ɑ-硫辛酸對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠氧化應激水平及腦水腫的影響

龐國象，陳廣斌，麥水強Δ，王瑞華，黃梅英

(1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 新生兒科，廣東 深圳 518172；2.深圳市第三人民醫(yī)院 藥劑科臨床藥學室，廣東 深圳 518112)

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ɑ-硫辛酸對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠氧化應激水平及腦水腫的影響

龐國象1，陳廣斌2，麥水強1Δ，王瑞華1，黃梅英1

(1.深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院 新生兒科，廣東 深圳 518172；2.深圳市第三人民醫(yī)院 藥劑科臨床藥學室，廣東 深圳 518112)

目的 觀察ɑ-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)對缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠腦組織氧化應激指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)及腦水腫的影響，探討ɑ-硫辛酸對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的保護作用。方法 隨機將7日齡Wistar大鼠108只分為3組，假手術組(n=36)；缺氧缺血模型組(HIBD，n=36)；ALA治療組(n=36)；根據(jù)造模后處死時間，各組又分1、3、7 d亞組，每亞組各12只。按RICE法制備新生大鼠HIBD模型。治療組分別于造模后即開始腹腔注射ALA 100 mg/kg，每天2次，連續(xù)5d；假手術組及HIBD模型組于相應時點腹腔注射等量生理鹽水。造模后1、3、7 d斷頭處死取腦，采用干濕質量法測定腦組織含水量，采用比色法檢測腦組織勻漿SOD、MDA和GSH-PX的含量。結果 HIBD組與假手術組比較，各時間點腦組織勻漿SOD、GSH-PX降低、MDA升高，腦組織含水量升高(P<0.05)。治療組與 HIBD 組比較，各時間點腦組織勻漿GSH-PX回升，腦組織含水量回降(P<0.05)。治療組與 HIBD 組比較，造模后1 d時，SOD、MDA差異無統(tǒng)計學意義，造模后3、7 d時，SOD回升，MDA回降(P<0.05)。結論 ɑ-硫辛酸對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有保護作用，可減輕缺氧缺血性腦損傷后腦水腫，而其機制之一可能是ɑ-硫辛酸能減輕缺氧缺血所致的腦組織氧化應激損傷。

ɑ-硫辛酸；缺氧缺血性腦損傷；新生大鼠；腦水腫；氧化應激

新生兒缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是新生兒期常見病、多發(fā)病。目前為止，對HIE尚無特效治療方法[1]。HIE的發(fā)病機制復雜，其早期病理生理改變以血腦屏障通透性增加引起的腦水腫為主。研究認為，缺血/再灌注損傷過程中引起的氧自由基連鎖反應是腦組織缺氧缺血后腦水腫和神經元損傷的核心病理機制[2-4]。ɑ-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)具備抗氧化性，是已知抗氧化劑中最強的一種，被稱為“萬能抗氧化劑”[5]。近年研究表明，ALA對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用[6-7]。關于ALA用于新生兒缺氧缺血性腦病的研究尚罕見報道，本實驗試圖探討ɑ-硫辛酸對缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)新生大鼠腦組織氧化應激指標超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-PX)及腦水腫的影響，探討其對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的神經保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組 清潔級新生7日齡Wistar大鼠108只，體質量11～16 g，雌雄不限，由廣東醫(yī)學院動物實驗中心提供。隨機分為3組，假手術組(sham，n=36)；缺氧缺血模型組(HIBD，n=36)；ALA治療組(n=36)。根據(jù)造模后處死時間，各組又分3個亞組：1、3、7 d亞組，每亞組各12只。所有動物實驗均符合《實驗動物保護和使用管理條例》。

1.2 動物實驗 按經典RICE法[8]制備新生大鼠HIBD模型。HIBD模型組及ALA治療組新生大鼠以乙醚吸入麻醉，取一帶蓋塑料盒，內置乙醚棉球，放入新生大鼠，待新生大鼠活動明顯減少至停止，即取出，取仰臥位，四肢固定于手術板，取頸正中切口，分離并以絲線永久雙線結扎左頸總動脈，整個手術過程不超過5 min，縫合切口后將術后新生鼠放回母鼠身邊休息1 h后置2 L密閉容器，控制在(36±1) ℃溫度中，以2～3 L/min的速度輸入8%的氧氣和92%的氮氣的混合氣體，持續(xù)2 h后將鼠取出放回母鼠身邊喂養(yǎng)。假手術組予分離左頸總動脈但不結扎血管及缺氧。

[6]，治療組分別于造模后即開始腹腔注射ALA 100 mg/kg(批號：81526，STADA Arznei-mittel AG公司，德國)，每天2次，連續(xù)5 d。計算好每只新生鼠用藥量后，吸取已用無菌生理鹽水溶解配制成200 mg/mL的ALA注射液。假手術組及HIBD模型組于相對應時點腹腔注射等量生理鹽水。動物分別在造模后1、3、7 d斷頭處死取腦。隨機分2組，一組(n=6)測定全腦組織含水量，另一組(n=6)速取實驗側大腦半球，稱重后置于冰浸的生理鹽水中沖洗2次，用玻璃勻漿器制備勻漿，用生理鹽水配制成10%勻漿，4000 r/min離心5 min，取上清液貯于-4 ℃?zhèn)錅y。

1.3 檢測方法 上述樣本均在24 h內完成測定。采用干濕質量法測定腦組織含水量，于相應時間點斷頭處死大鼠，開顱取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，立即稱大腦濕重，然后置于110 ℃恒溫干燥箱內干燥24 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計算腦含水量：腦含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。SOD采用黃嘌呤氧化酶法測定，MDA用硫代巴比妥酸法測定，GSH-PX用二硫代二硝基苯甲酸法測定。S0D、MDA和GSH-PX試劑盒購自南京建成生物科技公司，實驗步驟嚴格按照說明書操作。

2 結果

2.1 腦組織大體形態(tài)學觀察 假手術組新生大鼠大腦無水腫或出血，左右大腦半球對稱。HIBD組新生大鼠結扎側大腦半球造模1 d后出現(xiàn)蒼白、水腫，體積稍大于對側，3 d時腦水腫程度持續(xù)加劇，體積明顯大于對側，腦回增寬，腦溝變淺，7 d時腦組織腫脹有所好轉。ɑ-硫辛酸治療組各時間點新生大鼠腦水腫程度較HIBD組減輕。

2.2 各組新生大鼠腦組織含水量的動態(tài)變化 HIBD組腦組織含水量在缺氧缺血后1 d開始升高，3 d達高峰，各時間點均高于假手術組，差異有統(tǒng)計學意義；治療組各時間點與HIBD組比較腦組織含水量明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義(1 d：q=4.41，P<0.01；3 d：q=4.56，P<0.01；7 d：q=2.91，P<0.05)。見表1。

組別只數(shù)腦組織含水量(g)1d3d7d假手術組663.90±1.6163.77±1.4564.32±1.78HIBD組676.51±2.35#78.61±2.16#72.50±2.76#治療組671.56±1.43#*72.68±2.35#*65.81±2.81*F值P值71.68<0.00181.95<0.00116.22<0.001

#P<0.05，與假手術組同時間點比較，compared with sham group at the same time point；*P<0.05，與HIBD組同時間點比較，compared with HIBD group at the same time point

2.3 各組新生大鼠腦組織SOD、MDA、GSH-PX測定結果 HIBD組與假手術組比較，各時間點腦組織勻漿SOD、GSH-PX降低(SOD：1 d時，q=12.47，P<0.001；3 d時，q=10.09，P<0.001；7 d時q=8.28，P<0.001。GSH-PX：1 d時，q=11.26，P<0.001；3 d時，q=9.97，P<0.001；7 d時q=9.88，P<0.001)，MDA升高(1 d時，q=11.67，P<0.001；3 d時，q=10.62，P<0.001；7 d時q=11.24，P<0.001)。治療組與 HIBD 組比較，各時間點腦組織勻漿GSH-PX回升(1 d時，q=3.70，P<0.01；3 d時，q=5.69，P<0.001；7 d時，q=6.41，P<0.001)；治療組與HIBD組比較，造模后1 d時，SOD、MDA差異無統(tǒng)計學意義(SOD：q=1.33，P=0.213；MDA：q=0.40，P=0.7008)。造模后3 d和7 d時，SOD回升，MDA回降(SOD：3 d時，q=3.09，P<0.05；7 d時，q=4.43，P<0.01。MDA：3 d時，q=2.80，P<0.05；7 d時，q=6.41，P<0.001)。見表2、表3和表4。

組別只數(shù)腦組織SOD含量(10-3U/gprot)1d3d7d假手術組626.26±1.4325.92±1.5225.83±1.95HIBD組616.25±1.35#15.88±1.90#18.04±1.23#治療組617.23±1.22#18.89±1.44#*22.71±2.27#*F值P值102.32<0.00159.71<0.00126.47<0.001

#P<0.05，與假手術組同時間點比較，compared with sham group at the same time point；*P<0.05，與HIBD組同時間點比較，compared with HIBD group at the same time point

表3 各組新生大鼠腦組織MDA測定結果±s)Tab.3 Comparison of MDA levels in newborn rats brain among each ±s)

#P<0.05，與假手術組同時間點比較，compared with sham group at the same time point；*P<0.05，與HIBD組同時間點比較，compared with HIBD group at the same time point

表4 各組新生大鼠腦組織GSH-PX測定結果±s)Tab.4 Comparison of GSH-PX levels in newborn rats brain among each ±s)

#P<0.05，與假手術組同時間點比較，compared with sham group at the same time point；*P<0.05，與HIBD組同時間點比較，compared with HIBD group at the same time point

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病是造成新生兒早期死亡及智能發(fā)育障礙、腦性癱瘓和癲癇等中樞神經系統(tǒng)后遺癥的最常見原因之一。由于目前治療上除對癥支持措施外，無特效治療藥物。因此尋找更為有效的HIE治療藥物一直是新生兒領域的研究熱點。

氧化應激損傷在新生兒HIBD病理生理過程中的作用近年越來越受到重視。SOD、GSH-PX是機體主要抗氧化酶，MDA是脂質過氧化物，它們是反映機體氧化應激狀態(tài)的重要生化指標[9-10]。本研究顯示，新生大鼠經手術缺氧缺血造模1 d后，SOD、GSH-PX降低，MDA升高，結扎側大腦半球出現(xiàn)蒼白、水腫，含水量升高，說明造模成功并符合文獻報道改變[8,11]，提示HIBD時，氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡，清除自由基的能力降低，機體產生氧化應激損傷。也提示氧化應激是缺氧缺血性腦損傷所致腦水腫的原因之一。本研究結果還顯示，缺氧缺血造模3d后，SOD、GSH-PX降低、MDA升高最明顯，較造模7 d時明顯，提示在缺氧缺血早期即應開始應用減輕氧化應激水平的治療措施。

ɑ-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)由Reed等于1951年首次從豬肝中分離出來，是一種天然存在的、人體也可以合成的化合物，也是已知天然抗氧化劑中效果最強的一種。ALA具有水溶性及脂溶性雙重特性，分子量小，易于通過血腦屏障，能清除活性氧和自由基，螯合金屬離子，再生體內的抗氧化劑，從而減弱氧化應激，因此，ALA具備一般抗氧化劑所不能及的抗氧化性[5]。長期以來，ALA 的神經保護作用一直備受關注[12-14]。Toklu等[15]研究發(fā)現(xiàn)，ALA可通過減輕氧化應激，保護創(chuàng)傷性腦損傷大鼠的血腦屏障穩(wěn)定性及降低腦水腫。國內外研究均證實，ALA對腦缺血再灌注損傷具有神經保護作用[6-7]。研究還發(fā)現(xiàn)[16]，ALA可通過增強氧自由基清除劑的活性而減輕氧自由基損傷，抑制缺血再灌注腦神經元調亡。ALA目前已廣泛應用于多種神經系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病、帕金森氏癥、糖尿病神經病變等的臨床治療并取得良好療效。本研究結果顯示，ALA治療組與HIBD組比較，各時間點腦組織勻漿GSH-PX回升，腦組織含水量回降(P<0.05)；造模后1 d時，SOD、MDA差異無統(tǒng)計學意義；造模后3、7 d時，SOD回升，MDA回降(P<0.05)。提示ALA可減輕缺氧缺血性腦損傷后腦水腫，而其機制之一可能是減輕缺氧缺血所致的氧化應激。本研究證實，ALA對新生大鼠缺氧缺血性腦損傷有神經保護作用，值得進一步研究。

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(編校：王儼儼)

Effect of alpha-lipoic acid on oxidative stress and cerebral edema after hypoxic-ischemic brain damage in neonatal rats

PANG Guo-xiang1, CHEN Guang-bin2, MAI Shui-qiang1Δ, WANG Rui-hua1, HUANG Mei-ying1

(1.Department of Pediatrics, People’s Hospital of Longgang District, Shenzhen 518172, China; 2.Department of Pharmacy, The Third People’s Hospital of Shenzhen, Shenzhen 518112, China)

ObjectiveTo investigate the effect of alpha-lipoic acid on oxidative stress and cerebral edema after hypoxic-ischemic brain damage(HIBD)in neonatal rats.MethodsA total of 108 neonatal 7-day-old Wistar rats were randomly divided into 3 groups: sham-operated group(sham,n=36), HIBD group(HIBD,n=36) and alpha-lipoic acid-treated group (treated group,n=36).Each group was divided into 3 sub-groups (n=12, per sub-group) based on different time points after HIBD (1 d, 3 d, 7 d).HIBD rat models were established by ligating the left common carotid artery,The sham-operated group and the HIBD group were treated with normal sodium injection intraperitoneally; treated group were treated with alpha-lipoic acid 100 mg/kg every 12 hours in 5 days.Animals were sacrificed at different time points.Changes of brain water content were determined by dry-wet weight method.And the levels of SOD，MDA，GSH-PX were measured.ResultsHIBD group showed an upward trend in brain water content and the level of MDA after HIBD, were higher than that of sham-operated group at each time point (P<0.05).Meanwhile, the levels of SOD and GSH-PX showed the downward trend in HIBD group.The levels of brain water content and the level of MDA in treated group were significantly lower than HIBD group at each time point (P<0.05).And the levels of SOD and GSH-PX in treated group were significantly higher than HIBD group at 3 d and 7 d.on the contrary, the level of MDA in treated group was significantly lower than HIBD group at 3 d and 7 d.ConclusionAlpha-lipoic acid can amiliorate cerebral edema, so it can prevent HIBD.The neuronal protective mechanism might be reverse oxidative imbalance in the brain of neonatal rats with HIBD.

alpha-lipoic acid; hypoxic-ischemic brain damage; neonatal rats; cerebral edema; oxidative stress

深圳市科技計劃項目(201203328)；深圳市龍崗區(qū)科技計劃項目(20140609300101)

龐國象，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：小兒神經系統(tǒng)疾病，E-mail：pangcyh@163.com；麥水強，通訊作者，男，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：小兒危重癥醫(yī)學，E-mail：maisq@sina.com。

R722.1

A

1005-1678(2015)05-0044-04