胸腺肽對哮喘大鼠的調(diào)節(jié)及機(jī)制的研究

閆超，許珂玉

(遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

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胸腺肽對哮喘大鼠的調(diào)節(jié)及機(jī)制的研究

閆超，許珂玉Δ

(遼寧醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

目的 觀察胸腺肽對哮喘大鼠Th1/Th2的調(diào)節(jié)作用，研究胸腺肽對T-bet和GATA-3表達(dá)的影響。方法 將60只SPF級6～8周齡的雄性大鼠分為正常組、哮喘組、地塞米松組(0.5 mg/kg)、胸腺肽高劑量組(5 mg/kg)、胸腺肽中劑量組(2.5 mg/kg)、胸腺肽低劑量組(1.25 mg/kg)。用卵清蛋白致敏法建立大鼠哮喘模型。正常組及哮喘組腹腔注射生理鹽水，其他組注射相應(yīng)藥物。用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測各組大鼠血清中IL-4、IFN-γ的含量。免疫組化法檢測各組的肺組織中GATA-3和T-bet因子蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 哮喘組血清中IL-4含量比其他組濃度均高(P<0.05)，哮喘組血清中IFN-γ含量比其他組濃度均低(P<0.05)。哮喘組GATA-3蛋白的表達(dá)比其他組濃度均高(P<0.05)。各組中T-bet的表達(dá)，哮喘組Fbet的表達(dá)比其他組濃度均低(P<0.05)。結(jié)論 胸腺肽通過上調(diào)T-bet和下調(diào)GATA-3實現(xiàn)上調(diào)IFN-γ和抑制IL-4的調(diào)節(jié)，對哮喘大鼠有治療作用。

支氣管哮喘；胸腺肽；GATA-3；T-bet

支氣管哮喘是一種以T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，以氣道炎癥、氣道可逆性阻塞和高反應(yīng)性為主要病理特征，由一系列炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子參與的變態(tài)反應(yīng)性慢性疾病[1]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Th1/Th2細(xì)胞在數(shù)量和功能方面失衡，將會導(dǎo)致哮喘疾病的發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)GATA-3和T-bet作為Th0的上游直接轉(zhuǎn)錄因子，參與并調(diào)控著它向Th1和Th2的分化[2]。含有轉(zhuǎn)錄因子特征的GATA-3，只表達(dá)在Th2細(xì)胞中，促進(jìn)Th2細(xì)胞因子的表達(dá)。GATA-3含有鋅指結(jié)構(gòu)域，對Th0細(xì)胞分化成Th2細(xì)胞具有促進(jìn)作用，并且對Th0細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞具有抑制作用。含有Th1細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子特征的T- bet蛋白，只在Th1細(xì)胞中表達(dá)，對Th0細(xì)胞分化成Th1細(xì)胞具有促進(jìn)作用，對GATA-3基因表達(dá)具有抑制作用，所以也對Th2因子的合成具有抑制的作用[3]。所以在Th1/Th2免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中，GATA-3和T-bet處于核心地位。胸腺分泌的多肽混合物胸腺肽，具有生物活性，并且具有調(diào)節(jié)和增強(qiáng)人體免疫的作用[4]。胸腺肽能夠調(diào)節(jié)和控制T淋巴細(xì)胞的分化、成熟及其功能的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡[5]。臨床上使用胸腺肽治療哮喘已有較顯著的療效，但是具體的治療機(jī)制尚不明確[6]。據(jù)此，本研究以卵清蛋白致敏大鼠建立哮喘模型，以探討胸腺肽治療哮喘的分子機(jī)制，為胸腺肽治療哮喘的機(jī)制提供實驗性的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物:60只6-8周齡SPF級健康雄性大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗動物中心SPF級實驗室，飼養(yǎng)溫度25 ℃，相對濕度70%，晝夜照明12 h/12 h。

1.1.2 主要試劑及儀器:雞卵白蛋白購自美國Sigma公司，滅活百日咳桿菌菌苗，α-SMA免疫組化試劑盒購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，地塞米松注射液購自上海通用藥業(yè)股份有限公司，兔抗大鼠T-bet單克隆抗體，兔抗大鼠GATA-3單克隆抗體，辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG購自SantaCruz，ELISA試劑盒購自深圳晶美生物工程進(jìn)口分裝產(chǎn)品，霧化器購自北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司，呼吸流量換能器購自北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 哮喘大鼠模型的建立:按照隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠分為6組，每組10只。即：A組：正常組，B組：哮喘組，C組：地塞米松治療組，D組：胸腺肽低劑量治療組，E組：胸腺肽中劑量治療組，F(xiàn)組：胸腺肽高劑量治療組。適應(yīng)性飼養(yǎng)于遼寧醫(yī)學(xué)院實驗中心1周后，B、C、D、E、F組大鼠在第一天和第八天每只腹腔注射1 mL抗原液(含卵蛋白100 mg，滅活百日咳桿菌5×109個和氫氧化鋁100 mg)致敏，兩周后給予大鼠每天霧化吸入5%卵蛋白持續(xù)30分鐘，連續(xù)14天；B組在每次霧化吸入前半小時給予每只大鼠腹腔注射生理鹽水1 mL；C組在每次霧化吸入前半小時予每只大鼠腹腔注射0.5 mg/kg地塞米松；D組在每次霧化吸入前半小時給予每只大鼠腹腔注射1.25 mg/kg胸腺肽；E組在每次霧化吸入前半小時給予每只大鼠腹腔注射2.5 mg/kg胸腺肽；F組在每次霧化吸入前半小時給予每只大鼠腹腔注射5 mg/kg胸腺肽。A組為正常對照組，用生理鹽水代替卵蛋白致敏和激發(fā)大鼠。

1.2.2 肺通氣功能:末次給藥24 h后進(jìn)行指標(biāo)測定，測定各組大鼠的潮氣量、呼吸頻率，計算每分鐘通氣量。

1.2.3 ELISA測量IL-4、IFN-γ的表達(dá):末次給藥24 h后取大鼠外周血2～4 mL，離心后取血清然后按照ELISA試劑盒的步驟操作，等密封裝平衡至室溫，從中取出所需的板條，其余密封放回4 ℃。加樣：分別將100 μL不同濃度的待測液加入相應(yīng)孔中，然后用封板膜封住反應(yīng)孔，空白孔除外。溫育：37 ℃共同溫育30分鐘，洗板4次。，然后除空白孔外，每孔加入100 μL檢測劑工作液。封住板孔，室溫(20～25 ℃)孵育60分鐘后洗板4次。顯色：每孔加入一滴顯色劑A和一滴顯色劑B，室溫避光顯色20分鐘。終止：每孔加入一滴終止液混勻。測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長測量OD450值，測定應(yīng)在加終止液后10分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

1.2.4 免疫組化法測量肺組織中GATA-3和T-bet的表達(dá):石蠟組織切片常規(guī)脫蠟至水，按順序浸入100%二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ中各10 min，無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、蒸餾水中各1次，每次5 min；滅活內(nèi)源性過氧化酶：用新配置的3%H2O2，室溫孵育15 min，然后雙蒸水水洗3次，每次5 min；抗原修復(fù)：采用高壓修復(fù)抗原方法，待修復(fù)液中的切片自然冷卻至室溫后，PBS洗3次，每次5 min；封閉：用10%的正常山羊血清封閉，室溫孵育30 min；抗原抗體反應(yīng)：滴加適當(dāng)比例的一抗，4 ℃濕盒內(nèi)孵育20 h，然后滴加二抗，37 ℃條件下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉菌卵白素工作液，37 ℃條件下孵育30 min，PBS洗3次，每次5 min；DAB顯色，梯度酒精、二甲苯脫水并透明，然后中性樹膠封片，最后顯微鏡觀察并拍照。使用醫(yī)學(xué)圖像分析管理系統(tǒng)進(jìn)行免疫組化的半定量，最后計算求得染色指數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 卵清蛋白激發(fā)后各組大鼠的體征 出現(xiàn)動作煩躁不安、直立呼吸且呼吸比較急促，連續(xù)激發(fā)后體重減輕，經(jīng)胸腺肽和地塞米松治療后上述癥狀明顯減輕。

2.2 肺通氣功能指標(biāo) 哮喘模型組潮氣量和肺通氣量低于正常對照組，呼吸頻率高于正常對照組，差異顯著(P<0.05)，說明造模成功。哮喘組呼吸頻率均高于胸腺肽各劑量組和地塞米松組(P<0.05)。哮喘組潮氣量低于胸腺肽高、中劑量組和地塞米松組(P<0.05)，并且胸腺肽高劑量組和地塞米松組潮氣量較高。胸腺肽高、中劑量組和地塞米松組肺每分鐘通氣量與正常組接近，并且高于哮喘模型組(P<0.05)，見表1。

表1 各組大鼠的肺通氣功能比較±s)Tab.1 Comparison of pulmonary ventilation function in rats of each ±s)

*P<0.05，與正常組比較，compared with the normal group；#P<0.05，與哮喘組比較，compared with asthma group，ΔP<0.05，與地塞米松組比較，compared with dexamethasone group

2.3 血清中IL-4和IFN-γ的含量 哮喘組外周血血清中IL-4的濃度明顯高于正常對照組、地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組，差異顯著(P<0.05)。正常對照組、地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。哮喘組外周血血清中IFN-γ的濃度明顯低于正常對照組、地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組，差異顯著(P<0.05)。正常對照組、地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組之間相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組大鼠血清IFN-γ、IL-4的濃度

*P<0.05，與正常組比較，compared with the normal group；#P<0.05，與哮喘組比較，compared with asthma group，ΔP<0.05，與地塞米松組比較，compared with dexamethasone group

2.4 肺組織中GATA-3和T-bet的表達(dá) 免疫組化染色結(jié)果可以看出陽性結(jié)果為棕色顆粒，陰性結(jié)果為藍(lán)色顆粒。哮喘組與對照組比較GATA-3的表達(dá)明顯增高，被染成一周的棕色顆粒，經(jīng)胸腺肽和地塞米松治療后治療后陽性顆粒明顯減少，說明GATA-3的表達(dá)降低。哮喘組T-bet的表達(dá)明顯低于對照組，經(jīng)胸腺肽和地塞米松治療后治療后均能明顯上調(diào)T-bet的表達(dá)，陽性顆粒明顯增多(見圖1、3)。半定量法統(tǒng)計目標(biāo)蛋白的表達(dá)量(染色指數(shù))見圖2和圖4。哮喘組和胸腺肽低劑量組GATA-3表達(dá)水平明顯高于正常組(P<0.05)，地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組明顯低于哮喘組(P<0.05)。各組T-bet表達(dá)水平，哮喘組和胸腺肽低劑量組明顯低于正常組(P<0.05)，地塞米松組和胸腺肽高、中劑量組明顯高于哮喘組(P<0.05)。

圖1 各組大鼠肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)情況Fig.1 Expression of GATA-3 protein in lung tissue of rats in each group

圖2 各組大鼠肺組織中GATA-3蛋白表達(dá)量比較±s)Fig.2 Tab.2 Comparison of IL-4, IFN-γ in rats of each group

圖3 各組大鼠肺組織中T-bet蛋白表達(dá)情況Fig.3 Expression of T-bet protein in lung tissue of rats in each group

圖4 各組大鼠肺組織中T-bet蛋白表達(dá)量比較(n=10)Fig.4 Expression of T-bet protein in lung tissue of rats in each group(n=10)

3 討論

哮喘屬于Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病，在特定的細(xì)胞因子環(huán)境下，變態(tài)原經(jīng)相應(yīng)遞呈細(xì)胞呈給CD4+細(xì)胞，CD4+細(xì)胞向Th2細(xì)胞過度增殖，而在哮喘炎癥發(fā)生發(fā)展的過程中起著關(guān)鍵作用的是過量活化的Th2細(xì)胞[7]。當(dāng)Th2細(xì)胞大量增殖，Th1/Th2就會失衡，而哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是Th1/Th2失衡，并且這個比例貫穿于哮喘的各個階段[8]。因此，藥物干預(yù)治療的首選靶點是調(diào)節(jié)Th1/Th2平衡，對治療哮喘具有重要意義[9]。IFN-γ是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，對哮喘具有保護(hù)作用[10]。IL-4是Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，對哮喘具有傷害作用[11]。IFN-γ/IL-4比例變化可以反映Th1/Th2比例變化，生理狀態(tài)下二者互相制約達(dá)到動態(tài)平衡，但是一旦平衡被打破將會導(dǎo)致疾病的發(fā)生[12]。本實驗研究結(jié)果表明胸腺肽治療組與哮喘組比較明顯改善(P<0.05)，ELISA結(jié)果顯示胸腺肽能夠調(diào)節(jié)血清IL-4與IFN-γ的比例，具有調(diào)節(jié)Th1/Th2失衡的作用。

體內(nèi)外大量實驗研究表明GATA-3和T-bet是控制Th1和Th2分化的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，在Th1/Th2的轉(zhuǎn)換中起著調(diào)節(jié)作用[13]。免疫組化結(jié)果顯示，胸腺肽能胸腺肽在抑制GATA-3的表達(dá)，上調(diào)T-bet的表達(dá)。

胸腺肽能夠調(diào)節(jié)和控制T淋巴細(xì)胞的分化、成熟及其功能的表達(dá)，調(diào)節(jié)Thl/Th2平衡[14]。糖皮質(zhì)激素被公認(rèn)為最有效的消除氣道炎癥的藥物，但糖皮質(zhì)激素多用于哮喘的終末階段、慢性氣道炎癥，且其全身用藥副作用較大，即使是吸入激素長期使用后，亦可產(chǎn)生對下丘腦—垂體—腎上腺軸的抑制作用，并可以抑制生長激素的分泌，影響兒童的生長發(fā)育[15]。近年來，隨著對哮喘發(fā)病機(jī)制和病理生理認(rèn)識的不斷深入，治療的目標(biāo)亦更趨于哮喘發(fā)病的起始階段。本實驗試圖探討胸腺肽治療機(jī)制，通過實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胸腺肽治療的哮喘，GATA-3和IL-4的表達(dá)降低(P<0.05)，而T-bet和IFN-γ的表達(dá)增加(P<0.05)。

綜上所述，胸腺肽對Th1/Th2失衡的調(diào)節(jié)作用可能通過抑制GATA-3表達(dá)的同時，進(jìn)一步抑制IL-4的表達(dá)，通過上調(diào) T-bet的表達(dá)，促進(jìn)IFN-γ的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)Th0向Th1分化，因此對Th1/Th2失衡具有調(diào)節(jié)作用。

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(編校：譚玲)

Research of thymosin on adjustment and mechanism in asthmatic mouse

YAN Chao, XU Ke-yuΔ

(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Liaoning Medical University, Jinzhou 121000, China)

ObjectiveTo explore the regulation role and expression level of thymosin for Th1/Th2 and T-bet ,GATA-3 in asthma model rats respectively.Methods60 SPF grade male rats (6-8w) were randomly divided into six groups：control group, asthma model group, dexamethasone (0.5 mg/kg) group, thymosin high dose group (5 mg/kg), thymosin middle dose group(2.5 mg/kg), thymosin low dose group (1.25 mg/kg). The asthma model was constructed with ovalbumin. The rat in the control group and asthma model group were injected with normal saline by intraperitoneal, while other rats were injected with corresponding drugs.Then the concentration of IL-4 and IFN-γ in the serum of rats were tested by the method of enzyme linked immunosorbent assay(ELISA) and the protein expression level of GATA-3 and T-bet factor in the lung tissue were tested by immunohistochemistry in each group.ResultsThe concentration of IL-4 in the serum was higher and IFN-γ was lower in the asthma model group than the other groups, while the protein expression level of GATA-3 was higher and T-bet was lower in the asthma model group than the other groups(allP<0.05).ConclusionThymosin upregulation of IFN-γ and inhibition of IL-4 may be achieved by upregulating T-bet and downregulating GATA-3, and thymosin has therapeutic effect on asthma rats.

bronchial asthma; thymosin; GATA-3; T-bet

遼寧省教育廳基金資助項目(2009A469)

閆超，女，碩士在讀，研究方向：天然藥物與腫瘤治療，E-mail：836842135@qq.com；許珂玉，通信作者，女，博士，教授，研究方向：天然藥物與腫瘤治療，E-mail：1194003345@qq.com。

R562.25

A

1005-1678(2015)12-0032-04