麻角定喘消痰湯對小兒哮喘發(fā)作外周血中Toll樣受體表達(dá)的影響

佟雪飛,郭海軍

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院 中醫(yī)科，河北 邢臺(tái) 054000)

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麻角定喘消痰湯對小兒哮喘發(fā)作外周血中Toll樣受體表達(dá)的影響

佟雪飛,郭海軍

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院 中醫(yī)科，河北 邢臺(tái) 054000)

目的 探討麻角定喘消痰湯對哮喘發(fā)作患兒外周血中Toll樣受體1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4表達(dá)的影響及可能機(jī)制。方法 選擇2012年1月～2014年6月期間80例哮喘發(fā)作患兒為研究對象。將80例哮喘患兒按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為觀察組和對照組各40例。觀察組：40例，給予麻角定喘消痰湯治療；對照組：40例，給予常規(guī)治療。檢測受試者治療前和治療后TLR1、TLR2、TLR4、IL-6、TNF-α的表達(dá)情況。結(jié)果 與治療前比較，治療后觀察組和對照組中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞中TLR1、TLR2的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達(dá)無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前和治療后，對照組患兒外周血中IL-6、TNF-α的表達(dá)無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 麻角定喘消痰湯可提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，抑制患兒氣道炎性反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性，最終控制哮喘的發(fā)作及進(jìn)展。

支氣管哮喘；急性發(fā)作；麻角定喘消痰湯；Toll樣受體；機(jī)制

支氣管哮喘(簡稱哮喘)是兒呼吸科常見的呼吸系統(tǒng)疾病[1]，多種細(xì)胞因子和炎性因子在哮喘發(fā)病過程中起介導(dǎo)作用[2]。外周血中中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞在受到外界刺激后，可通過分泌細(xì)胞因子，引起Th1/Th2免疫應(yīng)答失衡，使機(jī)體免疫反應(yīng)方向偏向Th2，進(jìn)而導(dǎo)致哮喘的發(fā)病及哮喘病情的加重[3]。Toll樣受體1(Toll-like receptors，TLR1)、TLR2、TLR4是TLRs中的重要成員，可由上述外周血細(xì)胞產(chǎn)生[4]。研究[5-7]顯示，哮喘患者外周血中TLRs存在異常表達(dá)，而TLRs的異常表達(dá)參與了哮喘的發(fā)病。本研究采用麻角定喘消痰湯治療哮喘發(fā)作患兒，并重點(diǎn)檢測了治療前、治療后哮喘發(fā)作患兒外周血中中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)情況，旨在探討麻角定喘消痰湯對哮喘發(fā)作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4表達(dá)的影響及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月～2014年6月期間被本院收治的80例哮喘發(fā)作患兒為研究對象，患兒年齡在3～15歲，上述患兒均符合哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。將80例哮喘患兒按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為觀察組和對照組各40例。觀察組：40例，平均年齡(6.2±4.1)歲，男22例，女18例，平均病程(24.7±3.5)個(gè)月。對照組：40例，平均年齡(4.8±2.7)歲，男24例，女16例，平均病程(24.2±3.1)個(gè)月。觀察組和對照組在年齡、性別、病程方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究均獲患兒監(jiān)護(hù)人知情并簽署知情同意書，同時(shí)獲本院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2 納入排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)[1]：年齡3～15歲；哮喘急性發(fā)作患兒，符合《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；支氣管舒張劑治療有效。排除標(biāo)準(zhǔn)[1]：近1個(gè)月內(nèi)呼吸道感染者；免疫系統(tǒng)疾病者；血液系統(tǒng)疾病者；嚴(yán)重肝腎疾病者；嚴(yán)重心腦血管疾病者；結(jié)核感染者；排除哮喘外的呼吸系統(tǒng)其他疾病。

1.3 治療方法

1.3.1 對照組：適量運(yùn)動(dòng)，注意休息，避免過度勞累，保持良好情緒，避免接觸過敏原，防寒保暖，避免微生物感染，觀察28 d。

1.3.2 觀察組：麻角定喘消痰湯組方：蘇子(10 g)，地龍(10 g)，前胡(10 g)，麻黃(5 g)，丹參(10 g)，浙貝母(10 g)，百部(10 g)，白前(10 g)，大皂角(10 g)，苦杏仁(5 g)，桑白皮(10 g)，枇杷葉(10 g)。袋/劑，1劑/1～2日，溫開水沖服，1天3次，4天/療程。

1.4 TLR1、TLR2、TLR4表達(dá)的檢測 入院時(shí)取受試者靜脈血3 mL，肝素抗凝，使用流式細(xì)胞儀全血雙色免疫熒光直標(biāo)法檢測，每例受試者取抗凝全血300 μL，分裝3管，每管均加10 mg/L抗異硫氰酸熒光素單抗。2管實(shí)驗(yàn)管分別加抗10 mg/L TLR1-PE、TLR2-PE、TLR4-PE，1管對照管加10 mg/L同型對照IgG2a，避光孵育30 min，抗體購自上海華大基因科技公司，采用CyTOF質(zhì)譜流式細(xì)胞儀(上海華大基因科技公司)獲取中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，數(shù)據(jù)分析使用FCS Express 5軟件。采用同型對照校正非特異染色檢測TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)情況，以細(xì)胞的TLR相對平均熒光強(qiáng)度表示，TLR相對平均熒光強(qiáng)度=TLR平均熒光強(qiáng)度/同型對照平均熒光強(qiáng)度。

1.5 IL-6、TNF-α的檢測 于清晨空腹?fàn)顟B(tài)下抽取受試者外周靜脈血3 mL，3500 r/min離心10 min，上清液-80 ℃保存待測。采用雙抗體夾心ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α等指標(biāo)，試劑盒購自于上海華大基因，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 觀察組和對照組外周血中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá) 治療前觀察組和對照組中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達(dá)無顯著差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 觀察組和對照組外周血中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)情況Tab.1 Expression of peripheral blood neutrophils TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.2 觀察組和對照組外周血肥大細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá) 治療前觀察組和對照組肥大細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組肥大細(xì)胞TLR1、TLR2的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 觀察組和對照組外周血肥大細(xì)胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)情況Tab.2 Expression of peripheral blood mast cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.3 觀察組和對照組外周血巨噬細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá) 治療前觀察組和對照組中性粒細(xì)胞TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前比較，治療后觀察組和對照組巨噬細(xì)胞TLR1、TLR2的表達(dá)增強(qiáng)(P<0.05)，觀察組TLR1、TLR2的表達(dá)強(qiáng)度高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；治療前和治療后對照組TLR4的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組TLR4的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

表3 觀察組和對照組外周血巨噬細(xì)胞中TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)情況Tab.3 The expression of peripheral blood macrophages cells TLR1, TLR2 and TLR4 in observation group and control group ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.4 觀察組和對照組治療前、治療后外周血中IL-6、TNF-α的表達(dá) 治療前和治療后，對照組患兒外周血中IL-6、TNF-α的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與治療前及同期對照組比較，治療后觀察組IL-6、TNF-α的表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 觀察組和對照組治療前、治療后外周血中IL-6、TNF-α水平比較±s)Tab.4 The levels of peripheral blood IL-6, TNF-α in observation group and control group before and after ±s)

*P<0.05，與治療前相比，compared with before treatment；#P<0.05，與同期對照組相比，compared with control group

2.5 不良反應(yīng) 治療后，2組患兒隨訪期間均未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。

3 討論

本研究采用麻角定喘消痰湯治療哮喘急性發(fā)作患兒，并重點(diǎn)探討了麻角定喘消痰湯對哮喘發(fā)作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4表達(dá)的影響及可能機(jī)制。本研究檢測結(jié)果顯示，哮喘發(fā)作患兒在接受麻角定喘消痰湯治療后，外周血中中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中TLR1、TLR2、TLR4等TLRs成員的表達(dá)均出現(xiàn)顯著變化，TLR1、TLR2的水平出現(xiàn)顯著上升，TLR4的表達(dá)則出現(xiàn)明顯下調(diào)；而對照組治療后TLR1、TLR2的表達(dá)雖較治療前上調(diào)，但幅度小于麻角定喘消痰湯組，且對照組治療前和治療后TLR4的表達(dá)并無顯著變化。另一方面，隨訪期間我們發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒接受麻角定喘消痰湯治療后未出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)。表明麻角定喘消痰湯對哮喘發(fā)作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)有顯著影響，且安全性高。其可促進(jìn)TLR1、TLR2的分泌，抑制TLR4的表達(dá)，進(jìn)而轉(zhuǎn)變Th1/Th2免疫應(yīng)答的方向，使機(jī)體免疫反應(yīng)方向偏向Th1，繼而提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)功能，抑制哮喘急性發(fā)作患兒氣道炎性反應(yīng)，降低機(jī)體氣道高反應(yīng)性，有效控制哮喘患兒哮喘的發(fā)作及進(jìn)展。

Kumar等[8]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘急性發(fā)作患者外周血中TLR4的表達(dá)顯著高于哮喘緩解期患兒及健康兒童，且TLR4可通過調(diào)節(jié)IL-6、TNF-α等促炎因子的表達(dá)參與哮喘的發(fā)作。表明外周血中的TLR4的異常表達(dá)與哮喘的病情進(jìn)展密切相關(guān)[9-10]，但國內(nèi)的相關(guān)研究較少。本研究在麻角定喘消痰湯治療前和治療后分別檢測了哮喘發(fā)作患兒外周血中IL-6、TNF-α等指標(biāo)的表達(dá)情況，檢測結(jié)果顯示，哮喘急性發(fā)作患兒外周血中IL-6、TNF-α等指標(biāo)的檢測含量較治療前明顯下降，而對照組患兒治療前和治療后IL-6、TNF-α的表達(dá)并無顯著變化，這與Satumino等[11]的研究結(jié)果接近。Satumino等在研究中采用TLR4阻斷劑抑制TLR4的表達(dá)，并檢測TLR4阻斷前和阻斷后外周血單核巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α等指標(biāo)的表達(dá)，檢測結(jié)果顯示，在給予TLR4阻斷劑后外周血單核巨噬細(xì)胞中IL-6、TNF-α等指標(biāo)表達(dá)明顯較給予阻斷劑之前下調(diào)，而給予TLR2阻斷劑前后IL-6、TNF-α等指標(biāo)的表達(dá)并無顯著改變。表明TLR4可能是通過調(diào)控IL-6、TNF-α的表達(dá)進(jìn)而參與哮喘發(fā)作的。TLR4可增強(qiáng)IL-6、TNF-α等指標(biāo)的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作，而TLR2可能并不直接調(diào)控IL-6、TNF-α的表達(dá)。TLR4調(diào)控IL-6、TNF-α等促炎因子表達(dá)的可能機(jī)制有：TLR4是脂多糖的受體，機(jī)體體內(nèi)TLR4與脂多糖結(jié)合時(shí)，可招募TNF受體相關(guān)因子及系列接頭蛋白，隨后在磷酸化的作用下，誘導(dǎo)部分轉(zhuǎn)錄因子入胞，進(jìn)而促進(jìn)IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，導(dǎo)致哮喘急性發(fā)作[12-15]。本研究結(jié)果表明，麻角定喘消痰湯治療哮喘急性發(fā)作的另一個(gè)可能機(jī)制是，通過下調(diào)TLR4的表達(dá)，抑制IL-6、TNF-α等重要促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而減輕哮喘發(fā)作患兒氣道的炎癥水平，抑制患兒氣道高反應(yīng)性，最終控制哮喘的急性發(fā)作[16]。

本研究不足之處是入組對象較少、規(guī)模較小，另一方面未進(jìn)一步探討TLR1、TLR2等指標(biāo)的可能作用機(jī)制，因此后期仍然需要更大規(guī)模的研究進(jìn)一步驗(yàn)證。本研究顯示，麻角定喘消痰湯對哮喘發(fā)作患兒外周血中TLR1、TLR2、TLR4的表達(dá)有顯著影響，其可促進(jìn)TLR1、TLR2的表達(dá)，抑制TLR4、IL-6及TNF-α的表達(dá)，提高機(jī)體免疫調(diào)節(jié)能力，抑制患兒氣道炎性反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性，最終控制哮喘的發(fā)作及進(jìn)展。但相關(guān)機(jī)制仍然需要進(jìn)一步深入研究。

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(編校：譚玲)

Influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on Toll-like receptors expression in peripheral blood of pediatric asthma

TONG Xue-fei,GUO Hai-jun

(Department of Traditional Chinese Medicine, Xingtai People’s Hospital, Xingtai 054000, China)

ObjectiveTo study influence of Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction on TLR1, TLR2, TLR4 expression changes in peripheral blood of pediatric asthma and its possible mechanism.MethodsFrom January 2012 to June 2014, 80 cases of children with asthma were selected as the research object.80 cases of children with asthma according to random number table method were randomly divided into observation group and control group(n=40).Observation group: 40 cases were given Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; control group: 40 cases were given routine therapy.Expression of TLR1, TLR2 and TLR4, IL-16, TNF-α before and after treatment were tested.ResultsExpression of TLR1, TLR2 enhanced after treatment in neutrophils, mast cells, macrophages, compared with before treatmen(P<0.05).Expression of TLR1, TLR2 were higher than those of control group, and the difference was statistically significant (P< 0.05).Expression of TLR4 in control group before and after treatment had no significant difference.Expression of TLR4 was significantly lower after treatment, compared with before treatment and at the same time in control group, and the difference was statistically significant (P<0.05).Expression of IL-6, TNF-α in control group in peripheral blood in children before and after treatment had no significant difference, but expression of IL-6, TNF-α in observation group were significantly lowered after treatment, compared with before treatment and the same period in control group, and the difference was statistically significant (P<0.01). ConclusionMa Kok Dingchuan Phlegm Decoction could improve immune adjustment ability, inhibit airway inflammatory reaction and improve reactivity of children, and ultimately control the onset and progress of asthma.

bronchial asthma; acute attack; Ma Kok Dingchuan Phlegm Decoction; Toll-like receptors; mechanism

佟雪飛，女，本科，主治醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)，E-mail：conglitong@163.com。

R259

A

1005-1678(2015)02-0130-04