腈水合酶交聯(lián)酶聚集體在生成煙酰胺體系中的應(yīng)用

姜艷軍，牟海霞，周麗亞，高靜

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

腈水合酶交聯(lián)酶聚集體在生成煙酰胺體系中的應(yīng)用

姜艷軍，牟海霞，周麗亞，高靜

（河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院，天津 300130）

采用交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）技術(shù)和球化酶技術(shù)對來自大腸桿菌的ES-NHT-118腈水合酶進行固定化．利用大分子葡聚糖醛作為交聯(lián)劑交聯(lián)腈水合酶，在優(yōu)化了溫度、pH、交聯(lián)劑用量及交聯(lián)時間后，腈水合酶CLEAs和球化酶的酶活回收率分別達到49.63%及52.88%．利用掃描電子顯微鏡對2種固定化酶進行了表征，將固定化酶用于催化3-腈基吡啶轉(zhuǎn)化生成煙酰胺．同游離酶相比，腈水合酶CLEAs和球化酶顯示了良好的pH穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性，對高濃度底物的耐受性也有提升．酶活為4 U/m L，底物終濃度為50 mmol/L時，2種固定化酶在重復(fù)使用10次后分別保留了73.45%及61.26%的催化產(chǎn)率．

腈水合酶；固定化酶；交聯(lián)酶聚集體；葡聚糖醛；球化酶

腈水合酶（EC 4.2.1.84）是一種可以將腈類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酰胺類物質(zhì)的酶，例如：在全細(xì)胞或者游離的腈水合酶的催化作用下，丙烯腈可以轉(zhuǎn)化為丙烯酰胺，3-腈基吡啶可以轉(zhuǎn)化為煙酰胺．酰胺類物質(zhì)在有機合成、醫(yī)藥、農(nóng)藥等方面有著十分重要的應(yīng)用[1-4]．同全細(xì)胞相比，游離的腈水合酶更受青睞，因為它具有嚴(yán)格的化學(xué)、區(qū)域和對映選擇性及底物專一性[5-6]．但是，游離酶的使用通常會因為價格昂貴，溫度、pH和操作穩(wěn)定性低，難以回收利用等因素受到限制．

將酶進行固定化可以在一定程度上提高酶的耐受性，并且能夠循環(huán)使用，方便下游過程的操作．目前報道的腈水合酶固定化技術(shù)主要包括交聯(lián)酶聚集體（CLEAs）技術(shù)、溶膠-凝膠包埋技術(shù)等[7-9]．交聯(lián)酶聚集體技術(shù)是一種無載體固定化技術(shù)，通過酶分子的氨基和交聯(lián)劑的醛基形成席夫堿使酶分子連接，這種方法幾乎可以適用于任何種類的酶，如青霉素酰化酶，甲醇脫氫酶，脂肪酶，漆酶，腈水解酶[10-13]等．通過交聯(lián)酶聚集體技術(shù)制備的固定化酶具有穩(wěn)定性較高、容易回收及可重復(fù)使用的特點，同時擁有高酶活回收率[14-17]．由于戊二醛價格低廉且容易獲取，是CLEAs形成過程中最常用的交聯(lián)劑．其缺點是，一些酶經(jīng)過戊二醛交聯(lián)后只有少量酶活性保留甚至完全失去活性[18-19]．為了解決這個問題，有報道采用由葡聚糖氧化制得的葡聚糖醛作為交聯(lián)劑制備CLEAs[20-21]．

同戊二醛交聯(lián)相比，經(jīng)過葡聚糖醛交聯(lián)的酶活明顯提高，葡聚糖醛的使用在一定程度上解決了CLEAs酶活回收率低的問題，但CLEAs形貌和大小仍是不可控的．在應(yīng)用過程中經(jīng)過離心或過濾分離后，CLEAs團聚比較緊密，很難再重新分散到應(yīng)用體系中．Brady課題組提出了一種球化酶技術(shù)，即將含酶的親水相分散在油相中，形成油包水乳化液，再利用雙功能或者多功能交聯(lián)試劑將乳化液中的酶分子進行交聯(lián)，固定成球狀，該課題組成功將球化酶技術(shù)用于脂肪酶的固定[22]．球化酶在水油兩相中形成，可以在一定程度上影響酶的方向，有利于酶在兩相界面上定位；球化酶技術(shù)形成的是粒徑可控的球狀結(jié)構(gòu)，有利于固定化酶在反應(yīng)體系中的分散，且球狀結(jié)構(gòu)擁有較大的比表面積更利于固定化酶與底物接觸反應(yīng)．同時，球化酶的制備過程簡單，成本低廉，因此本實驗將引入球化酶技術(shù)對腈水合酶進行固定化．

本實驗采用產(chǎn)自大腸桿菌的ES-NHT-118腈水合酶為模型酶，以葡聚糖醛作為交聯(lián)劑，分別采用交聯(lián)酶聚集體技術(shù)和球化酶技術(shù)對腈水合酶進行固定化．考察并優(yōu)化了固定化酶的制備條件，探究了pH、溫度及高濃度底物對固定化酶催化效率的影響，并對酶的重復(fù)使用性進行了考察．

1 材料及方法

1.1 實驗材料

腈水合酶ES-NHT-118，購買自浙江寶賽生物科技有限公司，菌種為重組大腸桿菌．葡聚糖、NaIO4、戊二醛、Na2HPO412H2O、NaH2PO42H2O、H3PO4、苯、甲苯、3-腈基吡啶這些試劑均為分析純．蛋清液取自新鮮雞蛋．

1.2 實驗儀器

集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康技術(shù)公司；離心機，Baida；電子天平、pH計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；高效液相色譜，Agilent Technologies．

1.3 實驗方法

1.3.1 葡聚糖醛的制備

1.65 g的葡聚糖溶于50mL蒸餾水，向其中加入3.85g高碘酸鈉（過量），混合液在室溫下攪拌反應(yīng)90m in．反應(yīng)后的溶液經(jīng)過透析膜透析去除殘余高碘酸鈉，冷凍干燥后備用．

1.3.2 腈水合酶CLEAs的制備

1m L腈水合酶加入0.1m L蛋清及2m L飽和硫酸銨溶液，4℃磁力攪拌30m in后加入0.1m L葡聚糖醛（30mg/m L），繼續(xù)反應(yīng)2 h后離心（5000 r/m in，5m in），沉淀用0.05mol/L pH為7的磷酸緩沖液（PBS）洗滌3次即制備得到CLEAs．

1.3.3 球化腈水合酶的制備

在4℃攪拌狀態(tài)下，向含5m L苯/甲苯溶液（體積比為3∶1），及0.2 g span-20的離心管中逐滴加入1m L蛋清蛋白，攪拌乳化0.5h后向其中加入0.1m L 25%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）戊二醛，交聯(lián)0.5h后停止攪拌．4℃冰箱冷藏4 h穩(wěn)定交聯(lián)，反應(yīng)結(jié)束后離心，棄上清液，蛋清蛋白球用蒸餾水洗滌3次．

稱取0.1 g濕球化蛋白，定容至1m L后與0.1mL葡聚糖醛（30mg/m L）溶液反應(yīng)2 h，使葡聚糖醛連接在蛋白球表面．離心棄上清液，沉淀用PBS洗滌3次以去除殘留的葡聚糖醛．向修飾后的蛋白球中加入1m L游離酶和1m L飽和硫酸銨溶液，交聯(lián)3h后離心棄上清液，沉淀用PBS洗滌3次，獲得球化腈水合酶，冷藏備用．

1.3.4 酶活定義及測定

酶活檢測：向一定量的酶中加入終濃度為50mmol/L的3-腈基吡啶，30℃反應(yīng)5m in，向反應(yīng)體系中加入1mLHCl(1mol/L)終止反應(yīng)．過濾后，用高效液相色譜對反應(yīng)液進行檢測．檢測條件為：使用4.6×100的C18柱進行分離，流動相為NaH2PO4-H3PO4緩沖液（pH=2.8）與乙腈的混合液（體積比為80∶20），在室溫下以1m L/m in的流速流動，使用DAD檢測器在235 nm條件下檢測．

1.3.5 CLEAs和球化酶的電鏡表征

將制備好的CLEAs和球化酶均勻分散于水相中，將分散有2種固定化酶的液體小心的滴加在硅片上，干燥后利用掃描電子顯微鏡（SEM ZeissDSM-950）檢測固定化酶的形貌．

1.3.6 不同濃度的酶催化50mmol/L 3-腈基吡啶的進程曲線

在30℃下，分別取5m L不同濃度的游離酶（0.4～3.2mg/m L）溶液，向其中加入5 m L終濃度為50mmo l/L的3-腈基吡啶開始反應(yīng)．每隔一定時間取0.1m L反應(yīng)液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．

1.3.7 pH對煙酰胺產(chǎn)率的影響

在一定量pH為4～10的游離酶、CLEAs和球化酶中分別加入終濃度為50mmol/L 3-腈基吡啶，30℃下反應(yīng)1h，取0.1m L反應(yīng)液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．1.3.8溫度對煙酰胺產(chǎn)率的影響

在一定量pH為7的游離酶、CLEAs和球化酶中分別加入終濃度為50 mmol/L 3-腈基吡啶，不同溫度下反應(yīng)1h，取0.1m L反應(yīng)液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．

1.3.9 CLEAs和球化腈水合酶的熱穩(wěn)定性

取一定量的游離酶、CLEAs和球化酶，分別在30℃、40℃、50℃的水浴中放置1～6h，在冰水浴中快速降溫后分別加入終濃度為50mmol/L 3-腈基吡啶，在30℃下反應(yīng)4 h，取0.1m L加入1mol/L HCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．

1.3.10 游離酶、CLEAs和球化酶催化不同濃度3-腈基吡啶的進程曲線

在30℃下，分別取5m L 4U/m L的游離酶、CLEAs和球化酶加入5m L不同濃度的3-腈基吡啶（終濃度50～300mmol/L），每隔一定時間取0.1m L加入1mol/L HCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．

1.3.11 CLEAs和球化酶的重復(fù)使用性

在30℃下，分別取10U的腈水合酶CLEAs和球化酶中加入5m L不同濃度的3-腈基吡啶（終濃度50～200mmol/L），反應(yīng)4 h后離心，取0.1m L上清液加入1mol/LHCl稀釋并終止反應(yīng)．過濾后用液相色譜測定底物的生成量并確定產(chǎn)率．再將固定化酶離心洗滌3次，去上清液，加入5 m L對應(yīng)終濃度底物，繼續(xù)新一輪反應(yīng)．

所有實驗數(shù)據(jù)均取3次平行實驗結(jié)果的均值．

2 結(jié)果與討論

2.1 CLEAs和球化酶的電鏡表征

利用葡聚糖醛作為交聯(lián)劑，采用了交聯(lián)酶聚集體技術(shù)和球化酶技術(shù)對腈水合酶酶進行固定化，按照1.3.5方法，利用掃描電子顯微鏡對CLEAs和球化酶的形貌進行表征，其結(jié)果如圖1所示．

由圖1a）可以看出，葡聚糖醛交聯(lián)的CLEAs呈多孔的無規(guī)則結(jié)構(gòu)，多孔的存在有利于反應(yīng)底物及產(chǎn)物的自由進出，極大程度的降低擴散限制從而提高酶活性[19]．然而，不規(guī)則的形貌使CLEAs在離心或過濾后會緊密聚集，難于分散重復(fù)使用，且這種情況會隨著離心次數(shù)的增多而加?。?/p>

2.2 酶濃度對煙酰胺產(chǎn)率的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛纫欢〞r，為了防止酶的浪費，按照1.3.6方法，研究了不同酶濃度催化50 mmol/L 3-腈基吡啶對煙酰胺產(chǎn)率的影響，并確定50mmol/L底物對應(yīng)的適宜酶量和反應(yīng)時間，其結(jié)果如圖2所示．

圖1 CLEAs和球化酶的掃描電鏡圖Fig.1 SEM imagesof CLEAs and Spherezymes

從圖2中可以看出，酶濃度為0.4～3.2mg/m L，催化50mmol/L3-腈基吡啶反應(yīng)10h后，煙酰胺產(chǎn)率分別為36.82%，70.32%，98.59%，98.51%，99.64%．在酶濃度低于1.6mg/m L時，煙酰胺產(chǎn)率隨酶濃度的增加而增大，在1.6mg/mL時達到最大值，繼續(xù)增加酶濃度，產(chǎn)率沒有明顯改變．因此，選定酶濃度為1.6mg/m L用于后續(xù)實驗，此時酶活性約為4 U/m L．

2.3 pH對煙酰胺產(chǎn)率的影響

為了使酶在反應(yīng)過程中有適宜的pH環(huán)境，按照1.3.7方法，研究了不同pH對煙酰胺產(chǎn)率的影響，其結(jié)果如圖3所示．

從圖3中可以看出，3種酶均在pH為7的條件下展現(xiàn)了最高的產(chǎn)率，游離酶、CLEAs和球化腈水合酶在pH為7對應(yīng)的煙酰胺產(chǎn)率分別為54.14%、55.15%和57.75%，說明游離酶的最適pH接近7，且經(jīng)過固定化后最適pH未發(fā)生改變．此外，固定化后的腈水合酶對pH的耐受性有了一定程度的提高，如在pH為4時，游離酶的煙酰胺產(chǎn)率為0.98%，CLEAs和球化腈水合酶的煙酰胺產(chǎn)率分別為26.74%和29.01%，在pH為10的環(huán)境中，游離酶的煙酰胺產(chǎn)率為5.42%，CLEAs和球化腈水合酶的煙酰胺產(chǎn)率分別為37.37%和33.27%．通過數(shù)據(jù)結(jié)果對比可得，經(jīng)過固定化以后的酶在酸性和堿性環(huán)境中的耐受性都有一定程度的提高．因為固定化酶經(jīng)過交聯(lián)作用，使酶的亞基更加穩(wěn)定，在面對pH、溫度、高濃度底物的影響時，表現(xiàn)出了更好的穩(wěn)定性，同游離酶相比，表現(xiàn)了更高的催化效率．

2.4 溫度對煙酰胺產(chǎn)率的影響

溫度升高有利于底物與酶分子的接觸反應(yīng)，但同時過高的溫度也會使酶變性失活，因此，為確定最適宜的反應(yīng)溫度，按照1.3.8方法，研究了不同溫度對煙酰胺產(chǎn)率的影響，其結(jié)果如圖4所示．

圖2 酶濃度對煙酰胺產(chǎn)率的影響Fig.2 Effectofenzyme concentration on theyield of nicotinam ide

圖3 pH對煙酰胺產(chǎn)率的影響Fig.3 Effectof pH on theyield ofnicotinamide

由圖4可以看出，游離酶、CLEAs和球化酶的最適溫度分別在30℃、50℃、40℃，對應(yīng)的煙酰胺產(chǎn)率分別為54.97%、68.64%和60.37%．固定化酶同游離酶相比，在高溫條件下的催化效率更高，說明同樣條件下固定化酶由于高溫變形造成的酶活性損失更?。驗榻?jīng)過交聯(lián)，酶分子通過交聯(lián)劑連接，在高溫條件下酶分子受分子間作用力的影響，使自身的構(gòu)象更加穩(wěn)定．CLEAs的最適溫度比球化酶更高，可能是因為它在無規(guī)則連接的過程中受到更多交聯(lián)劑的連接，使得它受更過分子間作用力，從而比球化酶的構(gòu)象更穩(wěn)定．

2.5 CLEAs和球化酶的熱穩(wěn)定性

由于酶在應(yīng)用過程中會長時間處于一個溫度條件下，有必要對酶的熱穩(wěn)定性進行考察．根據(jù)溫度影響的結(jié)果，選取了30℃、40℃、50℃為CLEAs和球化酶的熱穩(wěn)定性的測試溫度，按照1.3.9節(jié)方法，研究CLEAs和球化酶的熱穩(wěn)定性，其結(jié)果如圖5所示．

圖4 溫度對煙酰胺產(chǎn)率的影響Fig.4 Effectof temperatureon the yield ofnicotinam ide

圖5 CLEAs和球化腈水合酶的熱穩(wěn)定性Fig.5 The thermalstabilitiesof CLEAs and spherezymes

從圖5中可以看出，隨著溫度的增加和孵化時間的延長，溫度對酶活性的影響逐漸增加．CLEAs在30℃、40℃下反應(yīng)基本穩(wěn)定，在6h孵化以后煙酰胺產(chǎn)率分別為96.24%和89.23%．球化酶在30℃條件下能比較穩(wěn)定的反應(yīng)，6 h孵化以后能保持99.06%的煙酰胺產(chǎn)率．在50℃條件下孵化6 h，2種固定化酶失去了大部分活性，煙酰胺產(chǎn)率分別只有8.42%和5.36%．穩(wěn)定性測試的結(jié)果進一步表明CLEAs的熱穩(wěn)定性略優(yōu)于球化酶，但CLEAs在50℃條件下也不能長時間穩(wěn)定的存活．為了使固定化酶在長時間的實驗過程中能夠更好的發(fā)揮催化作用，選取30℃為反應(yīng)條件．

2.6 游離酶、CLEAs和球化酶催化不同濃度3-腈基吡啶的進程曲線

腈水合酶的底物為腈類物質(zhì)，是一類有毒物質(zhì)，在催化過程中底物會對酶分子產(chǎn)生毒害作用，高濃度底物會使酶活性降低甚至失活．按照1.3.10節(jié)方法，在酶活相同的狀態(tài)下，研究3種酶催化不同濃度的3-腈基吡啶對煙酰胺產(chǎn)率的影響，考察了游離酶、CLEAs及球化酶對底物3-腈基吡啶的耐受性，其結(jié)果如圖6所示．

從圖6中可以看出，在底物終濃度為50mmol/L時，反應(yīng)10h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產(chǎn)率分別為98.35%、97.80%和98.21%，在底物終濃度為100mmol/L時，反應(yīng)10h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產(chǎn)率分別為79.24%、91.29%和89.23%，在底物終濃度為200mmol/L時，反應(yīng)10 h后，游離酶、CLEAs及球化酶催化的煙酰胺產(chǎn)率分別為31.01%、64.26%和59.23%．對比數(shù)據(jù)可以得出，隨底物濃度的增加，3種酶催化產(chǎn)物的產(chǎn)率都在逐漸降低，在經(jīng)過固定化后，固定化酶對高濃度的底物耐受性較游離酶有所提高，且CLEAs略優(yōu)于球化酶．

圖6 高濃度底物對煙酰胺產(chǎn)率的影響Fig.6 Theeffectofhigh concentrationsof substrate on theyield of nicotinamide

2.7 CLEAs和球化酶的重復(fù)使用性

經(jīng)過固定化以后，能夠重復(fù)使用是固定化酶相比游離酶的一個極大的優(yōu)勢，重復(fù)使用能夠降低使用成本．按照1.3.11節(jié)方法，研究了不同CLEAs和球化酶的重復(fù)使用性，其結(jié)果如圖7所示．

由圖7a）可以看出，在底物終濃度50 mmol/L的條件下，經(jīng)過10次重復(fù)使用以后，CLEAs和球化酶催化的煙酰胺產(chǎn)率分別為73.45%，61.26%，表現(xiàn)出了較好的重復(fù)使用性．但是隨著底物濃度的增加，底物對酶的累積影響越來越明顯，重復(fù)使用效率會隨著底物濃度的增大明顯降低．由圖7b）可以看出，在底物終濃度100mmol/L的條件下，CLEAs和球化酶的催化產(chǎn)率在重復(fù)7次的時候產(chǎn)率分別為35.91%和27.32%，低于了初次的50%．如圖7c）所示，在底物終濃度200mmol/L的條件下，CLEAs和球化酶的催化產(chǎn)率在重復(fù)5次的時候產(chǎn)率就低于了初次的50%，對應(yīng)產(chǎn)率分別為22.44%，14.82%．除了底物對酶的影響造成酶活損失以外，每次洗滌過程中還會對固定化酶造成一定程度的損失，操作過程中因盡量小心，減少過程中酶的損失．

圖7 CLEAs和球化酶的重復(fù)使用性Fig.7 Reusability of CLEAs and spherezymes

3 結(jié)論

為了提高酶活回收率，本文以葡聚糖醛為交聯(lián)劑，采用了交聯(lián)酶聚集體和球化酶2種方法固定化腈水合酶，對固定化酶的形貌進行了電鏡表征，并對固定化酶性能進行了研究，得到以下結(jié)論：

1）葡聚糖醛交聯(lián)的CLEAs是含有多孔的無規(guī)則結(jié)構(gòu)，多孔的存在有利于反應(yīng)底物及產(chǎn)物的自由進出，極大程度的降低擴散限制從而提高酶活性．球化腈水合酶為粒徑主要分布在8～20m的球狀結(jié)構(gòu)，在應(yīng)用過程中體現(xiàn)了比CLEAs更好的重懸性．

2）經(jīng)過固定化以后，同游離酶相比，固定化酶有著更好的pH、熱穩(wěn)定性，對高濃度底物的耐受性更強，在底物終濃度50 mmol/L的條件下，經(jīng)過10次重復(fù)使用，CLEAs和球化酶表現(xiàn)了良好的重復(fù)使用性．這些性能使固定化酶在應(yīng)用中更有優(yōu)勢．

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[責(zé)任編輯 田豐]

Theapplication of nitrilehydratase cross-linked enzymeaggregates in thegenerated system of nicotinam ide

JIANG Yanjun，MU Haixia，ZHOU Liya，GAO Jing

(Schoolof Chemical Engineering,HebeiUniversity of Technology,Tianjin 300130,China)

Cross-linked enzymeaggregates(CLEAs)and spherezymesofnitrilehydratase(NHase)ES-NHT-118 from E.coliwere prepared.Dextran polyaldehyde,amacromolecular cross-linker,wasemployed to cross-link NHase for the first time.A fter having optim ized the tem perature,pH,concentration of the cross-linker and the cross-linking time in the process of preparation,NHase CLEAs and spherezymes have obtained 49.63%，52.88%of activity recovery,respectively.Themorphology of CLEAsand spherezymeswereanalyzed by using scanning electronm icroscopy(SEM). The immobilized enzymesw ere em p loyed to catalyze 3-cyanopyridine converted to nicotinam ide.The NHase CLEAs and spherezymes exhibited increased stability at varied pH and temperature conditions w hen compared with its free counterpart.Whenexposed tohigh concentrationsofacrylamide,immobilized enzymesalsoexhibitedeffectivecatalytic activity.Whenhaving reached theeffectof50mmol/L 3-cyanopyridine,4U/m LNHase CLEAsand spherezymeskept respectively 74.37%，63.95%of theiroriginalactivity afterbeing recycled ten times.

nitrilehydratase;immobilized enzyme;cross-linked enzymeaggregates（CLEAs）;extran polyaldehyde; spherezymes

Q814.2

A

1007-2373(2015)02-0068-07

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.02.015

2015-01-23

國家自然科學(xué)基金（21276062）；河北省高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究重點項目（YQ2013025）；天津市自然科學(xué)基金（13JCYBJC18500）；天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金計劃項目（20140513）

姜艷軍（1980-），男（漢族），副教授，博士，yanjunjiang@hebut.edu.cn．

數(shù)字出版日期：2015-04-14數(shù)字出版網(wǎng)址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20150414.0915.001.htm l