HPLC測(cè)定苗藥半截爛中芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的含量△

胡志平 杜 江

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550002)

半截爛(Arisaema rhizomatum C.E.C.Fisch)為天南星科天南星屬多年生草本，根莖入藥。有大毒，辛、溫，解毒止痛、祛風(fēng)除濕。苗族民間多用于風(fēng)濕疼痛、肢體麻木、跌打損傷、無(wú)名腫毒、勞傷疼痛、結(jié)核性潰瘍、癰疽疔毒初期等癥，并將其列為以毒攻毒的“攻毒藥”范疇。在苗醫(yī)著名的“弩藥”處方中半截爛也是常見(jiàn)的主要藥物之一[1]。近年研究發(fā)現(xiàn)，半截爛在鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗驚厥、抗腫瘤、抗炎、抗心律失常方面均有明顯療效，但因其有毒且活性部位或成分不明確，嚴(yán)重制約了半截爛的開(kāi)發(fā)應(yīng)用，由于半截爛被苗族和土家族廣泛的用于治療風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕病且療效確切，因此近年來(lái)半截爛在防治風(fēng)濕和類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等方面的活性受到越來(lái)越多的重視，所以對(duì)半截爛進(jìn)行質(zhì)量及活性方面的研究具有重要的意義[2]。目前的研究提示，半截爛中所含的黃酮類(lèi)成分可能與其活性緊密相關(guān)[3]，而其中的芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷具有抗腫瘤和抗氧化等活性。故選擇芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷作為指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

本課題組對(duì)半截爛有效物質(zhì)成分進(jìn)行了較為深入的研究，并從中首次分離出17個(gè)單體化合物。我們選擇其中的芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷作為半截爛中的指標(biāo)成分進(jìn)行質(zhì)量研究，采用HPLC法建立其含量測(cè)定方法[4]，為其今后的開(kāi)發(fā)利用打下良好的基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器:Agilent1100系列高效液相色譜儀(自動(dòng)進(jìn)樣器，紫外檢測(cè)器，四元泵:美國(guó)，安捷倫公司)，梅特勒－托利多New classic型電子天平(梅特勒－托利多儀器(上海)有限公司)，KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥:乙腈為色譜純(天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心)，水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷對(duì)照品由購(gòu)于西南麥克斯藥品純度大于98%。

半截爛藥材采自貴陽(yáng)近郊，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院孫慶文副教授鑒定為天南星科天南星屬半截爛(Arisaema rhizomatum C.E.C.Fisch)的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件:色譜柱 phenomenex－C18(4.6×150mm，5μm)流動(dòng)相為乙腈 －0.05%磷酸(20:80);檢測(cè)波長(zhǎng)為350nm;流速 1.0mL/min;柱溫 35℃;進(jìn)樣量 20μL;分離度大于 1.5。

2.2 對(duì)照品溶液的制備:取芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品濃度為0.02mg/mL。

圖1 對(duì)照品溶液

2.3 供試品溶液的制備:取半截爛生藥約1.0004g精密稱(chēng)定重量，用甲醇10mL，超聲提取2次，30min/次，放冷，濾過(guò)，合并濾液。蒸干，用甲醇定容至1mL，過(guò)0.45ul的微孔濾膜即得供試品。

圖2 供試品溶液

2.4 線性關(guān)系實(shí)驗(yàn):精密吸取對(duì)照品溶液1ul，2ul，3ul，5ul，7ul，分別進(jìn)樣，于350nm處測(cè)定芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)計(jì)算回歸方程，芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的回歸方程為Y=3058927.58X+61.97，結(jié)果表明芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷在0.2～0.14μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖3 線性關(guān)系試驗(yàn)

2.5 精密度實(shí)驗(yàn):取同一批供試品，按“2.3”法制備供試品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)得峰面積RSD=1.65%。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn):取同一批號(hào)供試品，按2.3項(xiàng)下法制備供試品溶液，每2h進(jìn)樣1次，重復(fù)5次，RSD=2.79%。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn):按樣品測(cè)定方法，對(duì)同一批半截爛藥材進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)5次，測(cè)得峰面積RSD=2.98%。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn):稱(chēng)5份同一批號(hào)已知含量的供試品0.5g，分別加入芹菜素 －7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷1mL，濃度為0.02mg/mL對(duì)照品溶液配成濃度為0.004mg/mL，進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)測(cè)定5次，RSD=3.4%。

2.9 樣品測(cè)定:根據(jù)以上方法測(cè)定得出芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的含量為0.0086%。

3 討論

3.1 經(jīng)過(guò)不同系統(tǒng)選擇，甲醇－0.05%磷酸水和乙腈－0.5%磷酸水等一系列的流動(dòng)相選擇，最終確定乙腈－0.05%磷酸水(20:80)分離度最好，且基線穩(wěn)定不漂移。

3.2 由于半截爛中芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的含量不高，對(duì)半截爛的提取方法進(jìn)行了考察，得出超聲提取30min芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷峰面積相對(duì)要高一些。

[1]潘永華.土家藥四寶[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，1997.3(4).

[2]郭珅珅，杜江.民族藥雪里見(jiàn)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2009，(7):49－51.

[3]陳春霞.民族藥材雪里見(jiàn)生物活性及化學(xué)成分研究[D].華中科技大學(xué)博士論文，2012－05－01.

[4]王麗，馬遠(yuǎn)，陳隨清.構(gòu)樹(shù)葉中牡荊素、芹菜素－7－O－β－D－葡萄糖醛酸苷的含量測(cè)定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39(35):21647－21649.