利用 ITS技術研究蘋果砧木遺傳多樣性

羅思謙，王彥，錢關澤

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252300)

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利用 ITS技術研究蘋果砧木遺傳多樣性

羅思謙，王彥，錢關澤Δ

(聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252300)

目的 探索蘋果屬植物野生砧木間的親緣關系與雜交親和性間的聯(lián)系。 方法 對24個來自中國不同地域的野生蘋果屬砧木樣品使用nrDNA ITS序列分析，并結(jié)合對蘋果屬植物砧木雜交親和性的研究。 結(jié)果 本研究成功測出24個樣本的序列并做出遺傳距離矩陣圖與遺傳樹狀圖。結(jié)論 蘋果屬植物野生砧木間的親緣關系和砧木雜交親和性之間有一定的聯(lián)系。

砧木; ITS;親緣關系

砧木(rootstock)指進行植物嫁接時接穗以下的植株，整植的果樹、樹體的根段枝段都可以作為砧木。砧木的作用在于固定和支撐接穗，與接穗愈合后形成植株生長、結(jié)果。優(yōu)良的砧木與接穗嫁接親和性好，生長旺盛，同時具有抗旱、寒、鹽堿等效果。是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)尤其是果樹業(yè)發(fā)展不可或缺的重要工具之一。中國蘋果嫁接技術歷史悠久，從古代的“以柰接柰”到現(xiàn)在各種營養(yǎng)型砧木、矮化型砧木、抗性砧木的大范圍的普及應用已經(jīng)有1500多年的歷史。但中國野生蘋果砧木繁多，同時由于種間雜交、地理隔離、無融合生殖等多方面的原因由蘋果屬植物的遺傳多樣性非常復雜，形態(tài)性狀變異多端，形成了大量的種間過渡類群和地理類型。這些類群或類型有的與親本相似而被歸于親本中，有的與親本形態(tài)差異較大，因而被作為獨立的種對待。雖然有些個體形態(tài)上幾乎一樣，但這些包括親本和雜交后代的大量類型間的遺傳信息并不一致，因此在進行蘋果嫁接時表現(xiàn)出不同的親和性。如楊進[1]和韓振海[2]都報道山荊子與蘋果親和力強，喬化，早果高產(chǎn)，但有“小腳”現(xiàn)象；同為湖北海棠的變種，平邑甜茶嫁接蘋果親和力強，喬化，產(chǎn)量中等，而產(chǎn)于泰山的泰山海棠親和力較差，但具有一定矮化效應。楊進發(fā)現(xiàn)山荊子不抗鹽，在堿性土中易發(fā)生黃葉?。欢诰吹萚3]報告山西房山山荊子卻比較抗鹽有些地理類型嫁接蘋果生長勢超過山荊子[4]。但也有些嫁接親和力不強；其他種如花葉海棠和隴東海棠[5]及滇池海棠等嫁接蘋果均有一定親和性，多矮化，但也均出現(xiàn)“大腳”或“小腳”現(xiàn)象。

ITS(internal transcribed spacer)：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。植物細胞中對RNA進行編碼的基因組是一個高度重復的串聯(lián)序列，其中ITS位于nrDNA非編碼轉(zhuǎn)錄區(qū)18S和26S之間。其特點在于通過不等交換和基因轉(zhuǎn)換經(jīng)歷快速的協(xié)同進化使重復單位在基因組內(nèi)變得一致，同時協(xié)同進化對來自不同親本種類的重復單位不起作用[6]，所以ITS序列所有選擇壓力小，中度保守型。其適合屬間[7]、屬下和種間的系統(tǒng)分類學研究[8-9]。迄今為止，已成功應用于很多分類群的系統(tǒng)學研究中，被普遍認為適合確定植物屬間及屬內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)生關系[10-12]。同時在蘋果屬內(nèi)成功的案例也很多如利用ITS馮婷婷等[13]得出變?nèi)~海棠是由隴東海棠與花葉海棠雜交而來。唐建民[14]為進一步研究變?nèi)~海棠的雜交起源利用ITS序列對變?nèi)~海棠進行了測序分析并提供了分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗所選材料均由全國采集而來，涉及山東，云南，四川，湖北，湖南，江蘇，浙江，廣東等多個省份。材料均選擇生長旺盛且無病蟲害的植株進行采集，主要選擇嫩葉進行采集，放入密封袋編號并用硅膠干燥保存。

表1 實驗材料來源Tab.1 Source of materials

1.2 樣本基因組DNA的提取 將干燥好的樣本葉片置于研缽中加入石英砂研磨成為粉末狀，將其置于EP離心管中。將經(jīng)過預冷的CTAB free緩沖提取液800 μL置于EP離心管中，上下激烈震蕩使之混勻后水浴10 min，為首次提取多酚等雜質(zhì)，3000 r/min離心5 min，將上清液棄除。將β-巰基乙醇提前加入到CTAB裂解液中，密封65 ℃預熱，將預熱好的混合CTAB裂解液迅速加入，并65 ℃水浴2 h，期間10 min上下顛覆震動一次，離心5000 r/min、10 min并取上清液。加入等體積的氯仿異戊醇，冷卻至室溫后，上下劇烈震蕩使之混勻，靜置10 min，離心10 min，將上層水相移至新EP離心管中。并重復一次。加入2/3體積異丙醇與1/4體積的5 mol/L的NaCl溶液，顛倒混勻后置于-20 ℃冰箱中5 min，12000 r/min 10 min，沉淀DNA，70%乙醇洗滌3次，置于無菌操作臺晾干，加入200 μL純水或 1×TE緩沖液及RNA酶1 μL，4 ℃過夜保存。

1.3 將提取出來的基因組DNA進行ITS分子標記 參考White[15]對蘋果屬ITS序列擴增方法及測序擴增引物的設計,使用引物為IT4 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’IT5 5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’對其進行ITS-PCR擴增。使用50 μL體系進行擴增。取Template 1 μL，F(xiàn)orward Primer 2 μL，Reverse Primer 2 μL，Reverse Primer 1 μL， 2×Taq PCR MasterMix混合物1 μL，再加RNase-free Water補至50 μL。

最終最適宜的擴增程序為94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，48.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)，72 ℃延伸2 min。擴增完成之后進行ITS-PCR產(chǎn)物的檢測，經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 ITS-PCR產(chǎn)物純化及測序 使用DNA回收試劑盒(購于Genstar公司)回收及純化目的片段的PCR產(chǎn)物，步驟如下：將瓊脂糖凝膠中的目的DNA片段(盡量將目的所需片段全部切下以保持回收效率)，放入干凈的EP離心管中，標號并 稱取重量。向切下的凝膠塊中加入3倍體積的Buffer PG，1 mg可視為1 μL。50 ℃水浴15 min，水浴期間為保膠塊的充分溶解需不斷的震蕩離心管。如有未溶解徹底的凝膠塊，可補加Buffer PG并繼續(xù)水浴幾分鐘直至完全溶解。之后檢測pH值，如pH大于7.5，為使其pH值降到5～7可向其中加入3M醋酸鈉。將收集管放入膠回收的吸附柱內(nèi)，并加入200 μL Buffer PS然后放入離心機12000 r/min 2 min，將收集管中的廢液棄掉。將上面第3步中所得到的溶液加入到吸附柱中，將收集管放置吸附柱中，室溫下靜置 5 min， 12000 r/min 2 min，棄廢液。加入5000 μL Buffer PG到吸附管中，12000 r/min 1 min，棄廢液，將吸附柱放入到收集管中。加入事先已經(jīng)加入無水乙醇的650 μL Buffer PW與吸附柱中，12000 r/min離心1 min，棄廢液，將吸附柱放回收集管中。12000 r/min離心2 min，棄廢液，室溫下放置以至徹底晾干。此步驟主要為去除吸附柱中的殘留乙醇，如乙醇有殘留將會影響后續(xù)的酶促反應。準備新的EP離心管，將吸附柱放入并標號，向吸附柱中的吸附膜種間位置懸空滴加pH值為8.5的50 μL Buffer EB，靜置于室溫環(huán)境下3 min后12000 r/min離心2 min，收集目的片段溶液并與-20 ℃進行保存。為保證回收質(zhì)量最后得到的洗脫液體積不得低于30 μL。將純化好的PCR產(chǎn)物送至生工公司上海測序部進行DNA測序(見圖1、圖2)。

圖1 部分蘋果屬植物總DNA瓊脂糖電泳1.湖北海棠；2.隴東海棠；3.河南海棠；4.三葉海棠；5.滇池海棠；6.垂絲海棠；7.毛山荊子；8.尖嘴林檎；9.山荊子；10.稻城海棠；11.日瓦海棠；12.麗江山荊子；13.西府海棠；14.平邑甜茶；15.海棠花；16.錫金海棠；17.喬佬斯基海棠；18.BH40；19.B118Fig.1 Total DNA of some samples of Malus on agarose gel1.Malus hupehensis; 2.Malus kansuensis; 3.Henan begonia; 4.Clover begonia; 5.Dianchi Lake begonia; 6.Malus halliana; 7.Moriyama Ko; 8.Malus melliana; 9.M.baccata; 10.Daocheng begonia; 11.Geneva begonia; 12.M.rockii sub; 13.Malus micromalus; 14.Malus hupehensis; 15.Begonia flower; 16.Sikkim crabapple; 17.Joe guy Si Ji begonia; 18.BH40; 19.B118

圖2 部分樣品ITS-PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳檢測圖M=marker；1.湖北海棠；2.隴東海棠；3.河南海棠；4.三葉海棠；5.滇池海棠；6.垂絲海棠；7.毛山荊子；8.尖嘴林檎；9.山荊子；10.稻城海棠；11.日瓦海棠；12.麗江山荊子；13.西府海棠；14.平邑甜茶；15.海棠花；16.錫金海棠；17.喬佬斯基海棠；18.BH40；19.B118；20.美1Fig.2 Agarose gel electrophoresis map of PCR products amplified of ITSM=marker；1.Malus hupehensis; 2.Malus kansuensis; 3.Henan begonia; 4.Clover begonia; 5.Dianchi Lake begonia; 6.Malus halliana; 7.Moriyama Ko; 8.Malus melliana; 9.M.baccata; 10.Daocheng begonia; 11.Geneva begonia; 12.M.rockii sub; 13.Malus micromalus; 14.Malus hupehensis; 15.Begonia flower; 16.Sikkim crabapple; 17.Joe guy Si Ji begonia; 18.BH40; 19.B118;20.American 1

2.2 測序結(jié)果的處理 得到測序結(jié)果之后，通過Chromas軟件查看測序序列的質(zhì)量和堿基峰圖中峰形的變化，如果峰圖中出現(xiàn)套峰過多，為保證測序結(jié)果的可靠性則應該重新進行測序。對于機讀度數(shù)不準或者未正常讀數(shù)應該根據(jù)堿基峰圖中的峰形給予糾正。采用ContigExpress軟件對反向測序及雙向測通的序列進行拼接，然后使用ClustalX軟件進行調(diào)整和序列對比。利用MAGE5首先計算各個ITS序列中ITS1、5.8S以及ITS2的長度和其分別的GC含量，見表2。同時檢測種子植物的特有保守基因序列5’-GAATTGCAGAATC-3’是否存在于5.8S中。見圖3，圖4。

表2 蘋果屬中ITS1、5.8S和ITS2特征Tab.2 The characteristics of ITS1,5.8S and ITS2 in Malus

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

[1]

[2]1.22

[3]0.21 1.21

[4]1.23 0.10 1.22

[5]1.39 0.26 1.40 0.31

[6]1.25 0.05 1.23 0.06 0.28

[7]1.19 0.04 1.18 0.06 0.26 0.01

逆變器工作在第i狀態(tài)時，施加在定子繞組上的電壓空間矢量ui(SaSbSc)所處位置及指向總是與F的位置及指向一致的。但因F按六步轉(zhuǎn)動，而(SaSbSc)組合的開關狀態(tài)還有(0 0 0)和(1 1 1)二種，對電機本體來說，這二種開關狀態(tài)下電樞三相對稱短路，氣隙合成磁動勢趨近于零，將電壓空間矢量u0(0 0 0)和u7(1 1 1)稱為零矢量。

[8]0.33 1.28 0.28 1.29 1.47 1.27 1.23

[9]1.22 0.04 1.21 0.08 0.27 0.02 0.01 1.25

[10]1.26 0.06 1.28 0.11 0.30 0.07 0.05 1.34 0.06

[11]1.23 0.06 1.26 0.11 0.31 0.07 0.06 1.23 0.06 0.07

[12]1.19 0.04 1.18 0.06 0.26 0.01 0.00 1.23 0.01 0.05 0.06

[13]1.20 0.04 1.20 0.08 0.27 0.03 0.02 1.25 0.03 0.05 0.04 0.02

[14]1.23 0.10 1.27 0.13 0.32 0.09 0.08 1.36 0.09 0.11 0.10 0.08 0.09

[16]1.50 0.68 1.57 0.74 0.71 0.67 0.68 1.58 0.68 0.72 0.70 0.68 0.67 0.74 0.68

[17]0.26 1.19 0.14 1.19 1.43 1.19 1.14 0.29 1.17 1.27 1.20 1.14 1.17 1.31 1.15 1.52

[18]1.27 0.13 1.30 0.19 0.36 0.16 0.15 1.33 0.15 0.16 0.15 0.15 0.14 0.17 0.13 0.78 1.22

[19]1.21 0.04 1.20 0.08 0.28 0.04 0.03 1.25 0.04 0.06 0.04 0.03 0.01 0.10 0.02 0.70 1.18 0.15

[20]1.21 0.03 1.20 0.08 0.27 0.04 0.03 1.25 0.03 0.05 0.04 0.03 0.01 0.09 0.01 0.69 1.18 0.15 0.01

[21]1.21 0.03 1.20 0.08 0.27 0.04 0.03 1.25 0.03 0.05 0.04 0.03 0.01 0.09 0.01 0.69 1.18 0.15 0.01 0.00

[22]1.12 0.10 1.17 0.13 0.29 0.09 0.08 1.21 0.09 0.11 0.09 0.08 0.08 0.10 0.08 0.75 1.12 0.16 0.09 0.08 0.08

[23]1.21 0.03 1.20 0.09 0.28 0.04 0.03 1.25 0.03 0.05 0.04 0.03 0.01 0.09 0.01 0.68 1.18 0.15 0.01 0.00 0.00 0.08

[24]1.21 0.03 1.20 0.08 0.27 0.04 0.03 1.25 0.03 0.05 0.04 0.03 0.01 0.09 0.01 0.69 1.18 0.15 0.01 0.00 0.00 0.08 0.00

圖3 基于蘋果屬ITS序列的遺傳距離矩陣圖

Fig.3 Genetic distance of Malus species and based on ITS swquences

圖4 基于ITS序列的鄰接NJ樹Fig.4 The neighbor-joining tree based on ITS sequences

3 討論

通過圖4可以看出三葉海棠M.toringo、山荊子M.baccata、毛山荊子M.mandsurica、麗江山荊子M.rockii以及湖北海棠M.hupehensis、平邑甜茶M.hupehensis var.mengshanensis親緣關系較近。大量的野外調(diào)查的標本也顯示，這些類群間形態(tài)特征近似，形態(tài)變異復雜，性狀過渡現(xiàn)象非常普遍，常存在難以鑒別的標本，對這些類群的分類處理仍存在較大的爭議。錫金海棠M.sikkimensis、隴東海棠M.kansuensis、日瓦海棠與稻城海棠M.daochengensis聚集到了一起，也證實了其親緣關系較為接近。河南海棠M.honanensis、滇池海棠M.yunanensis和尖嘴林檎M.melliana 以及喬勞斯基林檎M.tschonoskii較為接近。同時結(jié)果也顯示湖北海棠、平邑甜茶、山荊子等與實驗中的幾個蘋果品種距離較近，這在一定程度上說明了為什么以湖北海棠為主的山荊子組植物會成為目前應用最廣泛的蘋果砧木，而且以湖北海棠與平邑甜茶作為蘋果砧木進行嫁接是親和性良好[16]。通過本實驗可以看出蘋果屬砧木嫁接的親和性與品種之間的親緣關系有關，親緣關系越近的種嫁接的親和性越高。

本研究在核DNA組中采用ITS方法進行序列測序，盡管能揭示出一定的種間親緣關系，但依舊存在一定的局限性。葉綠體DNA的進化相對比較保守，所以對種內(nèi)類群和新近分化類群所提供的信息位點不足，所以有必要尋找進化速率更加快速的葉綠體DNA進行研究。同時蘋果屬植物倍性復雜，雜交頻繁，所以有必要采用單拷貝或低拷貝核基因組進行研究，進一步揭示雜交事件和異源多倍體物種的形成及其間的親緣關系。

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(編校：譚玲)

Using ITS to research the genetic diversity of apple rootstocks

LUO Si-qian, WANG Yan, QIAN Guan-zeΔ

(College of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252300, China)

ObjectiveTo explore the relationship between the genetic relationship and the cross compatibility of the wild rootstocks which belong to malus mill plants.MethodsWith the antecedent study in the cross compatibility of the rootstocks of malus mill plants, this paper focuses on the nrDNA ITS sequence analysis in the samples of the wild rootstocks which belong to malus mill plants from different 24 regions of China.ResultsIt was successfully that having measured the sequence of 24 samples and having made the genetic distance matrix and genetic tree diagram.ConclusionThere is a certain relationship between the genetic relationship and the cross compatibility of the wild rootstocks which belong to malus mill plants.

rootstocks; ITS; kinship

國家自然基金(31070619,31170178), 山東省自然基金(ZR2011CM045)。

羅思謙，男，碩士，研究方向：資源植物與演化植物學，E-mail：120109690@qq.com；錢關澤，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：種子植物分類學等，E-mail：qianguanze@lcu.edu.cn。

S685.99

A

1005-1678(2015)05-0025-04