西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活力的影響及其可能的分子機(jī)制探討

王文慧，王曉玲

(蘭州軍區(qū)臨潼療養(yǎng)院藥械科，西安 710600)

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西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活力的影響及其可能的分子機(jī)制探討

王文慧※，王曉玲

(蘭州軍區(qū)臨潼療養(yǎng)院藥械科，西安 710600)

摘要：目的研究西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇對人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞活力的影響及其可能分子機(jī)制。方法培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株，分為空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組，通過噻唑藍(lán)(MTT)法檢測細(xì)胞活力、劃痕試驗檢測細(xì)胞遷移能力、Western-blot法檢測基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、表皮生長因子受體(EGFR)的mRNA和蛋白水平。結(jié)果①聯(lián)合用藥組的MTT值(36±7)和遷移能力相對值(21±6)，低于西妥昔單組的MTT值(62±10)、遷移能力相對值(55±10)和紫杉醇組的MTT值(59±11)、遷移能力相對值(57±10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。②聯(lián)合用藥組EFGR、MMP-2的mRNA含量分別為(50±14)、(45±11)，低于西妥昔單組的(67±18)、(69±16)和紫杉醇組的(60±17)、(64±19)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合用藥組的EFGR、MMP-2蛋白含量分別為(43±13)、(36±8)，低于西妥昔單組的(69±15)、(64±10)和紫杉醇組(56±14)、(63±9)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。結(jié)論西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過抑制EFGR、MMP-2的表達(dá)來實現(xiàn)的。

關(guān)鍵詞：鼻咽癌；西妥昔單抗；紫杉醇；增殖；遷移

鼻咽癌是一類具有高度惡性生物學(xué)行為的上皮源性腫瘤，近年來發(fā)病率不斷升高。放射治療是該病的主要治療手段，可以取得較高的局部控制率，但由于鼻咽癌細(xì)胞生長迅速及高轉(zhuǎn)移特性，仍有較高的局部復(fù)發(fā)和(或)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率。基于鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移等惡性生物學(xué)行為，探尋能夠抑制該生物學(xué)行為的治療方式具有積極的臨床應(yīng)用前景[1-2]。本研究通過培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株來分析西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇對其增殖、遷移能力影響及其可能的分子機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1材料與方法

1.1材料人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞株購買于中科院細(xì)胞庫；DMEM(dulbecco′s modified eagle medium)培養(yǎng)基和胎牛血清均購買于美國Sigma公司；抗體購買于美國Abcam公司；離心管和細(xì)胞培養(yǎng)板購買于美國Corning公司；西妥昔單抗、紫杉醇等藥品購買于美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞復(fù)蘇和培養(yǎng)方法將細(xì)胞從液氮罐中取出后迅速置于37 ℃水浴鍋中，并將細(xì)胞懸液移入15 mL離心管中，1000×g離心10 min，棄上清后用5 mL含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基重懸，移入培養(yǎng)瓶中在37 ℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞鋪滿70%～80%且處于對數(shù)生長期時，用胰酶常規(guī)消化、傳代并終于12孔板。

1.2.2細(xì)胞處理方法當(dāng)12孔板內(nèi)細(xì)胞鋪滿70%～80%后，將含血清的DMEM更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)24 h，而后分別用不含藥物的DMEM(空白對照組)、50 μg/L 西妥昔單抗(西妥昔單抗組)、100 μg/L紫杉醇(紫杉醇組)、50 μg/L 西妥昔單抗聯(lián)合100 μg/L紫杉醇(聯(lián)合用藥組)處理。24 h后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.2.3噻唑藍(lán)法藥物處理24 h后，小心吸去上清，加入160 μL DMEM培養(yǎng)基、40 μL 0.5%噻唑藍(lán)(MTT)溶液，孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。而后吸盡上清，每孔加入200 μL二甲基亞砜，置于搖床上低速振蕩10 min，而后在酶標(biāo)測儀上檢測490 nm 處的吸光值，并以此直接反映活細(xì)胞數(shù)目。令對照組細(xì)胞的增殖能力為100，求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖能力的相對值。

1.2.4劃痕試驗藥物處理同時用無菌的200 μL槍頭在細(xì)胞孔中央做一劃痕，于鏡下觀察并拍照記錄(0 h)；在孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h后于鏡下觀察并拍照記錄(24 h)。用Image J分析圖像劃痕面積A0、A24，計算(A0-A24)/A0并以此來反應(yīng)細(xì)胞的遷移能力。令對照組細(xì)胞的遷移能力為100，求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組細(xì)胞遷移能力的相對值。

1.2.5實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)采用Trizol法抽細(xì)胞中的總mRNA、并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件：95 ℃、15 s，特異性退火溫度、30 s，72 ℃、30 s，40個循環(huán)。分別擴(kuò)增同一樣本的目的基因和看家基因，利用其ΔCt值進(jìn)行相對定量。即用同組中每個樣本目的基因的Ct值減去的β-actin 的Ct值(ΔCt)，再用處理組的ΔCt減去對照組的Δct(ΔΔCt)，代入公式2-ΔΔCt計算即得到處理組相對對照組mRNA含量的相對值，并以空白對照組的目的基因mRNA含量為100、求出西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組目的基因mRNA含量。

1.2.6Western-blot提取細(xì)胞蛋白后于4 ℃、12 000×g離心10 min，取上清進(jìn)行電泳。按配方配置4%的濃縮膠和10%的分離膠，點樣后進(jìn)行100 V、20 min，120 V、90 min的垂直電泳和100 V、90 min的電轉(zhuǎn)膜。完成后取出硝酸纖維素膜用5%脫脂牛奶封閉2 h，TBST洗滌5 min×3遍，根據(jù)分子量裁剪NC膜并分別加入1∶1000的表皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor，EGFR)、基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、actin第一抗體，4 ℃搖床孵育過夜。第2天取出NC膜，TBST洗滌5 min×3遍，加入1∶1000的辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體、室溫孵育2 h后，用TBST洗滌10 min×3遍。最后進(jìn)行顯影。計算蛋白條帶的灰度值，以目的基因灰度值/actin灰度值作為蛋白含量，令對照組的目的基因蛋白含量的均值為100，計算西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組的蛋白含量。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞增殖能力空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組的MTT值分別為(100±18)、(62±10)、(59±11)、(36±7)，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.644,P<0.05)，其中西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組的MTT值均低于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.854，8.485，16.394，均P<0.05)，且聯(lián)合用藥組的MTT值低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=8.979，7.668，均P<0.05)。見圖1。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組和紫杉醇組比較，P<0.05圖1　不同處理組CNE-1細(xì)胞的MTT檢測結(jié)果

2.2細(xì)胞遷移能力4組細(xì)胞0 h和24 h時的劃痕情況見圖2(上)，空白對照組、西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組的遷移能力相對值分別為(100±20)、(55±10)、(57±10)、(21±6)，4組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=21.895,P<0.05),其中西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組的遷移能力相對值均低于空白對照組(t=9.942，9.483，17.686，均P<0.05)，且聯(lián)合用藥組的遷移能力相對值低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=12.845，12.029，均P<0.05)。見圖2。

2.3影響細(xì)胞增殖、遷移能力可能的分子機(jī)制西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組EGFR的mRNA和蛋白含量均低于空白對照組(t=6.987，7.283，10.485，均P<0.05；t=6.203，8.985，11.985，均P<0.05)，西妥昔單抗組、紫杉醇組、聯(lián)合用藥組MMP-2的mRNA和蛋白含量均低于空白對照組(t=6.183、7.049、11.094，均P<0.05；t=7.049、7.193、14.495，均P<0.05)，且聯(lián)合用藥組EGFR的mRNA和蛋白含量低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=5.596，5.183，均P<0.05；t=5.484，5.039，均P<0.05)，聯(lián)合用藥組MMP-2的mRNA和蛋白含量低于西妥昔單抗組和紫杉醇組(t=5.876,4.895,均P<0.05；t=9.495,8.918，均P<0.05)。紫杉醇組EGRF的mRNA水平和蛋白含量低于西妥昔單抗組(t=3.143，4.371,P<0.05)，紫杉醇組MMP-2的mRNA水平和蛋白含量低于西妥昔單抗組(t=5.312,6.110,P<0.05)。見表1，圖3。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組和紫杉醇組比較，P<0.05

圖2不同處理組CNE-1細(xì)胞的劃痕試驗結(jié)果

表1各組細(xì)胞EGFR、MMP-2的mRNA和蛋白水平

組別EGFRmRNA水平蛋白水平MMP-2mRNA水平蛋白水平空白對照組100±23100±19100±24100±21西妥昔單抗組67±18a69±15a69±16a64±10a紫杉醇組60±17ab56±14ab64±19ab63±9ab聯(lián)合用藥組50±14abc43±13abc45±11abc36±8abcF10.38412.91712.05715.539P<0.05<0.05<0.05<0.05

a與空白對照組比較，P<0.05；b與西妥昔單抗組比較，P<0.05；c與紫杉醇組比較，P<0.05;EGFR：表皮生長因子受體；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2

3討論

紫杉醇是一種具有廣譜抗腫瘤作用的植物堿，屬于有絲分裂抑制劑，可以誘導(dǎo)和促進(jìn)微管蛋白聚合成微管，同時抑制已形成的微管解聚，產(chǎn)生穩(wěn)定的微管束[1]。由于微管束的正常動態(tài)再生受阻，細(xì)胞在有絲分裂時不能形成正常的有絲分裂紡錘體，染色體就不能向兩極移動，使腫瘤細(xì)胞阻滯于G2期和M期，最終阻止有絲分裂的完成，從而抑制細(xì)胞的分裂與增殖[2]。西妥昔單抗是一種抗EGFR的新型人鼠嵌合型單克隆抗體，已被作為治療浸潤進(jìn)展期頭頸部鱗狀上皮細(xì)胞癌的分子靶向藥物應(yīng)用于臨床，取得了滿意的療效[3]。

盡管紫杉醇和西妥昔單抗能夠促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞的凋亡，但在兩種藥物單獨應(yīng)用時并不能完全阻斷腫瘤細(xì)胞的增殖過程，因而無法有效控制鼻咽癌的發(fā)展和浸潤[4]。Sung等[5]的研究用西妥昔單抗和紫杉醇共同處理鼻咽癌細(xì)胞株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種能夠在抑制腫瘤增殖和遷移方面發(fā)揮協(xié)同作用。近年來，國內(nèi)也逐步開展了關(guān)于鼻咽癌生物學(xué)行為方面的研究，楊永凈等[6]和黃宇賢等[7]分別報道了紫杉醇和西妥昔單抗對鼻咽癌細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)節(jié)作用，但是關(guān)于兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用仍缺乏相關(guān)的研究。本研究結(jié)果顯示，西妥昔單抗組、紫杉醇組的增殖和遷移能力均低于空白對照組，這與楊永凈[6]和黃宇賢等[7]的結(jié)果相一致，西妥昔單抗和紫杉醇單獨應(yīng)用均能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移能力。進(jìn)一步通過觀察聯(lián)合用藥組的細(xì)胞增殖和遷移能力可知，兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用能夠更為明顯地抑制細(xì)胞的遷移和增殖能力。

a與空白對照組比較，P<0.05；b與聯(lián)合用藥組比較，P<0.05；EGFR：表皮生長因子受體；MMP-2：基質(zhì)金屬蛋白酶2

圖3各組細(xì)胞增殖、遷移能力比較

目前，對于西妥昔單抗和紫杉醇抗腫瘤的機(jī)制尚未闡明，其潛在的分子作用靶點仍處于未知狀態(tài)。探尋在鼻咽癌細(xì)胞增殖、遷移過程中的關(guān)鍵分子，有助于為尋找更為有效的生物治療靶點[8]。MMP-2屬于蛋白酶家族，是參與細(xì)胞外基質(zhì)降解的關(guān)鍵分子，與腫瘤細(xì)胞向周圍的浸潤密切相關(guān)[2]；EGFR屬酪氨酸蛋白激酶類受體家族，參與腫瘤細(xì)胞中多種信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過下游磷脂酰肌醇3 激酶、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶、核因子κB 等信號通路來介導(dǎo)細(xì)胞的增殖過程[9]。本研究通過實時定量PCR和Western-blot的方法檢測MMP-2、EGFR 的mRNA和蛋白含量可知，西妥昔單抗和紫杉醇均能抑制EGFR、MMP-2的表達(dá)；并且兩者具有協(xié)同作用，聯(lián)合給藥對EGFR、MMP-2的抑制作用更為明顯。這就說明下調(diào)EGFR、MMP-2可能是西妥昔單抗和紫杉醇發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制，同時也為臨床尋找鼻咽癌的治療提供了新的分子靶點。

綜上所述，西妥昔單抗聯(lián)合紫杉醇能夠抑制人鼻咽癌CNE-1細(xì)胞的增殖和遷移能力，這一作用可能是通過抑制EGFR、MMP-2的表達(dá)來實現(xiàn)的。

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Effects of Cetuximab Combined with Paclitaxel on Proliferation and Migration of Nasopharyngeal Carcinoma Cell Line CNE-1 and Its Possible Molecular MechanismsWANGWen-hui，WANGXiao-ling.(DepartmentofMedicineandEquipment,LintongSanitoriumofLanzhouMilitaryAreaCommand,Xi′an710600,China)

Abstract:ObjectiveTo study the effect of cetuximab combined with paclitaxel on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 and its possible molecular mechanism.MethodsNasopharyngeal carcinoma cell line CNE-1 were cultured and divided into blank contrast group,cetuximab group,paclitaxel group and combination group.Then cell vitality was detected by MTT,migration was detected by wound-healing assay and level of matrix metalloproteinase-2 (MMP-2),epithelial growth factor receptor (EGFR) was detected by real-time PCR and Western-blot.Results①MTT value(36±7) and migration ability(21±6) of the combination group were lower than MTT value(62±10) and migration ability(55±10) of the cetuximab group,MTT value(59±11) and migration ability(57±10) of the paclitaxel group(P<0.05).②EGFR,MMP-2 mRNA levels (50±14),(45±11) of the combination group were lower than (67±18),(69±16) of the cetuximab group,(60±17),(64±19) of the paclitaxel group(P<0.05);EGFR,MMP-2 protein levels (43±13),(36±8) of the combination group were lower than (69±15),(64±10) of the cetuximab group and (56±14),(63±9) of the paclitaxel group(P<0.05).ConclusionCetuximab combined with paclitaxel can reduce the migration and proliferation ability of carcinoma cell line CNE-1,and inhibition on MMP-2,EGFR might be the molecular mechanisms.

Key words:Nasopharyngeal carcinoma; Cetuximab; Paclitaxel; Proliferation; Migration

收稿日期：2014-11-14修回日期：2014-05-03編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.20.066

中圖分類號：R979.1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)20-3822-04