反相HPLC 法測(cè)定行氣止痛丸中羥基紅花黃色素A 的含量

楊沫銀 宋廣瑩

(1.內(nèi)蒙古食品藥品檢驗(yàn)所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;2.內(nèi)蒙古商貿(mào)職業(yè)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

行氣止痛丸為醫(yī)院制劑方，收載于《中華人民共和國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)》蒙藥分冊(cè)(1998 年版)。功能與主治: 開(kāi)郁行氣，活血止痛。用于胸悶，氣短，胸肋刺痛，“巴木病”［1］。成分: 據(jù)文獻(xiàn)記載［2］，紅花具有活血通經(jīng)、散瘀止痛之功效，其查爾酮類成分羥基紅花黃色素A、黃色素A 為活性成分。因此，為了考察該藥的質(zhì)量，本研究參照有關(guān)資料［3］建立了其有效成分羥基紅花黃色素A 的HPLC 含量測(cè)定方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器: SHIMADZVLC -10Avp，LC -10ATvp 型泵，SCL-10Avp 型控制器，SPD-10AVP 型檢測(cè)器，CLASS -VP 色譜工作站，島津UA-1700 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)。

2.2 試藥: 甲醇、乙腈為色譜純，磷酸為分析純，水為高純水，羥基紅花黃色素A 對(duì)照品(購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào): 111637 -201003)，樣品由內(nèi)蒙古中蒙醫(yī)院提供。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件: 色譜柱: Diamonsil(鉆石)C18 柱(250mm×4.6mm，5μm);流動(dòng)相: A: 甲醇-乙腈(19: 2)B: 0.7%磷酸溶液(以三乙胺調(diào)節(jié)pH 值至6.0 ±0.1)，A: B(23: 77);流速: 1.0 mL/min;柱溫: 40℃;進(jìn)樣量: 20μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為

403nm。

2.2 對(duì)照品溶液的制備: 精密稱取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品適量，加25%甲醇制成每1mL 中含45μg 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備: 取本品約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25%甲醇100mL，稱定重量，超聲處理(功率120W，頻率40KHZ)40min，放冷，再稱定重量，用25%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液過(guò)微孔濾膜(0.45μm)，即得。

2.4 專屬性考察: 取按處方比例并以相同工藝制備的缺紅花的陰性對(duì)照，按供試品溶液制備法制得陰性對(duì)照品溶液。在上述色譜條件下，分別精密吸取對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液、供試品溶液各20μL，分別注入液相色譜儀，測(cè)得結(jié)果為: 供試品溶液中色譜峰保留時(shí)間與羥基紅花黃色素A 對(duì)照品一致，且陰性供試品色譜圖中在與羥基紅花黃色素A對(duì)照品以及供試品色譜相對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)干擾，表明該含量測(cè)定方法專屬性好。(色譜圖見(jiàn)圖1、2、3)

2.5 線性關(guān)系考察: 取羥基紅花黃色素A 對(duì)照品約3.0mg，精密稱定，置50mL 量瓶中，加25%甲醇使溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1. 0、3. 0、5. 0、7. 0、9. 0、10.0mL，分別置10mL 量瓶中，加25%甲醇至刻度，搖勻，各吸取20μL 進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸分析，回歸方程為Y=2935395X-20646 r=0.9998。結(jié)果羥基紅花黃色素A在0.1304 ～1.304μg 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn): 取同一供試品溶液，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定羥基紅花黃色素A 峰面積積分值，RSD為1.02%。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn): 取同一供試品溶液，室溫放置(避光)，在上述色譜條件下，分別于0h、2h、4h、8h、12h、24h 進(jìn)樣測(cè)定羥基紅花黃色素A 峰面積積分值，RSD 為0.96%。試驗(yàn)結(jié)果表明羥基紅花黃色素A 在24h 基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn): 取同一批號(hào)樣品，平行制備6 份供試品溶液，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，RSD 為0.82%。

2.9 加樣回收試驗(yàn): 取已知含量的供試品6 份，各約0.5g，精密稱定，分別精密加入羥基紅花黃色素A 對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備樣品溶液，進(jìn)樣20μL，按上述方法測(cè)定每份含量，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.10 樣品含量測(cè)定: 取3 批樣品各2 份，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，并依法測(cè)定，3 批樣品的測(cè)定結(jié)果分別為5.23mg/g、5.18mg/g、5.20mg/g。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的選擇: 參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部“紅花”項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，以甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液(26: 2: 72)為流動(dòng)相進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果羥基紅花黃色素A 與其它成分分離不好，峰型不對(duì)稱，經(jīng)試驗(yàn)摸索將流動(dòng)項(xiàng)改為A: 甲醇-乙腈(19: 2)作為有機(jī)相，B: 0.7%磷酸溶液(以三乙胺調(diào)PH 至6.0 ±0.1)作為水相，通過(guò)不同比例比較試驗(yàn)，將流動(dòng)相的比例為A: B(23: 77)時(shí)，樣品中的羥基紅花黃色素A 與其它成分均達(dá)到較好的分離(分離度為3.27)，峰型較好(拖尾因子1.09)，并具較適合的保留時(shí)間，故將流動(dòng)相定為A: B(23: 77)。

3.2 柱溫的選擇: 參照《中國(guó)藥典》2010 年版一部“紅花”項(xiàng)下選擇30℃柱溫時(shí)，柱壓偏高，測(cè)定成分與其它成分分離不好;柱溫升高到40℃時(shí)使流動(dòng)項(xiàng)粘度減小，柱壓降低并改善分離效果，故將柱溫定為40℃。

［1］衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)蒙藥分冊(cè)［S］.1998: 90.

［2］王寶琴.中成藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究［M］.中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，211.

［3］國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典［S］. 一部. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010