實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)肝水解肽樣品中牛、豬源性成分的對(duì)比研究

余燕，何素婷，王自強(qiáng)，鄧鋒Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180；2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

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實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)肝水解肽樣品中牛、豬源性成分的對(duì)比研究

余燕1，何素婷2，王自強(qiáng)2，鄧鋒1Δ

(1.廣東省食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510180；2 上海市食品藥品檢驗(yàn)所，上海 201203)

目的 對(duì)比實(shí)時(shí)熒光定量PCR與常規(guī)PCR檢測(cè)肝水解肽樣品中牛、豬源性成分的有效性。方法 對(duì)牛、豬源性肝水解肽樣品肝臟至上清液工藝段樣品進(jìn)行DNA提取，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR同時(shí)檢測(cè)樣品中的DNA。結(jié)果 實(shí)時(shí)熒光定量PCR和常規(guī)PCR在豬源、牛源肝水解肽從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中，均檢測(cè)到動(dòng)物源性DNA，在上清液至超濾液四中，均未檢測(cè)出動(dòng)物源性DNA。結(jié)論 兩種方法均可用在檢測(cè)肝水解肽樣品中牛、豬源性成分。實(shí)時(shí)熒光定量PCR同時(shí)還具有快速、簡(jiǎn)便、不污染環(huán)境、重復(fù)性好的特點(diǎn)，可明顯提高工作質(zhì)量及效率。

肝水解肽；熒光定量PCR；常規(guī)PCR；牛源性成分；豬源性成分

肝水解肽(heparolysate)是由牛或豬的肝臟經(jīng)酶類水解提取的低分子量多肽類物質(zhì)，含有多肽類、氨基酸類、核酸類等物質(zhì)[1]，促進(jìn)正常肝細(xì)胞的增殖和再生，對(duì)四氯化碳誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用，降低谷丙轉(zhuǎn)氨酶，促進(jìn)病變組織恢復(fù)[2]，用于慢性肝炎、肝硬化等疾病的輔助治療[3]。鑒于瘋牛病和羊瘙癢病的確診，凡是動(dòng)物組織來(lái)源的藥品均被列于高風(fēng)險(xiǎn)品種。由于歷史原因，質(zhì)量控制基本靠成品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，原料及中間產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝基本沒(méi)有質(zhì)量要求。該制劑生產(chǎn)廠家多，各廠家的生產(chǎn)工藝均不盡相同：如肝臟來(lái)源、水解酶的種類、水解條件、水解程度及超濾處理等。建立一個(gè)能鑒別真?zhèn)巍⒃u(píng)價(jià)優(yōu)劣，監(jiān)控質(zhì)量穩(wěn)定性、均一性的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)是關(guān)鍵。目前，有關(guān)動(dòng)物源性成分的檢測(cè)方法包括形態(tài)學(xué)分類方法、細(xì)胞學(xué)鑒定方法、生物化學(xué)鑒定方法及分子生物學(xué)方法等[4]。分子生物學(xué)中的PCR方法因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高且簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，而成為商品中動(dòng)物源性材質(zhì)鑒別的有效方法[5]，并在保健品、藥品、飼料、食品中的鑒定研究中得到廣泛應(yīng)用[6-12]。本研究擬采用熒光定量PCR與常規(guī)PCR來(lái)鑒別肝水解肽從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中的動(dòng)物源性，通過(guò)比較2種方法檢測(cè)肝水解肽樣品的有效性，以評(píng)價(jià)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)測(cè)定生化藥物動(dòng)物源性的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 儀器 Ultrospec 2100 核酸蛋白快速測(cè)定儀(購(gòu)自美國(guó)GE公司)；Gene Amp? PCR System 9700 核酸擴(kuò)增儀(購(gòu)自美國(guó)AB公司)；Bio-rad DNA凝膠電泳儀(購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司)；Bio-rad凝膠成像系統(tǒng)(購(gòu)自美國(guó)Bio-rad公司)；Applied Biosystems 7300 Real-time PCR system(購(gòu)自美國(guó)AB公司)。

1.2 試劑 檢測(cè)試劑盒Real Time PCR Porcine DNA Detection Kit、Real time PCR bovine DNA Detection kit(購(gòu)自大連寶生物工程有限公司)。Premix Taq擴(kuò)增反應(yīng)液(購(gòu)自Takara 公司)；提取試劑盒分別為DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products(購(gòu)自Takara公司)。Mnl I核酸限制性內(nèi)切酶、Sau3A I核酸限制性內(nèi)切酶(購(gòu)自NEB)。水為自制滅菌Milli-Q 純凈水。

1.4 引物序列 豬、牛引物序列參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)及出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中的引物的DNA序列[13-14]交由上海生工生物工程公司合成；豬的上游引物序列為5-GCCTAAATCTCCCCTCAATGGTA-3，下游引物序列為5- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3；牛的上游引物序列為5- GCCATATACTCTCCTTGGTGACA-3，下游引物序列為5- GTAGGCTTGGGAATAGTACGA-3。

1.5 樣品檢測(cè)

1.5.1 常規(guī)PCR檢測(cè)：采用DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products 提取試劑盒對(duì)肝水解肽樣品進(jìn)行DNA提取。其中對(duì)肝至上清液工藝段樣品，稱取20 mg樣品直接按試劑說(shuō)明書進(jìn)行提取；而對(duì)超濾液至注射液工藝段樣品，均取3 mL進(jìn)行凍干濃縮，將濃縮物加200 μL水復(fù)溶，吸取20 μL溶液進(jìn)行DNPremix Taq 25 μL，引物各1 μL(10 mmol/L， DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)足50 μL。電泳條件：電壓 90 V，時(shí)間30 min，用Gel red染色20 min，置于成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.5.2 熒光定量PCR檢測(cè)：采用Applied Biosystems 7300 Real-time PCR儀擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為25 μL，2×Premix 12.5 μL，Primer Mix 1 μL，Proble Mix 1 μL，DNA模板1 μL，去離子水補(bǔ)足25 μL。反應(yīng)條件為95 ℃，10 s；95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.5.3 PCR產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證:酶切條件：豬源性陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物按照Mnl I核酸限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件操作。牛源性陽(yáng)性對(duì)照PCR產(chǎn)物按照Sau3A I核酸限制性內(nèi)切酶核酸限制性內(nèi)切酶的酶切反應(yīng)條件操作。

2 結(jié)果

2.1 肝水解肽樣品(牛、豬源性)樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳 肝水解肽樣品(牛源性)樣品用PCR法擴(kuò)增出271 bp的牛基因，肝水解肽樣品(豬源性)樣品用PCR法擴(kuò)增出212 bp的牛基因，其大小與預(yù)期結(jié)果相符。從肝臟到酶解液的各工藝步驟段樣品中，均檢測(cè)到牛、豬源性DNA，在上清液及超濾液四中，全部都未檢測(cè)出牛、豬源性DNA。見圖1、圖2。

圖1 豬源性的肝水解肽樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖1.Marker；2.無(wú)；3.豬肝；4.勻漿液；5.酶解液；7.上清液；8.超濾液一；9.超濾液二；10.超濾液三；11.超濾液四；12-14.擴(kuò)增空白；15.陰性對(duì)照；16.MarkerFig.1 Amplification result of porcine derived materials in hydrolysate samples1.Marker;2.Nothing;3.Pork liver;4.Homogenate;5.Enzymatic hydrolysate;7.Supernatant;8.Ultrafiltrate 1;9.Ultrafiltrate 2;10.Ultrafiltrate 3;11.Ultrafiltrate 4;12-14.Amplification blank;15.Negative control;16.Marker

圖2 牛源性的肝水解肽樣品的常規(guī)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖1.Marker；2.牛肝；3.勻漿液；4.酶解液；5.上清液；6.超濾液一；7.超濾液二；8.超濾液三；9.超濾液四；10.擴(kuò)增空白；11.陰性對(duì)照；12.MarkerFig.2 Amplification result of bovine derived materials in hydrolysate samples 1.Marker;2.beef liver;3.Homogenate;4.Enzymatic hydrolysate;5.Supernatant;6.Ultrafiltrate 1;7.Ultrafiltrate 2;8.Ultrafiltrate 3;9.Ultrafiltrate 4;10.Amplification blank;11.Negative control;12.Marker

2.2 PCR產(chǎn)物的酶切驗(yàn)證 針對(duì)陽(yáng)性結(jié)果，分別對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了酶切驗(yàn)證，271bp的牛源性PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切的得到214bp和57bp的DNA片段，確證為牛源性成分。212bp的豬源性PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切的得到196bp和16bp的DNA片段，確證為豬源性成分。見圖3。

圖3 牛、豬源性PCR產(chǎn)物限制性酶切電泳圖1.20bpDNA Marker；2.牛PCR產(chǎn)物；3.牛酶切產(chǎn)物；4.豬PCR產(chǎn)物；5.豬酶切產(chǎn)物Fig.3 Restriction enzyme result of bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples1.20bpDNA Marker;2.Beef PCR product;3.Beef restricted DNA products;4.Pork PCR product;5.Pork restricted DNA products

2.3 肝水解肽各工藝步驟段樣品熒光定量PCR的檢測(cè)結(jié)果 分別按試劑盒操作要求對(duì)檢測(cè)肝水解肽樣品(牛、豬源性樣品)，DNA提取液進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)，并根據(jù)樣品的Ct值對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。檢測(cè)結(jié)果與常規(guī)PCR相同，肝水解肽樣品(牛、豬源性樣品)DNA提取液在使用相對(duì)應(yīng)的物種檢測(cè)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增時(shí)，酶解液及其之前的檢測(cè)結(jié)果及陽(yáng)性對(duì)照有擴(kuò)增曲線均為陽(yáng)性，上清液至注射液檢測(cè)，未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線或出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，但Ct值大于35.0，結(jié)果為陰性。見圖4、圖5。

圖4 牛源性肝水解肽樣品熒光定量擴(kuò)增圖Fig.4 Bovine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR

圖5 豬源性肝水解肽樣品熒光定量擴(kuò)增圖Fig.5 Porcine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR

3 討論

目前，生化藥物大多以豬、牛、羊等動(dòng)物的臟器組織為原料，經(jīng)過(guò)分離提取獲得，不同動(dòng)物種屬提取的生物大分子[15]。動(dòng)物種屬來(lái)源鑒別方法目前在美國(guó)藥典37版、英國(guó)藥典2013版、日本藥局方2011版、歐洲藥典8.0版及中國(guó)藥典2010年版均未收載。我國(guó)目前現(xiàn)有的豬、牛及羊PCR種屬鑒別的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)均參照中國(guó)出入鏡檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[13-14]。本實(shí)驗(yàn)以生化藥物中有代表性的肝水解肽為研究對(duì)照，研究結(jié)果表明熒光定量PCR和常規(guī)PCR均可對(duì)肝水解肽各工藝步驟段樣品中酶解液之前的各工藝步驟段樣品進(jìn)行豬、牛源性成分的檢測(cè)，這和一些文獻(xiàn)報(bào)道的熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)敏感性高于常規(guī)PCR不一致[16]。分析原因?yàn)樨i(牛)肝經(jīng)過(guò)多個(gè)工藝步驟的處理，上清液至注射液各工藝步驟段樣品特別是在超濾步驟中，采用超濾膜去除對(duì)大分子物質(zhì)，使得樣品中殘留的大分子DNA量大大減少，當(dāng)模板量較低時(shí)，無(wú)論是熒光定量PCR技術(shù)還是常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。何素婷等[17]研究常規(guī)PCR檢測(cè)肝水解肽樣品結(jié)果中發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR可以對(duì)肝水解肽樣品各工藝步驟段中超濾液四之前的樣品進(jìn)行豬、牛源性成分的檢測(cè)。這個(gè)結(jié)果差異分析原因?yàn)楦髯允褂肈NA提取的試劑盒不一致，導(dǎo)致結(jié)果有差別。本研究使用的DNA試劑盒為DNA Isolation Reagent for Meat and Meat Products，其主要是針對(duì)肉類制品，故對(duì)于豬(牛)肝、豬(牛)勻漿液、豬(牛)酶解液這一些提取DNA比較合適。而后續(xù)上清液至注射液各工藝步驟段樣品因幾乎不含肉類，加之后續(xù)步驟超濾對(duì)DNA損失的影響，故DNA未能被提取出來(lái)，所以熒光定量PCR和常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性。當(dāng)然濃縮的過(guò)程也可能會(huì)導(dǎo)致DNA的模板量低于檢測(cè)限，需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)核實(shí)。

同常規(guī)PCR相比，熒光定量PCR檢測(cè)肝水解肽樣品中牛、豬源性成分更為簡(jiǎn)單，耗時(shí)短。

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(編校：王冬梅)

Comparative study of bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR

YU Yan1, HE Su-ting2, WANG Zi-qiang2, DENG Feng1Δ

(1. Guangdong Institute for Food and Drug Control, Guangzhou 510180, China; 2. Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China)

ObjectiveTo compare real-time fluorescence quantitative PCR with general PCR in detecting bovine and porcine derived materials in hydrolysate samples.MethodsDNA were extracted from hydrolysate samples which prepared by different steps by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR.ResultsDNA of bovine and porcine could be detected by real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR in samples prepared in the processes before enzymolysis solution, but not detected in samples from supermatant to the fourth ultrafiltrate.ConclusionBoth real-time fluorescence quantitative PCR and general PCR can be applied to detect the fragments in hydrolysate samples.And real-time fluorescence quantitative PCR has the advantage such as rapid,convenient, non-environment-polluted, good repeatability, which improves the quality and efficiency.

hydrolysate; real-time fluorescence quantitative PCR; general PCR;bovine derived materials; porcine derived materials

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2014093、A2013158)

余燕，女，碩士，主管藥師，研究方向：分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用；E-mail：yuyan921124 @126.com；鄧鋒，通訊作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)在藥物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，E-mail：494409425@qq.com。

R917

A

1005-1678(2015)05-0018-03