哈薩克藥歐亞繡線菊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

昂沙爾·塔力道 拉扎提·吐爾遜拜 木拉提·克扎衣別克

(伊犁哈薩克自治州哈醫(yī)藥研究所，新疆 伊寧 835000)

歐亞繡線菊來源為薔薇科繡線菊屬歐亞繡線菊(Spiraea media Schmidt)的干燥枝，薔薇科植物繡線菊屬約有100 余種，分布在北半球溫帶至亞熱帶山區(qū)，我國有70 余種，分布于陜西、山東、江蘇、安徽、浙江、江西、湖北、四川、貴州、云南、內(nèi)蒙古、新疆等省區(qū)。在我國繡線菊作為一種藥用植物，很早就有記載，繡線菊作為民間藥在哈薩克醫(yī)中應(yīng)用歷史悠久，范圍廣泛;具有止癢，收斂，抗真菌感染等功效;用于牛皮癬，手足癬，子宮勁糜爛，高血糖引起的口干、咽干，肝炎傳染期等癥［1］。但本品過去一直未建立相應(yīng)的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，致使該藥草一直處于無標(biāo)準(zhǔn)控制狀態(tài)，嚴(yán)重影響了哈薩克醫(yī)臨床用藥的安全性有效性。為了進(jìn)一步開發(fā)歐亞繡線菊資源，使其質(zhì)量可控，確保臨床用藥和工業(yè)生產(chǎn)的安全有效，本研究對歐亞繡線菊質(zhì)量控制的主要技術(shù)進(jìn)行研究，建立相應(yīng)的質(zhì)量控制方法，為制訂該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 藥材: 薔薇科歐亞繡線菊Spiraea media Schmidt。分別采自于新疆昭蘇、察布察爾、霍城等地，經(jīng)新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院植物教研室吾買爾夏提·塔汗教授鑒定，原植物及藥材標(biāo)本現(xiàn)保存于伊犁哈薩克自治州哈醫(yī)藥研究所標(biāo)本室。

1.2 試劑: 95%乙醇、石油醚、福林酚試劑由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供;沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、胡蘿卜苷標(biāo)準(zhǔn)品由成都曼斯特生物科技有限公司提供;硅膠60 熒光薄層層析鋁箔板由德國默克公司提供;純水(自制)。

1.3 儀器: UV-1750 紫外分光光度計(日本津島公司);PL4002 電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司);ZF -107 型紫外分析儀(上海文錦儀器有限公司);DZF -6020型真空干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);WJRO-20 型超純水機(jī)(杭州萬潔水處理設(shè)備有限公司);數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋(常州諾基儀器有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 預(yù)試驗(yàn)溶液的制備

2.1.1 水提取液

2.1.1.1 冷水浸液: 稱取樣品粗粉5.0 g，置于100mL 的三角燒瓶中，加純水50 ～60 mL 室溫浸泡過夜。過濾出約20 mL 濾液供檢查氨基酸，多肽，蛋白質(zhì)用。

2.1.1.2 熱水提取液: 將上述剩余的冷水浸泡液連同濾渣于水浴上60 ℃左右熱浸0.5h，趁熱過濾，濾液供檢查糖，多糖，有機(jī)酸，皂甙，甙類，酚類，鞣質(zhì)等成分用。

2.1.2 乙醇提取液: 另稱取樣品粗粉10.0 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加95%乙醇100 mL，于水浴上加熱回流1h，稍冷后加入純水使其含醇量為70%，冷至室溫，過濾，濾液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中;用100 mL 石油醚(60 ～90 ℃)分兩次萃取，每次用石油醚50 mL，以除去葉綠素等，分出下層乙醇提取液，濃縮至40 ～50 mL，加95%乙醇50 mL 溶解后過濾，濾液供檢查黃酮，蒽醌，香豆素，萜類，甾體化合物，內(nèi)酯化合物，強(qiáng)心苷，有機(jī)酸，酚類，鞣質(zhì)等成分用。

2.1.3 酸性乙醇提取液: 稱取樣品粗粉2.0 g，加0.5%硫酸的乙酸溶液10 mL，于水浴上加熱回流10 min，過濾，濾液供檢查生物堿用。取上述酸性乙醇提取液先用稀氨水調(diào)至中性，再于水浴上蒸干，殘?jiān)?%硫酸5 mL 溶解后，過濾，濾液供以下實(shí)驗(yàn)用。

2.1.4 石油醚提取液: 稱取樣品粗粉1.0 g，加入石油醚(60 ～90 ℃)10 mL，濾液供檢查揮發(fā)油，油脂，萜類，甾體化合物等成分用。

2.2 各類成分的檢查

分別取上述預(yù)試液1 mL 于試管中，參照文獻(xiàn)［2、3、4］，配制相應(yīng)試劑加入盛有供試液的試管中進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，觀察反應(yīng)現(xiàn)象，判斷繡線菊中化學(xué)成分的存在情況。

2.3 化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)檢驗(yàn)歐亞繡線菊枝可能含有糖、皂苷、有機(jī)酸、酚類、鞣質(zhì)、甾體或三萜類、揮發(fā)油、內(nèi)酯、香豆素類、強(qiáng)心苷等成分。

2.4 專項(xiàng)薄層色譜鑒別

2.4.1 繡線菊化學(xué)成分的提取分離: 稱取20.0 g 繡線菊枝粗粉，200 mL 95%乙醇放入平底燒瓶中，索氏提取法提取，待提取結(jié)束，冷卻靜置過濾，濃縮回收乙醇，得浸膏。浸膏中加入10 mL 純水于水浴鍋上65 ℃加熱，再加入10%NaOH 溶液發(fā)生皂化反應(yīng)至無氣泡產(chǎn)生，過濾，得固體產(chǎn)物。

2.4.2 對照品與供試品的制備: 取繡線菊提取物溶于1 mL 甲醇中，超聲處理10 min，制成供試品溶液;取胡蘿卜苷標(biāo)準(zhǔn)品1.91 mg，溶解于1 mL 甲醇中，超聲處理10 min，制成對照品溶液。

2.4.3 薄層色譜實(shí)驗(yàn): 以三氯甲烷-甲醇-水(13: 7: 2下層)為展開劑，在氧化鋁板上點(diǎn)樣10μL，進(jìn)行展開，展開完干燥，噴灑10% 硫酸溶液，于烘箱中105 ℃下加熱5 min，在同一位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，均為紫色，并在365 nm 紫外下同一位置上顯藍(lán)紫色熒光。結(jié)果見圖1，圖2。

圖2 日光下的色譜圖

2.5 總酚含量測定

2.5.1 對照品溶液的配制: 精密稱取5 mg 沒食子酸對照品，置50 mL 容量瓶用純水溶解并稀釋至刻度。精密量取該溶液15 mL，用純水定容至50 mL，即得對照品溶液。(沒食子酸質(zhì)量濃度為30 μg·mL-1)。

2.5.2 樣品溶液的制備: 稱取1.5 g 繡線菊粗粉加入100 mL 95%乙醇置于錐形瓶中，稱定質(zhì)量，加熱回流2 h，放冷再次稱定質(zhì)量，并用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾取濾液。

2.5.3 檢測波長的確定: 精密吸取沒食子酸對照品溶液2.0 mL 和供試品溶液0.5 mL，分別置于10 mL 容量瓶中，加入純水至5.0 mL，加入0.5 mL Folin-Ciocalteu 試劑，搖勻6 min 后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h(避光)。以試劑溶液為空白，于500 ～900 nm 波長處進(jìn)行掃描，結(jié)果見圖3。

試驗(yàn)結(jié)果表明，沒食子酸對照品溶液在745 nm 波長處有最大吸收，供試品溶液在此波長也有最大吸收，故檢測波長為745 nm。沒食子酸濃度在1.5 ～10.5 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。得回歸方程: A =0.0945C +0.0436，相關(guān)系數(shù)r=0.9995。

2.5.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制: 精密量取上述對照品溶液0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL 于10 mL 容量瓶中，加入純水至5.0 mL，加入0.5 mL Folin -Ciocalteu 試劑，搖勻6 min 后加入20%碳酸鈉溶液1.5 mL，用純水定容至10 mL，室溫下反應(yīng)2 h(避光)。以第一個溶液為空白，在745 nm波長處處測定對照品溶液的吸光度，以對照品的含量為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.5.5 精密度試驗(yàn): 精密量取同一批已知濃度的供試品溶液6 份，每份0.5 mL，分別按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)方法下顯色，以試劑溶液為空白對照，進(jìn)行含量測定，重復(fù)3 次。結(jié)果顯示，此方法精密度為1.69%，小于5%，說明此方法穩(wěn)定性良好。

2.5.6 加樣回收率的試驗(yàn): 精密量取同一批已知濃度的供試品溶液10 份，每份0.5 mL，分兩組，一組各加入沒食子酸對照品溶液0.5 mL，另一組各加入1.0 mL，分別按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)方法下顯色，以試劑溶液為空白對照，進(jìn)行含量測定，重復(fù)3 次，并計算回收率。結(jié)果表明，此方法加樣回收率為97.9% ～102.3%，符合測定要求。

2.5.7 歐亞繡線菊醇提液中總酚含量測定及重現(xiàn)性試驗(yàn): 精密量取供試品溶液各5 份，每組0.5 mL，按“標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制”項(xiàng)方法下顯色，以試劑溶液為空白對照，進(jìn)行含量測定，重復(fù)3 次，按以下公式計算供試品中總分類化合物含量。

供試品中總酚含量/mg·g-1= (C × 2 × 10 × 100/1000)/m

其中C 為10mL 供試品溶液中總分濃度/mg·mL-1，m 為供試品取樣量/g。代入回歸方程后所得結(jié)果，見表1。

表1 歐亞繡線菊中總酚含量

3 結(jié)論

近年來，民族用藥在逐漸成為人們關(guān)注的熱點(diǎn)。歐亞繡線菊作為哈薩克民間常用藥之一，在治療各種頑固性皮膚病時有著獨(dú)特的療效。文獻(xiàn)報道繡線菊屬植物中含有黃酮、生物堿、皂苷、鞣質(zhì)、酚酸、香豆素、木脂素等成分，如蘇聯(lián)、日本學(xué)者首次從粉花繡線菊中發(fā)現(xiàn)C -20 二萜生物堿［5］，之后我國學(xué)者又相繼報道了從國產(chǎn)的變種光葉繡線菊［6］及毛萼繡線菊［7］中發(fā)現(xiàn)一系列新的二萜生物堿;謝海輝等從蒙古繡線菊中分離出β-谷甾醇，白樺脂醇，白樺脂酸，白樺脂酸3，5 -二羥基肉桂酸酯和胡蘿卜苷等成分［8］。國外文獻(xiàn)中報道繡線菊屬植物中木脂素、黃酮類、黃酮醇類、香豆素、酚酸等總酚類成分較多［9，10，11］，如繡線菊屬植物金絲桃葉繡線菊中分離出兒茶素、表兒茶素、兒茶素-7-鼠李糖苷、兒茶素-7 -阿糖胞苷、木犀草素-5 -β -D-吡喃葡萄糖苷等成分［12，13］;柳葉繡線菊中分離出肉桂酸，對羥基肉桂酸，對甲氧基肉桂酸，1 -O-香豆酰-β-D-吡喃葡萄糖苷、1 -O -咖啡酰-β -D -吡喃葡萄糖苷、金絲桃苷、槲皮素-3 -(6”-O -α -L -吡喃阿拉伯糖)-β-D-半乳糖苷等［14］;臺灣繡線菊中分離出spiraforminA，B，C，D 等四種新木脂素［15］。但目前歐亞繡線菊的成分研究尚屬空白，為更好地開發(fā)和發(fā)揮歐亞繡線菊在哈薩克醫(yī)治療疾病中的應(yīng)用。本研究按照中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化研究的要求，對不同地產(chǎn)的歐亞繡線菊進(jìn)行了質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。通過查閱古代醫(yī)學(xué)著作和現(xiàn)代有關(guān)歐亞繡線菊的研究文獻(xiàn)，結(jié)合繡線菊屬植物的藥用功效以及所含各種化學(xué)成分的藥理作用與功效的相關(guān)性等，確定了所要考察的指標(biāo)性成分，制定研究方案。參考《中國藥典》2010 版一部以及相關(guān)的研究文獻(xiàn)，確定歐亞繡線菊中指標(biāo)性成分考察的實(shí)驗(yàn)方法。豐富了歐亞繡線菊化學(xué)成分的研究資料，也為今后開發(fā)利用繡線菊屬植物提供了一個檢測方法。

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