DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷的抗胃腸道腫瘤機制研究

李偉,施明亮,畢京鵬,周春林,陸楠

(1.萊蕪市人民醫(yī)院 普外科，山東 萊蕪 271199；2.萊蕪市人民醫(yī)院 腫瘤科，山東 萊蕪 271199；3.北京協(xié)和醫(yī)學院 臨床內(nèi)科，北京 100000；4.山東大學 臨床醫(yī)學系，山東 濟南 250100)

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DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷的抗胃腸道腫瘤機制研究

李偉1,施明亮2,畢京鵬1,周春林3,陸楠4

(1.萊蕪市人民醫(yī)院 普外科，山東 萊蕪 271199；2.萊蕪市人民醫(yī)院 腫瘤科，山東 萊蕪 271199；3.北京協(xié)和醫(yī)學院 臨床內(nèi)科，北京 100000；4.山東大學 臨床醫(yī)學系，山東 濟南 250100)

目的 觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)對胃癌細胞生長的影響。方法 將野生型P53人胃癌細胞株AGS細胞，加入不同濃度的5-Aza-CdR，體外培養(yǎng)至不同時間。MTT法檢測細胞增殖活性；平板細胞克隆形成實驗檢測細胞長期增殖活性(0～2.5 μM)；流式細胞儀檢測細胞周期變化(25 μM,0、12、48、96 h)；Annexin V/PI雙染實驗檢測細胞凋亡情況(2.5 μM，0、12、48、96 h)；比色法檢測Caspase-3活力、Western blot檢測Caspase-3前體蛋白及PARP(poly ADP-ribose polymerase，PARP)蛋白的含量(2.5 μM，0、12、48、96 h)。結(jié)果 隨著5-Aza-CdR濃度增加，對腫瘤細胞的抑制作用亦增強，在50 μM作用72 h時，細胞存活率達最低值(31.9%)；隨著藥物處理時間的延長，胃癌AGS細胞凋亡增多，96 h的2.5 μM 5-Aza-CdR作用下，細胞的生長抑制達到了最高峰(44.4%)，且其抑制作用表現(xiàn)為濃度和時間依賴性。5-Aza-CdR對腫瘤細胞長期生長有影響，克隆形成抑制率呈線性增加。流式細胞儀分析結(jié)果顯示，隨5-Aza-CdR作用時間延長，G2期細胞比例從0 h的(5.7±0.2)%增加到96h的(28.5±0.2)%。隨著藥物作用時間的累加，其凋亡率逐漸增加，各時間組的細胞凋亡率與空白對照組之間的差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與空白對照組比較，Caspase-3活力在藥物處理48、96 h后顯著提高(P<0.05)，但12 h AGS細胞的Caspase-3活力無變化；48 h Caspase-3前體比12 h和未用5-Aza-CdR時明顯減少，96 h減少最為明顯；PARP在AGS細胞內(nèi)經(jīng)5-Aza-CdR作用48 h后亦被活化，96 h后幾乎檢測不到PARP的存在。結(jié)論 5-氮雜-2′-脫氧胞苷，能增強腫瘤細胞對化療藥的敏感性，可作為一種有效的抗胃腸道腫瘤藥，。

5-氮雜-2′-脫氧胞苷；凋亡；Caspase-3；p53；DNA甲基轉(zhuǎn)移酶

在腫瘤形成過程中多種調(diào)節(jié)細胞凋亡的基因表達被抑制[1-3]。5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-CdR)通過不同的信號通路誘導細胞分化和凋亡[4]。有學者[5-6]已經(jīng)證明5-Aza-CdR可有效抑制細胞生長，其對凋亡的誘導獨立于caspase通路。但詳細的作用機制，特別是5-Aza-CdR在胃腸道腫瘤中對DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和沉默基因的影響至今仍未完全明了[7-8]。本實驗選取野生型p53的胃癌細胞株AGS，檢測其在不同時間和劑量的5-Aza-CdR作用下，胃癌AGS 細胞的生長活性以及各細胞周期的變化。

1 材料與方法

1.1 材料 胃癌細胞株AGS(購于中國科學院細胞庫)；DMSO、5-氮雜-2′-脫氧胞苷酸(購于上海贏瑞化學科技有限公司)；DNA Marker DL-2000(Takara公司，日本)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；青霉素、鏈霉素、溴化乙啶、溴酚藍(美國Sigma公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)、臺盼藍、結(jié)晶紫、ECL 液、顯影定影液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；脫脂奶粉(購于北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)；硝酸纖維素膜(美國Millipore公司)，小牛血清(Gibco公司)；胰蛋白酶(Sigma公司)；蛋白分子量標準(Fermentas)；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V(上海前塵生物科技有限公司)；ECL試劑盒、抗Caspase-3、抗PARP、actin特異抗體、PI抗體、MTT檢測試劑盒、二抗(Santa cruz，美國)；Caspases活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

流式細胞儀(美國BD公司)；752紫外分光光度計(北京精密科學儀器有限公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo forma公司)；96孔培養(yǎng)板(上海生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人胃癌細胞株AGS培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 kU/L青霉素、100 kU/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，培養(yǎng)條件為37 ℃，飽和濕度，5%CO2。

1.2.2 分組及處理：將處于對數(shù)生長期的人胃癌細胞株AGS細胞以適宜密度接種(4～5)×105個/mL，加入不同濃度(0、0.01、0.1、0.5、1、2.5、5、10、25、50 μM)的5-Aza-CdR的DMEM培養(yǎng)基至不同時間(12、24、48、72、96 h)。5-Aza-CdR不穩(wěn)定，儲存液放在-80 ℃儲存，每24 h更換新鮮藥液。

1.2.3 檢測方法：①MTT：法檢測細胞增殖活性：將1.2.2中不同濃度(0～50μM)5-Aza-CdR培養(yǎng)72 h的細胞，加入5%MTT 20 μL，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。然后丟棄培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO于室溫下振蕩15 min，然后對結(jié)晶物進行物理溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處檢測每個孔的吸光度值(A值)。②使用平板細胞克隆形成實驗檢測細胞長期增殖活性：將1.2.2中細胞0～2.5 μM 5-Az培養(yǎng)結(jié)束后用胰酶消化細胞，用PBS洗。在6孔板中以30～70個細胞的密度種下，每組設3個復孔，細胞在培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)14 d取出，將培養(yǎng)液舍棄之后用pH 7.4的PBS輕度漂洗細胞3次。酒精固定后用姬姆薩染色液染色約30～40 min。水洗培養(yǎng)板后進行細胞計數(shù)，平均以50個細胞以上為1個克隆，按下述公式進行計算：克隆形成抑制率=(空白對照組的克隆形成率-實驗組的克隆形成率)/對照組克隆形成率×100%。③流式細胞儀檢測細胞周期：(4～5)×105個細胞接種于6孔板于37 ℃培養(yǎng)。待其有70%～80%匯合時用2.5 μM 5-Aza-CdR處理0～96 h；胰酶消化后，800 r/min離心5 min收集藥物處理的細胞；4 ℃預冷的PBS洗2次。-20 ℃預冷的80%乙醇懸浮、固定細胞4 h以上或-20 ℃過夜；800 r/min×5 min，4 ℃預冷的PBS洗2次。用1 mL PI溶液(0.1% trixton-100，50 μg PI和200 μg RNase A)重懸細胞，并于37 ℃孵育15～20 min。在1 h內(nèi)以流式細胞儀進行細胞周期及凋亡率的測定。實驗重復3次。④Annexin V/PI 雙染實驗檢測細胞凋亡情況：收集經(jīng)過2.5 μM藥物分別處理的胃癌AGS細胞培養(yǎng)0、12、48、96 h，用冷的PBS洗滌2次后，取5×106個細胞，1500 r/min離心5 min，棄上清，用400 μL 1×Binding Buffer重懸細胞；分成a、b、c、d 4管，每管1×106個細胞。此4管作為對照，a管不加入任何試劑，作為陰性對照管，b管加入Annexin V/PI作為陽性對照，c管只加入10 μL的PI液并避光孵育15 min，d管只加入5 μL的Annexin V并避光孵育15 min；在樣本管和對照管中各加入400 μL 1×Binding Buffer，上機檢測。⑤比色法檢測Caspase-3活力、Western blot檢測Caspase-3前體蛋白及PARP蛋白的含量：AGS細胞用2.5 μM 5-Aza-CdR分別處理0、12、48、96 h，比色法檢測Caspase-3活力在處理前后的變化：取96孔酶標板，每個樣本均設立測定孔和空白孔。步驟如下：向各孔中加入50 μL 2×Reaction buffer,然后加入細胞裂解液上清各50 μL震蕩混勻,向各測定孔中加入底物工作液5 μL,各空白孔加入1×Reaction buffer 5 μL震蕩混勻；置37 ℃避光水浴1.5 h，水浴結(jié)束以后于酶標儀檢測光密度值。

Western blot測定不同時間5-Aza-CdR對Caspase-3前體蛋白及PARP蛋白含量影響：將30～60 μg樣品于SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，當溴酚藍(示蹤染料)到達距分離膠底部0.5 cm時，關閉電源，4 ℃條件下轉(zhuǎn)印過夜。轉(zhuǎn)印完成后，將硝酸纖維素膜用封閉液封閉，室溫輕搖1 h。一抗反應：加入用封閉液稀釋的一抗10 mL(抗Caspase-3、抗PARP、actin特異抗體，1:1000稀釋)，4 ℃輕搖過夜。漂洗濾膜3次，每次10 min。二抗反應：將膜用封閉液稀釋的辣根過氧化物酶標記的相應抗體(稀釋濃度為1:2000)，室溫輕搖1 h。漂洗濾膜3次。ECL法顯色：將等體積ECL試劑A液、B液，混合均勻加到轉(zhuǎn)印膜上，反應5 min。暗室曝光，曝光1～2 min，顯影、定影，自來水充分沖洗。

2 結(jié)果

2.1 5-Aza-CdR抑制胃癌細胞的生長增殖 本次實驗選取了野生型人胃癌細胞株AGS，用不同濃度(0～50 μM)的5-Aza-CdR處理72 h，用MTT檢測它對細胞生長活性的影響。圖1A顯示，未用5-Aza-CdR處理時，AGS細胞存活率為94.6%。當5-Aza-CdR的濃度從0.01 μM增加到0.1 μM時，細胞存活率從90.7%下降到82.1%，與空白對照組的AGS細胞相比差異具有顯著性(P<0.05)。隨著5-Aza-CdR濃度的不斷增加，它對腫瘤細胞的抑制作用亦愈強。在50 μM時，細胞存活率達到了最低值(31.9%)。

本次實驗選取2.5 μM 5-Aza-CdR處理AGS細胞12、24、48、72、96 h，如圖1B顯示，在AGS細胞中，2.5 μM 5-Aza-CdR處理12 h后，細胞存活率為92.8%，此與未加5-Aza-CdR處理的空白對照組細胞相比無顯著性差別。在24 h后，細胞存活率從92.8%下降到85.7%，與對照組相比顯著降低(P<0.05)。同時，隨著藥物處理時間的不斷延長，愈來愈多的胃癌AGS細胞凋亡，本研究觀察到在96 h的2.5 μM 5-Aza-CdR作用下，細胞的生長抑制達到了最高峰(44.4%)。以上實驗結(jié)果表明，5-Aza-CdR可有效抑制胃癌AGS細胞的生長，并且其抑制作用表現(xiàn)為濃度和時間依賴性。

為了進一步探討5-Aza-CdR對細胞生長增殖的作用，本實驗用較為敏感的克隆形成實驗去判定5-Aza-CdR是否對腫瘤細胞長期生長具有影響。基于MTT實驗的數(shù)據(jù)，本研究分別選取0.01、0.1、1、2.5 μM處理的AGS細胞。與未加入5-Aza-CdR的對照組細胞相比，5-Aza-CdR導致胃癌AGS細胞克隆集落顯著減少(圖1C)。0.01和0.1 μM 5-Aza-CdR分別使細胞的克隆形成抑制率為29.6%以及44.6%，其克隆形成抑制率呈線性增加，在2.5 μM達到了最高峰(76.9%)。

圖1 5-Aza-CdR對胃癌AGS細胞的生長活性的影響Fig.1 The effects of 5-Aza-CdR on growth of gastric cancer AGS cells

2.2 5-Aza-CdR對細胞周期的阻滯 為了驗證5-Aza-CdR抑制腫瘤細胞生長的作用機制是通過細胞周期的阻滯實現(xiàn)的，本實驗用流式細胞儀分析5-Aza-CdR對胃癌細胞各期細胞比例的影響。AGS細胞用2.5 μM 5-Aza-CdR分別處理0、12、48、96 h。流式細胞儀分析的結(jié)果顯示，在胃癌AGS細胞，隨著作用時間的延長，G2期細胞比例從未加5-Aza-CdR處理時的(5.7±0.2)%增加到(28.5±0.2)%。而5-Aza-CdR對G1及S期并沒有明顯影響(見表1)。

表1 5-Aza-CdR對胃癌AGS細胞各期細胞比例的影響Tab.1 5-Aza-CdR effects on AGS gastric cancer cell ±s，%)

2.3 5-Aza-CdR誘導胃癌細胞發(fā)生凋亡 AGS細胞用2.5 μM 5-Aza-CdR分別處理0、12、48、96 h后，Annexin V試劑盒驗證不同時間作用前后細胞凋亡的變化。如圖2示，在野生型P53的AGS細胞中，未用5-Aza-CdR處理的空白對照組細胞的早期凋亡的陽性率為2.4%，12 h 5-Aza-CdR作用之后其陽性率增加到(11.4±1.9)%。此外，隨著5-Aza-CdR作用時間的不停累加，其凋亡率從48 h的(41.0±2.5)%增加到96 h的(63.4±3.1)%。各時間組的細胞凋亡率與空白對照組之間的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。這一結(jié)果與MTT結(jié)果類似，均表現(xiàn)為明顯的時間依賴關系(見圖2)。

圖2 5-Aza-CdR對胃癌AGS細胞凋亡的影響Fig.2 5-Aza-CdR effects on AGS gastric cancer cell apoptosis

2.4 5-Aza-CdR對Caspase-3凋亡通路的影響 AGS細胞用2.5 μM 5-Aza-CdR分別處理0、12、48、96 h，比色法檢測Caspase-3活力在處理前后的變化。AGS細胞顯示，與空白對照組比較，Caspase-3的活性在48、96h 5-Aza-CdR作用后顯著提高(P<0.05)，但12hAGS細胞的Caspase-3無變化(見圖3A)。

Western blot測定不同時間5-Aza-CdR對Caspase-3蛋白表達的影響：如圖3B所示，48 h的5-Aza-CdR作用后，AGS檢測到了Caspase-3前體比12 h和未用5-Aza-CdR時明顯減少，96 h后最為顯著。而PARP(poly ADP-ribose polymerase，PARP)，一種caspase激活后裂解的相應胞核內(nèi)底物多聚酶，在AGS細胞內(nèi)經(jīng)過5-Aza-CdR作用48 h后亦被活化，本研究在96 h后幾乎檢測不到PARP的存在。

圖3 5-Aza-CdR處理前后對AGS細胞Caspase-3及PARP的影響*P<0.05，與對照組相比Fig.3 5-Aza-CdR Caspase-3 on the AGS cells before and after processing and the effects of PARP*P<0.05，compared with control group

3 討論

如何在不影響內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的前提下抑制細胞惡性增生進而保證細胞周期的正常進行是腫瘤治療的手段之一[9-11]。截至目前，研究者們已發(fā)現(xiàn)的細胞周期包括G0、G1、S、G2、M期，其中2個決定性轉(zhuǎn)變關卡：一是G1/S期轉(zhuǎn)變，DNA合成開始；二是G2/M期轉(zhuǎn)變，有絲分裂開始；其中最重要的是G1/S期。一個完整的細胞周期，主要是由細胞周期素(cyclins)、細胞周期素依賴蛋白激酶(cyclins dependent kinases，CDKs)和細胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑(cyclins dependent kinase inhibitors，CKIs)進行控制[12-14]。在進一步探索5-Aza-CdR對胃癌AGS細胞生長抑制作用機制時，本實驗發(fā)現(xiàn)5-Aza-CdR導致腫瘤細胞發(fā)生細胞生長周期G2期的阻滯。從上述的實驗結(jié)果可以推斷，5-Aza-CdR可能通過干擾一系列細胞周期相關的蛋白酶而使損傷的DNA不能及時修復，從而誘導腫瘤細胞生長增殖的抑制。

研究結(jié)果表明，隨著5-Aza-CdR作用時間的延長，5-Aza-CdR誘導胃癌AGS細胞的凋亡亦顯著地上升，呈現(xiàn)時間依賴效應。關于這一實驗現(xiàn)象，可以推斷5-Aza-CdR作為一種細胞周期阻滯劑，其作用與劑量和時間密切相關。在長時間或高濃度暴露于5-Aza-CdR時，它與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)共價結(jié)合，一方面通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白或相關激酶來使胃癌細胞周期調(diào)控點發(fā)生紊亂；另一方面，5-Aza-CdR刺激凋亡基因的表達而促發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。既往研究指出，在低劑量5-Aza-CdR作用的情況下，它的抑制腫瘤作用是通過使基因的啟動子發(fā)生脫甲基化而恢復沉默的抑癌基因的表達而實現(xiàn)的[15]。通過5-Aza-CdR的96 h的長時間刺激，胃癌AGS細胞表現(xiàn)出生長的顯著抑制。相反，在12 h的5-Aza-CdR暴露時，AGS細胞的陽性凋亡率較48、96 h明顯減少?？赡苷怯捎诙虝r間的5-Aza-CdR刺激，是以摻入細胞的DNA中與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶相結(jié)合，從而使發(fā)生高甲基化的基因脫甲基化作用為主。而凋亡的發(fā)生則需要一系列信號通路的活化，因此，只有當5-Aza-CdR作用足夠時間后，它才有效地觸發(fā)腫瘤細胞發(fā)生凋亡。有文獻證實[14]5-Aza-CdR的抗癌作用與腫瘤細胞的p53基因狀態(tài)相關，而此次研究選取的是野生型p53胃癌細胞株AGS，因此5-Aza-CdR顯著抑制AGS細胞生長這一現(xiàn)象可以推斷p53基因型可能與5-Aza-CdR的抗癌毒性密切相關。

實驗數(shù)據(jù)證實，5-Aza-CdR誘導的胃癌AGS細胞的凋亡是由caspases凋亡通路所介導的，因為本實驗檢測到效應因子Caspase-3以及PARP的活化。當用廣譜caspase抑制劑可有效地取消5-Aza-CdR對胃癌AGS細胞的促凋亡效應，這一實驗結(jié)論與既往相關研究數(shù)據(jù)相一致[6-7]，同時也證明了caspase凋亡通路與5-Aza-CdR的抗胃癌作用密切相關。

總之，上述實驗結(jié)論表明5-Aza-CdR可顯著地抑制胃癌AGS細胞的生長，使AGS細胞G2生長周期發(fā)生阻滯，進而誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡。更有意義的是，5-Aza-CdR的抗AGS細胞作用表現(xiàn)出濃度及其時間的依賴性，這一研究結(jié)論將為下一步5-Aza-CdR的抗胃癌作用機制的深入探索指明方向。

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(編校：王儼儼，譚玲)

Mechanism of DNA methyl transferase inhibitor, 5-Aza-2′-deoxycytidine against colorectal and gastric cancer

LI Wei1,SHI Ming-liang2,BI Jing-peng1,ZHOU Chun-lin3,LU Nan4

(1.Department of General Surgery, Laiwu City People’s Hospital, Laiwu 271199, China;2.Department of Oncology, Laiwu City People’s Hospital, Laiwu 271199, China; 3. Department of Clinical Medicine, Beijing Union Medical College, Beijing 100000, China; 4.Department of Clinical Medicine, Shandong University, Ji’nan 250100, China)

ObjectiveTo observe the effect of DNA methyl transferase inhibitor, 5-Aza-2′-deoxycytidine (5-Aza-CdR) on colorectal and gastric cancer. MethodsThis experiment selected wild-type P53 human gastric carcinoma cell line AGS with different concentrations and different time of 5-Aza-CdR processing, cell proliferation activity detectd by MTT(0～50 μM，72 h；2.5 μM，0～96 h), cell long-term proliferation activity detected by plate clone formation assay(0～2.5 μM), cell cycle analyzed by flow cytometry(2.5 μM，0、12、48、96 h), tumor cell apoptosis detected by Annexin V/PI(2.5 μM，0、12、48、96 h), activity of Caspase-3 detected by colorimetry(2.5 μM，0、12、48、96 h), proCaspase-3 and poly ADP-ribose polymerase (PARP) content detected by Western blot(2.5 μM，0、12、48、96 h). ResultsThe inhibition increased with increasing of 5-Aza-CdR concentration. It was lowest(31.9%) of cell viability with 50 μM treated for 72 h. The apoptosis of AGS cells increased with time increasing, the growth inhibition reached the highest peak (44.4%), and the inhibition was time and concentration dependent. The cell long-term proliferation activity had the relationship with 5-Aza-CdR treatment, and the inhibition rate of cloning efficiency increased linearly. The flow cytometric analysis showed, the cell ratio of G2 from (5.7±0.2)% of 0h to (28.5±0.2)% 96 h with the action time of 5-Aza-CdR extending. With the accumulation of the drug action time, the apoptosis rate increased at each time, with significant differences compared with blank group (P<0.05). The activity of Caspase-3 increased at 48 h, 96 h compared with control group, with significant differences (P<0.05), but there was no activity change of Caspase-3 at 12 h. The level of proCaspase-3 at 48 h was lower than that at 12 h, 0 h, and it was obviously at 96 h. After treated by 5-Aza-CdR for 48 h, PARP in AGS cells were activatied, and hardly detected the presence of PARP. ConclusionIt could be used as an effective anti colorectal and gastric cancer drug of 5-Aza-CdR, which can enhance the sensitivity of tumor cells to chemotherapy.

5-Aza-CdR; apoptosis; Caspase-3; p53; DNA methyl transferases

山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(2009HW038)

李偉，男，碩士，住院醫(yī)師，研究方向：胃腸疾病的診療，E-mail：lw13506341545@163.com。

R737.33

A

1005-1678(2015)02-0080-05