天麻素脂質(zhì)體的制備及其結(jié)構(gòu)表征

覃引，邱樹毅，張振，周劍麗，胡女丹

(1.貴州理工學(xué)院 制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

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天麻素脂質(zhì)體的制備及其結(jié)構(gòu)表征

覃引1，邱樹毅2，張振1，周劍麗1，胡女丹1

(1.貴州理工學(xué)院 制藥工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550003；2.貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550025)

目的 研究天麻素脂質(zhì)體的最佳制備工藝，并表征其結(jié)構(gòu)。方法 采用薄膜—超聲法制備。以包封率為指標(biāo)，卵磷脂與膽固醇之間的質(zhì)量比、油水相的體積比和超聲時(shí)間為考察因素，采用L9(34)正交試驗(yàn)法優(yōu)化制備工藝；顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)、粒徑大小和分布，并測(cè)定其包封率和穩(wěn)定性。結(jié)果 回歸方程式為Y=239.75X+0.0207(n=5),R2=0.9996，在0.002～0.010 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。最佳工藝為：卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1、水油相的體積比為3:1、超聲時(shí)間控制為60 min；脂質(zhì)體呈現(xiàn)類球形或橢圓形，形態(tài)規(guī)則、大小均勻；平均包封率為60.65%，平均粒徑分布為327 nm，穩(wěn)定性良好。結(jié)論 優(yōu)選后的制備工藝穩(wěn)定，所需設(shè)備簡(jiǎn)單，包封率較高，粒徑較均勻，可適用于包埋水溶性藥物。

天麻素；脂質(zhì)體；包封率；制備工藝；正交試驗(yàn)

天麻GastrodiaelataBl.為蘭科植物天麻的干燥塊莖，是我國(guó)名貴的中藥材之一，天麻素(gastrodine)是其主要成分[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明天麻素具有增加中央及外周動(dòng)脈血管順應(yīng)性,降低外周血管阻力,增加心腦血管血流量,產(chǎn)生溫和降壓作用,而且對(duì)心肌細(xì)胞、腦組織均有保護(hù)作用,同時(shí)具有鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛、增強(qiáng)免疫等作用，臨床上廣泛用于治療心腦血管、微循環(huán)系統(tǒng)疾病，療效顯著，且無(wú)明顯不良反應(yīng)[2]。目前常用制劑有天麻素注射液、天麻素片、天麻素膠囊。但一般口服劑型的生物利用度不高，采用脂質(zhì)體當(dāng)做藥物載體能有效提升患者胃腸道吸收能力，改善原本藥物的釋放性質(zhì)[3]。本研究將天麻素制成天麻素脂質(zhì)體，對(duì)其制備工藝進(jìn)行了研究，確定了最佳配方，并測(cè)其包封率、穩(wěn)定性、粒度、形狀等質(zhì)量指標(biāo)，旨在提高療效，為天麻素的新劑型開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 天麻素對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110807)；天麻(購(gòu)自貴州省藥材公司)；大豆卵磷脂(購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠，批號(hào)：041129)； 膽固醇(購(gòu)自海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：051120)；磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH6.8)，嚴(yán)格按照2010年版《中國(guó)藥典》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配制；其他試劑均為分析純。

1.3 方法

1.3.1 脂質(zhì)體的制備：采用薄膜—超聲法制備脂質(zhì)體，稱取大豆相應(yīng)劑量的卵磷脂和膽固醇，按照一定的比例倒入三角瓶容器內(nèi)并加入15 mL氯仿溶解，氯仿經(jīng)過(guò)蒸發(fā)后，瓶壁內(nèi)形成一層脂膜，對(duì)脂膜給予干燥、去除氯仿味操作，加入15 mL的乙醚進(jìn)行溶解處理，并在恒溫振蕩器加入 5 mL PBS溶液振蕩至均勻狀態(tài)，隨后使用超聲儀器制成乳(W/O型)，靜置0.5 h，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乳液有機(jī)溶劑，此時(shí)容器內(nèi)壁出現(xiàn)凝膠，依次實(shí)施蒸發(fā)處理使得凝膠脫落，添加50 mL PBS溶液，獲取脂質(zhì)體的混懸液，冰放入冰箱內(nèi)存儲(chǔ)。

1.3.2 脂質(zhì)體包封率的測(cè)定

① 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱定在80 ℃環(huán)境下干燥至恒重狀態(tài)的10 mg天麻素標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL的容量瓶并甲醇稀釋并定容至刻度，輕輕混勻，得0.1 mg/mL的天麻素貯備液。分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL貯備液，置于10 mL容量瓶?jī)?nèi)，用甲醇定容形成梯度溶液，以甲醇作為對(duì)照，于220 nm處分別測(cè)量其吸光度。

② 精密度試驗(yàn)：選取0.006 mg/mL天麻素對(duì)照品溶液，以甲醇作為對(duì)照，于220 nm處測(cè)量其吸光度(n=5)。

③專屬性試驗(yàn)分別選用空白、破乳脂質(zhì)體和天麻素標(biāo)準(zhǔn)品在同一環(huán)境下利用光譜進(jìn)行掃描。

④ 脂質(zhì)體的包封率：采用移液槍吸取合理劑量的脂質(zhì)體混懸液添加至1.5 mL塑料離心管內(nèi)，利用離心機(jī)進(jìn)行10 min的冷凍離心操作，同時(shí)吸取清液0.5 mL放入50 mL容器內(nèi)，采用PBS溶液進(jìn)行稀釋至刻度，在220 nm處測(cè)量其吸光度，采用外標(biāo)法算得游離藥物量W游。按下式計(jì)算包封率：

包封率(En)%=(W總-W游))/ W游×100%

1.3.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化脂質(zhì)體制備工藝：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出的結(jié)論可以看出，卵磷脂與膽固醇之間的質(zhì)量比(A)、油水相的體積比(B)和超聲時(shí)間(C)等方面均會(huì)影響脂質(zhì)體的形成及變化。本次實(shí)驗(yàn)通過(guò)質(zhì)量比(A)、體積比(B)、超聲時(shí)間(C)3項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行研究，運(yùn)用正交實(shí)驗(yàn)方法，各個(gè)因素分別抽取3個(gè)水平，采用不同因素的包封率(En %)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用L9(34)正交表統(tǒng)計(jì)分析，獲得包封天麻素最佳工藝組合。因素水平表見(jiàn)表1。

第三，要完善農(nóng)業(yè)用水計(jì)量設(shè)施。目前我們的計(jì)量設(shè)施不完善，僅占1/3左右。目前水費(fèi)的收取有兩種形式，一種是按方計(jì)算，有計(jì)量設(shè)施的，比如1 m3水交多少錢。最明顯的是井灌區(qū)，都是搞IC卡，農(nóng)民付了多少水費(fèi)，插進(jìn)去就灌多長(zhǎng)時(shí)間，這種方法的收取是百分之百，而且科學(xué)合理。但是非井灌區(qū)很多都是按畝收費(fèi)，一畝地核定多少稻谷、核定多少玉米，折算成貨幣來(lái)收取，實(shí)際用了多少水也不清楚，所以下一步要加大量水設(shè)施的建設(shè)。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels table

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)：根據(jù)優(yōu)化的工藝組合制備3批天麻素脂質(zhì)體，根據(jù)“1.3.2”項(xiàng)下④計(jì)算獲得包封率。

1.3.5 觀察脂質(zhì)體形態(tài)并測(cè)量粒徑

① 把制備完成的脂質(zhì)體混懸液進(jìn)行多倍的稀釋，吸取一定的液體滴入載玻片，蓋好蓋玻片，放在顯微鏡下認(rèn)真觀察并拍照。

② 通過(guò)負(fù)染法把脂質(zhì)體進(jìn)行稀釋操作，給予1 %磷鎢酸實(shí)施染色，放入銅網(wǎng)上進(jìn)行制樣，借助透射電鏡認(rèn)真觀察并拍照。

③ 脂質(zhì)體采用水當(dāng)做分散介質(zhì)，通過(guò)激光粒度分析儀測(cè)量其粒徑分布情況及其平均大小。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

① 計(jì)算脂質(zhì)體的滲透率

測(cè)定制備當(dāng)日脂質(zhì)體的包封率，隨之將脂質(zhì)體放入冰箱內(nèi) 4 ℃ 存儲(chǔ)。分別在10、20、30、40、50 d時(shí)測(cè)量脂質(zhì)體的包封率，滲透率公式為：

滲透率(Pe)% =(當(dāng)日所測(cè)包封率-定期測(cè)量包封率)/當(dāng)日測(cè)得的包封率×100%。

② 粒徑變化

按“①”項(xiàng)下的方法處理樣品，再按“1.3.5”項(xiàng)下的③方法測(cè)量脂質(zhì)體平均粒徑變化情況。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以吸光度為縱坐標(biāo)(Y),濃度為橫坐標(biāo)(X)，繪制天麻素標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程式為：Y=239.75X+0.0207,R2=0.9996(n=5)。由計(jì)算結(jié)果可知，在0.002～0.010 mg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。見(jiàn)圖1。

圖1 天麻素的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of gastrodine

2.2 精密度試驗(yàn)結(jié)果 獲取該脂質(zhì)體的吸光度值RSD為0.41%,表明本試驗(yàn)所用儀器具有良好的精密度。

2.3 專屬性試驗(yàn)結(jié)果 天麻素標(biāo)準(zhǔn)溶液、天麻素脂質(zhì)體和空白脂質(zhì)體，3者在相同波長(zhǎng)處，吸光度無(wú)干擾，表明方法的專屬性較強(qiáng)。見(jiàn)圖2。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)樣品(a)、天麻素脂質(zhì)體(b)和空白脂質(zhì)體(c)的紫外圖譜Fig.2 Ultraviolet spectrum of standard sample (a)，gastrodine liposome (b) and black liposome(c)

2.4 正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳工藝參數(shù) 各因素對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響大小次序?yàn)镃 > B > A，最佳配方為C3B2A3，即：卵磷脂與膽固醇的質(zhì)量比為4:1、水油相的體積比為3:1、超聲時(shí)間控制為60 min。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 正交試驗(yàn)L9(34)結(jié)果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal experiment design

表3 方差分析表Tab 3 Analysis of orthogonal experiment design variance

F0.05(2，2)=19.00，F(xiàn)0.01(2，2)=99.00

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 3批天麻素脂質(zhì)體平均包封率是60.65%，計(jì)算的RSD為2.31 %。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明按照最佳制備配方完成的各批脂質(zhì)體之間的包封率更為接近，重現(xiàn)性良好，表明使用的制備和測(cè)量方法可行性高。

2.6 天麻素脂質(zhì)體的形態(tài)

2.6.1 脂質(zhì)體的顯微形態(tài)：制備的脂質(zhì)體呈現(xiàn)類球形或橢圓形，形態(tài)規(guī)則，脂質(zhì)體大小均勻，見(jiàn)圖3，圖4。

圖3 顯微鏡下天麻素脂質(zhì)體的形態(tài)(×400)A:染色脂質(zhì)體；B：未染色脂質(zhì)體Fig.3 Morphology of gastrodine liposome under microscope (×400)A:dyed liposome;B:un-dyed liposome

圖4 電鏡下的天麻素脂質(zhì)體形態(tài)(×400)Fig.4 Microscope of gastrodine liposome under transmission electron microscope(×400)

2.6.2 測(cè)定脂質(zhì)體粒徑大小及分布情況：天麻素脂質(zhì)體的平均粒徑為327 nm， 粒徑分布見(jiàn)圖5， 圖5表明脂質(zhì)體粒徑分布處于均勻狀態(tài)。

圖5 脂質(zhì)體的粒徑分布Fig.5 Particle diameters distribution of liposmes

2.7 滲透率測(cè)定結(jié)果 任意選擇制備完成的脂質(zhì)體樣品(7號(hào)樣品) 按照“1.3.3”項(xiàng)下③的方法對(duì)其滲透率進(jìn)行計(jì)算，見(jiàn)表6，由此可知，脂質(zhì)體放置50 d后再次計(jì)算其滲透率為0.687%，RSD為1.89%。認(rèn)真觀察脂質(zhì)體外觀情況，脂質(zhì)體隨著貯存時(shí)間的增加，粒徑大小并無(wú)明顯變化，并未發(fā)現(xiàn)明顯的團(tuán)聚和沉淀情況，見(jiàn)圖4。pH值也并未改變。表示該脂質(zhì)體具有緩釋的效果并具有良好的穩(wěn)定性，能夠長(zhǎng)期貯存。

3 討論

本研究借助薄膜-超聲法對(duì)天麻素脂質(zhì)體進(jìn)行制備，這種制備方法操作比較簡(jiǎn)單，粒徑分布良好，成為制備脂質(zhì)體的主要方法之一。正交試驗(yàn)的方差分析結(jié)果表明所選因素對(duì)包封率的測(cè)定無(wú)顯著影響，因此不需要再進(jìn)行多重比較分析，原因可能因?qū)嶒?yàn)存在誤差且自由度比較小(僅為2)，導(dǎo)致試驗(yàn)的靈敏度下降，在一定程度上掩蓋考察因素的顯著性[4]。

對(duì)于包封率的測(cè)定，本文采用了“高速離心+UV檢測(cè)”的方法，結(jié)果表明精密度良好，可信度高。除此之外，包封率的測(cè)定還有“透析”[5]、“電泳”[6]、“凝膠層析”[7]、超濾[8]等方法，但相比本文采用的方法，操作較繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)。多種因素會(huì)影響脂質(zhì)體的包封率[9-11]，除去制備所用工藝外，選用物質(zhì)的分子量、pH值等都會(huì)對(duì)其有一定的影響，但上述因素還有待深入研究。

對(duì)天麻素脂質(zhì)體進(jìn)行制備的過(guò)程中，加入相應(yīng)劑量的卵磷脂能出現(xiàn)雙分子層的作用，添加膽固醇能促使脂質(zhì)體形成雙層膜，降低膜流動(dòng)情況及其滲透率[12-13]。通過(guò)分析其因素可知，添加的膽固醇劑量并非越大效果越好，如果加入大量的膽固醇可能導(dǎo)致其與脂膜發(fā)生反應(yīng)，促使脂膜間的藥物與磷脂的功能有所減弱，一定程度上可以降低脂質(zhì)體的包封率，通過(guò)本試驗(yàn)結(jié)果得出卵磷脂與膽固醇比值為2:1時(shí)，脂質(zhì)體的效果最好。

[1] 岑信力.天麻的化學(xué)成分與藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥材，2005，28(10) ：958-962.

[2] 于穎，樊光輝.天麻素的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10(9)：1117-1118.

[3] 齊憲榮，魏樹理.脂質(zhì)體作為藥物輸送系統(tǒng)的應(yīng)用[J]).中國(guó)要學(xué)雜志，1999，34(3)：145-147.

[4] 崔福德主編.藥劑學(xué)[M].第5版.北京： 人民衛(wèi)生出版社，2003，389-390.

[5] 鄭慶忠，劉利軍.pH梯度法制備氧化苦參堿脂質(zhì)體[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2006，37(10)： 679-681.

[6] 魏銘，劉小平，李惠，等.苦參堿脂質(zhì)體的研究[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，28(8)： 46-50.

[7] 苗彩云，鄧樹海，陳江飛.氧化苦參堿負(fù)電荷脂質(zhì)體的制備及理化性質(zhì)研究[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2006，41(8)：1400-1404.

[8] 雷國(guó)峰，陳琳，鄧英杰，等.超濾法-HPLC法測(cè)定燈盞花素脂質(zhì)體的包封率[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，23(4)：237-240.

[9] 牟琳琳，徐洋，蔣宮平，等.改良 pH 梯度法制備鹽酸小檗堿脂質(zhì)體[J].中國(guó)新藥雜志，2013，48(1)：49-53.

[10] 李文靜，楊志強(qiáng)，王杏林.兩種硫酸長(zhǎng)春新堿脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法的比較[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(14)：71-75.

[11] 陳蓓，袁明奎，王建華，等.葡聚糖凝膠柱色譜法測(cè)定阿苯達(dá)唑納米脂質(zhì)體包封率的方法研究[J].中國(guó)藥房，2012，23(45)： 4281-4284.

[12] 曾誠(chéng)，黃偉，何承輝，等.復(fù)合磷脂脂質(zhì)體的研究進(jìn)展[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志，2015，42(1)：91-95.

[13] 蘇鵬權(quán)，趙莉，徐寶財(cái)，等.表面活性劑的性能與應(yīng)用(V)——脂質(zhì)體及其應(yīng)用[J].日用化學(xué)工業(yè)，2014，44(5)：252-256.

(編校：王冬梅)

Preparation and structure characterization of gastrodine liposomes

QIN Yin1, QIU Shu-yi2, ZHANG Zhen1, ZHOU Jian-li1, HU Nv-dan1

(1.School of Pharmaceutical Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang 550003, China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Bio-pharmacy, Guiyang 550003, China)

ObjectiveTo study the optimum preparation process of gastrodin liposome, characterization its structure.MethodsPerpared gastrodin liposome with film-ultrasonic method.The entrapment efficiency as index, quality between lecithin and cholesterol ratio, oil-water phase volume ratio and ultrasonic time as factors by L9(34) orthogonal test to optimize the preparation process.Observed the liposome morphology, particle size and distribution under the microscope, and determined the entrapment efficiency and stability.ResultsRegression equation wasY=239.75+0.0207X(n=5),R2=0.9996, 0.002 to 0.010 mg/mL had a good linear relationship.The optimum of preparation process: lecithin and cholesterol quality ratio was 4:1, water and oil phase volume ratio of 3:1, ultrasonic time control for 60 min; Liposomes showed spherical or oval shape, regular shape, uniform size.The average entrapment efficiency was 60.65%, the average particle size distribution at 327 nm, and it had good stability.ConclusionThe preparation of gastrodine liposome has advantages of simple, higher entrapment efficiency and even particle size.The method can be used for embedded water-soluble medicine.

gastrodine; liposome; entrapment efficiency; preparation process; orthogonal test

貴州理工學(xué)院科研基金(XJ2K20131204)

覃 引，女，碩士，講師，研究方向：藥物制劑，E-mail：qinyin0510@126.com。

R282.71

A

1005-1678(2015)05-0029-04