

駱帝諭（1990-），男，云南文山，本科生，研究方向：植物病理學(xué)。

王連春，玉溪師范學(xué)院資源與環(huán)境學(xué)院。