高效液相色譜法測定牛黃清火丸中蒽醌類化合物的含量

刁全平，郭華，呂琳琳，李鐵純，侯冬巖

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

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高效液相色譜法測定牛黃清火丸中蒽醌類化合物的含量

刁全平，郭華，呂琳琳，李鐵純，侯冬巖Δ

(鞍山師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 鞍山 114007)

目的 建立同時測定牛黃清火丸中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚4種蒽醌類化合物含量的方法。方法 用20% 硫酸水解樣品，以丙酮為溶劑，索氏提取法提取樣品中的蒽醌類化合物，采用高效液相色譜法對其進(jìn)行測定，色譜柱為 Kromasil C18柱，流動相為甲醇-0.5%磷酸水溶液(75:25，V/V)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為230 nm。結(jié)果 樣品中4種蒽醌類化合物分別在1.50～150、0.950～95.0、1.30～130、1.15～115 mg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，4種化合物加標(biāo)回收率在98.14%～101.3%之間。結(jié)論 該方法操作便捷，準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，可用于牛黃清火丸的質(zhì)量控制。

牛黃清火丸；蒽醌類化合物；高效液相色譜法

牛黃清火丸是由大黃、黃芩、桔梗、牛黃、冰片、丁香、山藥、雄黃、薄荷腦九味中藥配伍而成的中成藥，具有清熱瀉火、散風(fēng)解毒等功效，主要用于治療肝、胃、肺蘊(yùn)熱引起的頭暈?zāi)垦?、口鼻生瘡、風(fēng)火牙痛、咽喉腫痛等病癥[1]。蒽醌類化合物具有較強(qiáng)的瀉下、消炎、抗菌作用[2-4]，是牛黃清火丸的主要功效成分，其含量的測定主要為HPLC法[5-10]。牛黃清火丸由于組分較多，成份復(fù)雜，在其產(chǎn)品質(zhì)量的控制上有一定的難度。為了更好地控制該制劑質(zhì)量，筆者通過對樣品中蒽醌類化合物的提取、分離、測定方法的考查，建立了牛黃清火丸中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等4種蒽醌類化合物含量的測定方法，為完善該制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 1525型HPLC儀，配2996型二極管陣列檢測器(美國Waters公司)，AL-204 電子天平(梅特勒-托利多)，HH-2 型恒溫水浴鍋(常州國華電器有限公司)。

大黃酸(含量：99.8%，批號：0757-200005)、大黃素(含量：99.8%，批號：110756-200110)、大黃酚(含量：99.8%，批號：110796-201319)、大黃素甲醚(含量：99.8%，批號：110758-201013)對照品購自中國食品藥品檢定研究院，均為供含量測定用。甲醇(色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司)，硫酸、磷酸、丙酮均為分析純，水為二次蒸餾水。牛黃清火丸(規(guī)格：3g，批號：20130808，內(nèi)蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司產(chǎn)品)購自鞍山巨力大藥房。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱：Kromasil C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；流動相：甲醇-0.5%磷酸水溶液(75:25，V/V)；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。理論塔板數(shù)按照大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚算分別是9035、8804、6946、4073，對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液色譜圖，見圖1。

圖1 牛黃清火丸中大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的高效液相色譜圖A:對照品；B:供試品；C:陰性對照1.大黃酸；2.大黃素；3.大黃酚；4.大黃素甲醚Fig.1 HPLC chromatograms of rhein, emodin, chrysophanol andphyscion in Niuhuang Qinghuo PillsA:reference substance; B:sample; C:sample without rheum officinale1.rhein; 2.emodin; 3.chrysophanol; 4.physcion

1.2.2 溶液的制備：①對照品溶液的制備：分別精密稱取大黃酸(3.0 mg)、大黃素(1.9 mg)、大黃酚(2.6 mg)、大黃素甲醚(2.3 mg)分置10 mL棕色量瓶中，乙醇溶解并稀釋至刻度，得大黃酸(300 mg/L)、大黃素(190 mg/L)、大黃酚(260 mg/L)、大黃素甲醚(230 mg/L)對照品儲備液。

分別移取4種對照品儲備液各0.1 mL置同一10 mL棕色量瓶中，乙醇稀釋至刻度，制得大黃酸(3.0 mg/L)、大黃素(1.9 mg/L)、大黃酚(2.6 mg/L)、大黃素甲醚(2.3 mg/L)混合對照品溶液。

②供試品溶液的制備：精確稱取經(jīng)剪刀剪碎的樣品約1.0 g，置于裝有冷凝器的100 mL圓底燒瓶中，加入20%的硫酸水溶液20 mL，沸水浴下回流水解30 min，將圓底燒瓶中的樣品倒入布氏漏斗中，抽濾除去水解液，濾渣用蒸餾水清洗，濾紙和濾渣在80 ℃下烘干后，以丙酮為溶劑進(jìn)行索氏提取，60 ℃水浴提取30 min，提取液轉(zhuǎn)移至100 mL量瓶中，稀釋至刻度為供試品溶液。

③陰性對照溶液的制備：按照處方(《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(中藥成方制劑)》第七冊WS3-B-1292-93)比例稱取除大黃以外的其余八味藥，按牛黃清火丸的制備工藝制備缺大黃的陰性樣品，按照步驟②方法，制得陰性對照溶液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別取“1.2.2①”條下的4種對照品儲備液0.05、0.1、0.5、1.0、5.0 mL置10 mL棕色量瓶中，乙醇稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“1.2.1”條色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸。

1.2.4 精密度試驗(yàn)：取“1.2.2①”條下的混合對照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積，計(jì)算含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)：按照步驟1.2.2②，制備供試品溶液6份，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取“1.2.2②”條下的供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別于0、2、4、8、24 h進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算含量及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.7 加標(biāo)回收率試驗(yàn)：精確稱取樣品約0.5 g 3份，分別加入不同質(zhì)量的4種對照品，按照步驟1.2.2②制備供試液，HPLC測定含量，計(jì)算各對照品的加標(biāo)回收率。

1.2.8 樣品含量測定：取“1.2.2②”條下制備的供試品溶液，HPLC進(jìn)行測定，檢測3次，利用外標(biāo)法測定其含量。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 以濃度C(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積A為縱坐標(biāo)得回歸方程分別為：大黃酸A=5.813×104C+5.061×103(r=0.9983)，大黃素 A=4.107×104C+1.997×103(r=0.9990)，大黃酚A=3.617×104C+2.122×103(r=0.9990)，大黃素甲醚A=5.499×104C+5.966×103(r=0.9950)。結(jié)果表明，大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚質(zhì)量濃度分別在1.50～150、0.950～95.0、1.30～130和1.15～115 mg/L范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線形關(guān)系。

2.2 精密度試驗(yàn) 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.17%、0.97%、1.04%和1.08%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3 重復(fù)性試驗(yàn) 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為0.86%、1.00%、0.45%和1.06%(n=6)，說明本方法重復(fù)性良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的RSD分別為1.15%、0.80%、1.04%和0.92%(n=5)，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn) 各對照品的加標(biāo)回收率結(jié)果見表1。

表1 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)Tab.1 Results of recovery

2.6 樣品含量測定 外標(biāo)法測定樣品含量結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of sample

3 討論

本文采用20%硫酸對樣品進(jìn)行水解，使結(jié)合態(tài)的蒽醌類化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)，增加樣品測定的準(zhǔn)確性。比較了二氯甲烷、無水乙醇、甲醇、丙酮、 乙醚等不同的索氏提取溶劑， 發(fā)現(xiàn)乙醇、甲醇沸點(diǎn)較高，回流需要較高的溫度，二氯甲烷、乙醚提取時間長，并且提取不完全，在所考察溶劑中，丙酮的提取效果最為理想，并且在加標(biāo)回收率試驗(yàn)中證明丙酮提取比較完全，因此選用其作為提取溶劑，并對提取溫度和提取時間進(jìn)行考查，最后確定60℃水浴提取30 min。

HPLC進(jìn)行含量測定，采用甲醇-0.5%磷酸水溶液體系作為流動相，磷酸作為酸劑調(diào)節(jié)色譜峰的峰形，提高分離度，甲醇作為有機(jī)改性劑。甲醇的比例太高，大黃酸峰與雜質(zhì)峰分離效果不好，若甲醇比例太低，延長分析時間，當(dāng)甲醇：0.5%磷酸水溶液=75:25時，4種蒽醌類化合物都能得到較好的分離，最后選擇其為流動相。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會.中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-中藥成方制劑(第七冊)[S].北京：中華人名共和國衛(wèi)生部，1993：25.

[2] 茍奎斌，孫麗華，婁衛(wèi)寧，等.大黃中4種蒽醌類化合物抑幽門螺桿菌效果比較[J].中國藥學(xué)雜志，1997，32(5)：24-26.

[3] 鄭言博，馬卓.蒽醌類化合物抗菌與抗腫瘤活性的研究進(jìn)展[J].湖北中醫(yī)雜志，2012，34(2)：74-76.

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[6] 靳丹虹，梁芳慧，李敬筠，等.微波輔助提取-HPLC測定決明子中的5種蒽醌類化合物[J].分子科學(xué)學(xué)報，2007，23(6)：429-433.[7] 李鑫楠，黃毅嵐，張丹，等.RP-HPLC測定熊膽降熱丸中的5種大黃蒽醌類化合物[J].華西藥學(xué)雜志，2007，22(6)：697-698.

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[10] 李磊，袁波，李發(fā)美.HPLC法測定復(fù)方大青葉注射液中大黃素和大黃素甲醚的含量[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2004，24(1)：38-40.

(編校：王儼儼)

Determination of anthraquinones in Niuhuang Qinghuo Pills by HPLC

DIAO Quan-ping, GUO Hua, LV Lin-lin, LI Tie-chun, HOU Dong-yanΔ

(College of Chemistry and Life Science, Anshan Normal University, Anshan 114007, China)

ObjectiveTo establish the method of determination for rhein, emodin, chrysophanol and physcion in Niuhuang Qinghuo Pills. MethodsSample was hydrolyzed by 20% H2SO4, and anthraquinones were extracted by soxhlet extraction with acetone as solvent, and were determined by HPLC with Kromasil C18as column, methanol-0.5%H3PO4(75:25,V/V)as mobile phase at the flow of 1.0 mL/min, 230 nm as the detection wavelength. ResultsThe linear relationship of rhein, emodin, chrysophanol and physcion were 1.50-150, 0.950-95.0, 1.30-130 and 1.15-115 mg/L. The anthraquinones were seperated completely, the recovery of 4 anthraquinones were 98.14%-101.3%. ConclusionThis method is simple, accurate, steady, and could be used for the quality control of Niuhuang Qinghuo Pills.

Niuhuang Qinghuo Pills; anthraquinones; HPLC

刁全平，男，碩士，副教授，研究方向：天然產(chǎn)物及藥物分析，E-mail：qpdiao@163.com；侯冬巖，通信作者，男，碩士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物有效成分分析，E-mail：houdyas@163.com。

R 917

A

1005-1678(2015)12-0177-03